專利名稱：HMG－CoA還原酶抑制劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與抑制羥甲基戊二酸單酰CoA(HMG-CoA)還原酶，具有降低血清膽固醇作用的化合物的制備有關的DNA，及用該DNA制備該化合物的方法。
已經(jīng)有幾篇關于通過微生物，從通式(V-a)(式中，R1同前)表示的化合物(以下叫做化合物(V-a))， 或通式(V-b)表示的化合物(V-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(V-b))， 生成化合物(VI-a)或化合物(VI-b)的方法的報道。
也就是，(特開昭57-50894)中敘述了應用絲狀菌的方法，(特開平7-184670)(WO96/40863)中敘述了應用放線菌的方法，另外(特許第2672551號)中敘述了應用基因重組放線菌的方法。但是，眾所周知由于絲狀菌和放線菌通過伸長菌絲而進行生長，在發(fā)酵罐中增殖時，將導致培養(yǎng)液的粘度增加。
因此，培養(yǎng)液中的氧容易不足，因培養(yǎng)液變得不均一而容易導致反應效率降低。為了消除這種氧不足，保持培養(yǎng)液的均一，必須提高發(fā)酵罐的攪拌速度，但增加攪拌速度容易絞斷菌絲，使微生物的活性降低(發(fā)酵工學的基礎，p169-190，P.F.Stansbury，A.Whitaker著，學會出版中心，(1998))。
本發(fā)明的目的是提供編碼新型羥化酶的DNA，及抑制羥甲基戊二酸單酰CoA(HMG-CoA)還原酶，并具有降低血清膽固醇作用的化合物在工業(yè)上有利的制備方法。
本發(fā)明者們考慮到，如果能夠應用不形成菌絲的微生物，進行化合物(I-a)或化合物(I-b)的羥化，就能回避因菌絲形成造成的培養(yǎng)液不均一，及由此導致的反應效率降低等負面影響，所以在工業(yè)上是有利的。于是進行了深入研究，完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及以下(1)-(39)。
以下通式中，只要沒有特殊說明，R1表示氫原子、取代或未取代的烷基或堿金屬，R2表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基。
(1)芽孢桿菌(Bacillus)屬微生物來源的蛋白質(zhì)，且具有這樣的活性從通式(I-a)表示的化合物(以下叫做化合物(I-a))， 或通式(I-b)表示的化合物(I-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(I-b))， 生成通式(II-a)表示的化合物(以下叫做化合物(II-a))， 或通式(II-b)表示的化合物(II-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(II-b))。 (2)芽孢桿菌屬微生物來源的蛋白質(zhì)，且具有這樣的活性從通式(III-a)表示的化合物(以下叫做化合物(III-a))， 或通式(III-b)表示的化合物(III-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(III-b))， 生成通式(IV-a)表示的化合物(以下叫做化合物(IV-a))， 或通式(IV-b)表示的化合物(IV-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(IV-b))。 (3)芽孢桿菌屬微生物來源的蛋白質(zhì)，且具有這樣的活性從通式(V-a)表示的化合物(以下叫做化合物(V-a))， 或通式(V-b)表示的化合物(V-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(V-b))， 生成通式(VI-a)表示的化合物(以下叫做化合物(VI-a))， 或通式(VI-b)表示的化合物(VI-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(VI-b))。 (4)芽孢桿菌屬微生物來源的蛋白質(zhì)，且具有這樣的活性從通式(VII-a)表示的化合物(以下叫做化合物(VII-a))， 或通式(VII-b)表示的化合物(VII-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(VII-b))， 生成通式(VIII-a)表示的化合物(以下叫做化合物(VIII-a))， 或通式(VIII-b)表示的化合物(VIII-a)的內(nèi)酯體(以下叫做化合物(VIII-b))。 (5)上述(1)-(4)中任一項所述的蛋白質(zhì)，其中芽孢桿菌屬的微生物選自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、側(cè)孢芽孢桿菌(B.laterosporus)、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、栗褐芽孢桿菌(B.badius)、短芽孢桿菌(B.brevis)、蜂房芽孢桿菌(B.alvei)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)和浸麻芽孢桿菌(B.macerans)。
(6)上述(1)-(5)中任一項所述的蛋白質(zhì)，其中芽孢桿菌屬的微生物選自枯草芽孢桿菌ATCC6051株、巨大芽孢桿菌ATCC10778株、巨大芽孢桿菌ATCC11562株、巨大芽孢桿菌ATCC13402株、巨大芽孢桿菌ATCC15177株、巨大芽孢桿菌ATCC15450株、巨大芽孢桿菌ATCC19213株、巨大芽孢桿菌IAM1032株、側(cè)孢芽孢桿菌ATCC 4517株、短小芽孢桿菌FERM BP-2064株、栗褐芽孢桿菌ATCC14574株、短芽孢桿菌NRRL B-8029株、蜂房芽孢桿菌ATCC6344株、環(huán)狀芽孢桿菌NTCT-2610株及浸麻芽孢桿菌NCIMB-9368株。
(7)上述(1)-(5)中任一項所述的蛋白質(zhì)，其中芽孢桿菌屬的微生物選自芽孢桿菌屬FERM BP-6029株和芽孢桿菌屬FERM BP-6030株。
(8)蛋白質(zhì)，具有序列號1記載的氨基酸序列。
(9)蛋白質(zhì)，具有序列號1記載的氨基酸序列中1個以上的氨基酸發(fā)生缺失、置換或添加了的氨基酸序列，且具有從化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)的活性。
(10)上述(9)的蛋白質(zhì)，具有序列號42或45記載的氨基酸序列。
(11)上述(9)的蛋白質(zhì)，其中化合物(I-a)是化合物(III-a)，化合物(I-b)是化合物(III-b)，化合物(II-a)是化合物(IV-a)，化合物(II-b)是化合物(IV-b)。
(12)上述(9)的蛋白質(zhì)，其中化合物(I-a)是化合物(V-a)，化合物(I-b)是化合物(V-b)，化合物(II-a)是化合物(VI-a)，化合物(II-b)是化合物(VI-b)。
(13)上述(9)的蛋白質(zhì)，其中化合物(I-a)是化合物(VII-a)，化合物(I-b)是化合物(VII-b)，化合物(II-a)是化合物(VIII-a)，化合物(II-b)是化合物(VIII-b)。
(14)分離純化得到的DNA，具有序列號2記載的堿基序列。
(15)分離純化得到的DNA，能與上述(14)的DNA在嚴格條件下進行雜交，且能編碼具有從化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)活性的蛋白質(zhì)。
(16)上述(15)的DNA，具有的堿基序列選自由序列號41、43及44記載的堿基序列構(gòu)成的組。
(17)分離純化得到的DNA，編碼上述(1)-(12)中任一項記載的蛋白質(zhì)。
(18)上述(15)的DNA，其中化合物(I-a)是化合物(III-a)，化合物(I-b)是化合物(III-b)，化合物(II-a)是化合物(IV-a)，化合物(II-b)是化合物(IV-b)。
(19)上述(15)的DNA，其中化合物(I-a)是化合物(V-a)，化合物(I-b)是化合物(V-b)，化合物(II-a)是化合物(VI-a)，化合物(II-b)是化合物(VI-b)。
(20)上述(15)的DNA，其中化合物(I-a)是化合物(VII-a)，化合物(I-b)是化合物(VII-b)，化合物(II-a)是化合物(VIII-a)，化合物(II-b)是化合物(VIII-b)。
(21)重組DNA載體，它包含上述(14)-(20)中任一項記載的DNA。
(22)將上述(21)的重組DNA載體導入宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
(23)上述(22)的轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體屬于選自埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物。
(24)上述(22)或(23)的轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體屬于選自大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)、美棒桿菌(Corynebacterium callunae)和淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)的微生物。
(25)化合物(II-a)或化合物(II-b)的制備方法，其特征在于，用上述(22)-(24)中任一項所述的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(I-a)或化合物(I-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(II-a)或化合物(II-b)在水性介質(zhì)中生成、蓄積，然后從該水性介質(zhì)中提取化合物(II-a)或化合物(II-b)。
(26)化合物(IV-a)或化合物(IV-b)的制備方法，其特征在于，用上述(22)-(24)中任一項所述的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(III-a)或化合物(III-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(IV-a)或化合物(IV-b)在水性介質(zhì)中生成、蓄積，然后從該水性介質(zhì)中提取化合物(IV-a)或化合物(IV-b)。
(27)化合物(VI-a)或化合物(VI-b)的制備方法，其特征在于，用上述(22)-(24)中任一項所述的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(V-a)或化合物(V-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(VI-a)或化合物(VI-b)在水性介質(zhì)中生成、蓄積，然后從該水性介質(zhì)中提取化合物(VI-a)或化合物(VI-b)。
(28)化合物(VIII-a)或化合物(VIII-b)的制備方法，其特征在于，用上述(22)-(24)中任一項所述的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(VII-a)或化合物(VII-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(VIII-a)或化合物(VIII-b)在水性介質(zhì)中生成、蓄積，然后從該水性介質(zhì)中提取化合物(VIII-a)或化合物(VIII-b)。
(29)上述(25)的制備方法，其中化合物(II-b)是由化合物(II-a)形成內(nèi)酯而得到的化合物(II-b)。
(30)上述(25)的制備方法，其中化合物(II-a)是使化合物(II-b)的內(nèi)酯開環(huán)而得到的化合物(II-a)。
(31)上述(26)的制備方法，其中化合物(IV-b)是由化合物(IV-a)形成內(nèi)酯而得到的化合物(IV-b)。
(32)上述(26)的制備方法，其中化合物(IV-a)是使化合物(IV-b)的內(nèi)酯開環(huán)而得到的化合物(IV-a)。
(33)上述(27)的制備方法，其中化合物(VI-b)是由化合物(VI-a)形成內(nèi)酯而得到的化合物(VI-b)。
(34)上述(27)的制備方法，其中化合物(VI-a)是使化合物(VI-b)的內(nèi)酯開環(huán)而得到的化合物(VI-a)。
(35)上述(28)的制備方法，其中化合物(VIII-b)是由化合物(VIII-a)形成內(nèi)酯而得到的化合物(VIII-b)。
(36)上述(28)的制備方法，其中化合物(VIII-a)是使化合物(VIII-b)的內(nèi)酯開環(huán)而得到的化合物(VIII-a)。
(37)上述(25)-(28)中任一項所述的制造方法，其中轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物的處理物是選自培養(yǎng)菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的酶處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機械磨碎物、該菌體的溶劑處理物等菌體處理物，菌體的蛋白級分物，菌體及菌體處理物的固定化物的處理物。
(38)該蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述(22)-(24)中任一項所述的轉(zhuǎn)化體，讓上述(1)-(12)中任一項所述的蛋白質(zhì)在培養(yǎng)物中生成、蓄積，然后從該培養(yǎng)物中提取該蛋白質(zhì)。
(39)相當于選自由序列號2、41、43及44記載的堿基序列構(gòu)成的組的堿基序列中連續(xù)5-60個堿基構(gòu)成的序列的寡核苷酸或相當于與該寡核苷酸互補的序列的寡核苷酸。
以下，對本發(fā)明進行詳細說明。I.yjiB基因的獲得可以利用已經(jīng)確定的枯草桿菌染色體堿基序列的信息(http//www.pasteur.fr/Bio/SubtiList.html)以及由該堿基序列所推測出的枯草桿菌yjiB基因的信息，用PCR法(Science，230，1350(1985))克隆，獲得本發(fā)明的DNA。
具體地，可以通過以下方法來獲得。
將枯草桿菌，如枯草芽孢桿菌ATCC15563株在適于枯草桿菌的培養(yǎng)基中按常規(guī)方法進行培養(yǎng)，如應用LB液體培養(yǎng)基(1升水中含細菌用胰化蛋白胨(Difco公司制)10g，酵母提取物(Difco公司制)5g，NaCl5g，并調(diào)至pH 7.2的培養(yǎng)基)。培養(yǎng)后，通過離心從培養(yǎng)物中收集菌體。
按眾知的方法(例如，《分子克隆》第二版)，從所得菌體中分離純化染色體DNA。
利用序列號2記載的堿基序列信息，用DNA合成儀合成正向引物和反向引物，引物中包含與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域相對應的堿基序列。
通過PCR方法擴增后，為了能將該擴增的DNA片段導入質(zhì)粒，優(yōu)選在正向引物和反向引物5′末端添加適當?shù)南拗泼盖形稽c，如BamHI、EcoR I等的限制酶切位點。
作為正向引物和反向引物的組合，如具有序列號13和14組合的堿基序列的DNA等。
以染色體DNA作模板，應用這些引物、TaKaRa LA-PCR TM KitVer.2(寶酒造社制)或Expand TM High-Fidelity PCR System(ベ-リンガ-·マンハィム公司制)，用DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer日本公司制)進行PCR。
進行PCR時可應用如下的方法。即，當上述引物為2kb以下的DNA片段時，以94℃30秒、55℃30秒-1分鐘、72℃2分鐘構(gòu)成的反應程序作為1個循環(huán)。當上述引物為超過2kb的DNA片段時，以98℃20秒、68℃3分鐘構(gòu)成的反應程序作為1個循環(huán)。每種情況均進行30個循環(huán)后，72℃反應7分鐘。
在與上述引物賦予的限制酶切位點相同的位點，對擴增的DNA片段進行酶切后，通過瓊脂糖電泳、蔗糖密度梯度超速離心等手段分離、回收該DNA片段。
用該回收的DNA片段，應用《分子克隆》第二版、CurrentProtocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，John Wileyand Sons(1987-1997)(以下略作Current Protocols in MolecularBiology Supplement)或DNA Cloning 1Core Techniques，APractical Approach，Second Edition，Oxford University Press(1995)等記載的方法，或應用市售的試劑盒，如SuperScriptPlasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(LifeTechnologies公司制)和ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene公司制)制作克隆載體，用制備的克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，如大腸桿菌DH5α株(可從東洋紡購入)。
用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的克隆載體，只要能在大腸桿菌K12株中進行自主復制，噬菌體載體、質(zhì)粒載體均可以應用，也可應用大腸桿菌的表達載體作為克隆載體。具體而言，可應用ZAP Express(Stratagene公司制，Strategies，5，58(1992))、pBluescript II SK(+)(Nucleic Acids Research，17，9494(1989))、Lamda ZAP II(Stratagene公司制)、λgt10、λgt11(DNA Cloning，A PracticalApproach，1，49(1985))、λTriplEx(Clontech公司制)、λExCell(Pharmacia公司制)、pT7T318U(Pharmacia公司制)、pcD2(H.0kayama and P.Berg；Mol.Cell.Biol.，3，280(1983))、pMW218(和光純藥社制)、pUC118、pSTV28(寶酒造社制)、pEG400(J.Bac.，172，2392(1990))、pHMV1520(MoBiTec公司制)、pQE-30(QIAGEN公司制)等。
應用常規(guī)方法，如《分子克隆》第二版、Current Protocols inMolecular Biology Supplement，DNA Cloning 1Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，0xford University Press(1995)等記載的方法，可從所得轉(zhuǎn)化體中獲得含有目的DNA的質(zhì)粒。
通過該方法可獲得含有編碼催化由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)反應的蛋白質(zhì)的DNA的質(zhì)粒。
作為該質(zhì)粒，如后述的pSyjiB。
除上述方法之外，通過用適當?shù)妮d體，以大腸桿菌作宿主，制作枯草桿菌的染色體文庫，對該文庫的各株，通過檢測由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)的活性的方法，也可以從該文庫中獲得含有編碼催化由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)反應的蛋白質(zhì)的DNA的質(zhì)粒。
利用上述得到的基因的堿基序列等，通過與上述同樣的方法，可從其它原核生物或植物中獲得該DNA的同源物。
應用由上述方法得到的本發(fā)明DNA及DNA片段，通過常規(guī)方法可制備出具有本發(fā)明DNA的一部分序列的反義寡核苷酸、有義寡核苷酸等寡核苷酸，或含有RNA的寡核苷酸。另外，以上面得到的DNA序列信息為基礎，應用上述DNA合成儀，也可合成這些寡核苷酸。
作為該寡核苷酸，例如具有與上述DNA具有的堿基序列中連續(xù)5-60個堿基相同序列的DNA或具有該DNA互補序列的DNA。另外，具有這些DNA互補序列的RNA也是本發(fā)明的寡核苷酸。
作為該寡核苷酸，例如具有與序列號2、41、43或44表示的堿基序列中連續(xù)的5-60個堿基相同序列的DNA或具有該DNA互補序列的DNA。作為正向引物和反向引物使用時，優(yōu)選二者的解鏈溫度(Tm)及堿基數(shù)沒有極端變化的上述寡核苷酸。具體而言，例如具有上述序列號3-39所示堿基序列的寡核苷酸。
再者，這些寡核苷酸的衍生物(以下，叫做寡核苷酸衍生物)也可用作本發(fā)明的寡核苷酸。
作為寡核苷酸衍生物，例如寡核苷酸中的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崃蝓ユI的寡核苷酸衍生物，寡核苷酸中的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)變?yōu)镹3′-P5′磷酰胺鍵的寡核苷酸衍生物，寡核苷酸中的核糖與磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)變?yōu)殡暮怂徭I的寡核苷酸衍生物，寡核苷酸中尿嘧啶置換為C-5丙炔基尿嘧啶的寡核苷酸衍生物，寡核苷酸中尿嘧啶置換為C-5噻唑尿嘧啶的寡核苷酸衍生物，寡核苷酸中胞嘧啶置換為C-5丙炔基胞嘧啶的寡核苷酸衍生物，寡核苷酸中胞嘧啶置換為吩噁嗪修飾的胞嘧啶(phenoxazine-modified cytosine)的寡核苷酸衍生物，寡核苷酸中的核糖置換成2′-O-丙基核糖的寡核苷酸衍生物或寡核苷酸中的核糖置換成2′-甲氧乙氧核糖的寡核苷酸衍生物等(細胞工學，16，1463(1997))。II催化由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)反應的蛋白質(zhì)的制備方法為了使如上述得到的DNA在宿主細胞中表達，首先，用限制酶類或DNA酶類將目的DNA片段酶切成包含該基因的適當長度的DNA片段后，插入到表達載體中的啟動子的下游，然后將該表達載體導入到適于表達該表達載體的宿主細胞中。
宿主細胞有細菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞等，能表達目的基因的均能使用。
表達載體可使用在上述宿主細胞中能自主復制、整合到染色體中，在能轉(zhuǎn)錄上述目的DNA的位置含有啟動子的載體。
用細菌等原核生物作宿主細胞時，用于表達上述DNA的表達載體，優(yōu)選在該細胞內(nèi)能進行自主復制的同時，由啟動子、核糖體結(jié)合序列、上述DNA及轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成的重組載體。也可包含啟動子的調(diào)控基因。
表達載體例如pBTrp2、pBTacl、pBTac2(均購自ベ-リンガ-マンハィム公司)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pQE-30(QIAGEN公司制)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200(Agricultural Biological Chemistry，48，669(1984))、pLSA1(Agric.Biol.Chem.，53，277(1989))、pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985))、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrS30(FERM BP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia公司制)、pET-3(Novagen公司制)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18(gene，33，103(1985))、pUC19(Gene，33，103(1985))、pSTV28(寶酒造社制)、pSTV29(寶酒造社制)、pUC118(寶酒造社制)、pPA1(特開昭63-233798)、pEG400(J.Bacteriol.，172，2392(1990))、pQE-30(QIAGEN公司制)、PHY300(寶酒造社制)、pHW1520(MoBiTec公司制)等。
啟動子只要可以在宿主細胞中表達，可使用任意一種啟動子。例如，trp啟動子(P trp)、lac啟動子(P lac)、PL啟動子、PR啟動子、PSE啟動子等來源于大腸桿菌和噬菌體的啟動子，SP01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。另外，也可應用將2個P trp串連在一起的啟動子(P trp×2)、tac啟動子、let I啟動子、lacT7啟動子等人為設計改變的啟動子等。還可使用能在芽孢桿菌屬細菌中表達的xylA啟動子和能在棒狀桿菌屬細菌中表達的P54-6啟動子等。
作為核糖體結(jié)合序列，只要能在宿主細胞中表達，可使用任意一種核糖體結(jié)合序列，但優(yōu)選使用將Shine-Dalgarno序列與起始密碼子間調(diào)整到適當距離(如6-18個堿基)的質(zhì)粒。
為了有效進行轉(zhuǎn)錄、翻譯，也可以表達催化由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)反應的蛋白質(zhì)的N末端或缺失其一部分的蛋白質(zhì)與表達載體編碼的蛋白質(zhì)的N末端部分融合的蛋白質(zhì)。這樣的例子如后述的pWyjiB。
轉(zhuǎn)錄終止序列對目的DNA的表達未必是必不可少的，但優(yōu)選在結(jié)構(gòu)基因的正下游設置轉(zhuǎn)錄終止序列。
原核生物例如屬于埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、微桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、脂環(huán)酸桿菌屬、魚腥藍細菌屬、組囊藍細菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮菌屬、著色菌屬、歐文氏菌屬、甲基桿菌屬、席藍細菌屬、紅細菌屬、紅假單胞菌屬、紅螺菌屬、鏈霉菌屬、聚球藍細菌屬、發(fā)酵單胞菌屬等的微生物，優(yōu)選屬于埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、脂環(huán)酸桿菌屬、魚腥藍細菌屬、組囊藍細菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮菌屬、著色菌屬、歐文氏菌屬、甲基桿菌屬、席藍細菌屬、紅細菌屬、紅假單胞菌屬、紅螺菌屬、鏈霉菌屬、聚球藍細菌屬、發(fā)酵單胞菌屬等的微生物。
作為該微生物的具體實例，如大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、枯草芽孢桿菌ATCC33712、巨大芽孢桿菌、芽孢桿菌屬FERM BP-6030、解淀粉芽孢桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌、immariophilum短桿菌(Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、解糖短桿菌ATCC14066、黃色短桿菌ATCC14067、谷氨酸棒桿菌ATCC13869、谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870，美棒桿菌ATCC15991，嗜氨微桿菌ATCC15354、無花果沙雷氏菌屬、居泉沙雷氏菌屬，液化沙雷氏菌屬，粘質(zhì)沙雷氏菌屬，假單胞菌屬D-0110、放射形土壤桿菌，發(fā)根土壤桿菌，懸鉤子土壤桿菌，柱孢魚腥藍細菌，桶形魚腥藍細菌，水華魚腥藍細菌、金黃節(jié)桿菌、檸檬節(jié)桿菌、球形節(jié)桿菌、烴谷氨酸節(jié)桿菌(Arthrobacterhydrocarboglutamicus)、邁索爾節(jié)桿菌、煙草節(jié)桿菌、石蠟節(jié)桿菌、原玻璃蠅節(jié)桿菌、玫瑰色石蠟節(jié)桿菌、硫磺節(jié)桿菌、產(chǎn)脲節(jié)桿菌、巴氏著色菌、微溫著色菌、酒色著色菌、沃氏著色菌、河流著色菌、噬夏孢歐文氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、菠蘿歐文氏菌、草生歐文氏菌、斑點歐文氏菌、土生歐文氏菌(Erwina terreus)、羅得西亞甲基桿菌、扭脫甲基桿菌、席藍細菌屬ATCC29409、莢膜紅細菌、類球紅細菌、生芽紅細菌、海紅菌、血色紅假單胞菌、深紅紅螺菌、需鹽紅螺菌、鹽場紅螺菌、產(chǎn)二素鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、金色鏈霉菌、殺真菌素鏈霉菌、灰產(chǎn)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、淺青紫鏈霉菌、橄欖灰鏈霉菌、枝鏈霉菌、田無鏈霉菌、酒紅鏈霉菌、運動發(fā)酵單胞菌。
作為導入重組載體的方法，只要是將DNA導入上述宿主細胞的方法，可用任何一種方法。例如，應用鈣離子的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972))、原生質(zhì)體法(特開昭63-248394)、電穿孔法或記載于Gene，17，107(1982)和Molecular and General Genetics，168，111(1979)中的方法。
應用酵母作宿主細胞時，表達載體例如，YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作為啟動子，只要能在酵母中表達即可，例如PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal 10啟動子、熱休克蛋白質(zhì)啟動子、MFα1啟動子、CUP1啟動子等啟動子。
作為酵母菌株例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽絲孢酵母(TrichosporonPullulans)、河岸許旺氏酵母(Schwanniomyces alluvius)等。
導入重組載體的方法，只要是將DNA導入酵母的方法，任何一種方法均可，例如電穿孔法(Methods.Enzymol.，194，182(1990))、原生質(zhì)球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978))、醋酸鋰法(J.Bacteriol.，153，163(1983)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978))記載的方法等。
應用動物細胞作宿主細胞時，表達載體如pcDNA I、pcDM8(購自フナコシ公司)、pAGE107(特開平3-22979；Cytotechnology，3，133(1990))、pAS3-3(特開平3-227075)、pCDM8(Nature，329，840(1987))、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103(J.Biochem.，101，1307(1987))、pAGE210等。
啟動子只要能在動物細胞中表達即可，例如可使用巨細胞病毒(人CMV)的IE(immediate early)基因的啟動子、SV40的早期啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子等。另外，可將人CMV的IE基因的增強子與啟動子一起使用。
作為動物細胞，例如Namalwa細胞、HBT5637(特開昭63-299)、COSl細胞、COS7細胞、CH0細胞等。
將重組載體導入動物細胞的方法，只要是能將DNA導入動物細胞的方法即可。例如電穿孔法(Cytotechnology，3，133(1990))，磷酸鈣法(特開平2-227075)，脂轉(zhuǎn)染法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)，Virology，52，456(1973))記載的方法等。轉(zhuǎn)化體的獲得及培養(yǎng)可按照特開平2-227075號公報或特開平2-257891號公報記載的方法進行。
應用昆蟲細胞作宿主時，可應用Baculovirus ExpressionVectors，A Laboratory Manunal、 Current Protocols in MolecularBi lolgy supplement 1-38(1987-1997)，Bio/Technology，6，47(1988)等記載的方法，表達蛋白質(zhì)。
即，將重組基因的導入載體和桿狀病毒共導入昆蟲細胞，在該昆蟲細胞培養(yǎng)上清液中得到重組病毒以后，再用重組病毒感染昆蟲細胞，并表達蛋白質(zhì)。
作為該方法中所使用的基因?qū)胼d體，如pVL1392，pVL1393，pBlueBacIII(均由Invitrogen公司制)等。
桿狀病毒可使用感染夜盜蛾科昆蟲的病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。
昆蟲細胞可使用草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞Sf9，Sf21(Baculovirus Expression Vectors，A LaboratoryManunal，W.H.Freeman and Company，New York，(1992))，粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) 的卵巢細胞High5(Invitrogen公司制)等。
為了制備重組病毒，作為上述重組基因的導入載體和桿狀病毒共導入昆蟲細胞的方法，例如磷酸鈣法(特開平2-227075)，脂轉(zhuǎn)染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987))等。
作為基因的表達方法，除直接表達以外，可按照《分子克隆》第二版中記載的方法，進行分泌生產(chǎn)、融合蛋白的表達等。
應用酵母、動物細胞或昆蟲細胞進行表達時，可得到添加了糖或糖鏈的蛋白質(zhì)。
通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上得到的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)物中生成、蓄積催化由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)反應的蛋白質(zhì)，并從該培養(yǎng)物中提取該蛋白質(zhì)，可制備出催化由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)反應的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，制備催化由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)反應的蛋白質(zhì)時所用的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法，可以使用培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體宿主時所采用的常規(guī)方法。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌等原核生物、酵母菌等真核生物時，培養(yǎng)這些微生物所用的培養(yǎng)基只要是含有該微生物可以利用的碳源、氮源、無機鹽類等，能有效地培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，無論天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基均可應用。
碳源只要是各種微生物可以利用的物質(zhì)即可，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，醋酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類。
作為氮源，可應用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機酸和有機酸的銨鹽，其它含氮的化合物，以及蛋白胨、肉汁、酵母提取物、玉米浸漬液、酪蛋白水解物、大豆粕及大豆粕水解物、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。
作為無機物，可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等有氧條件下進行。培養(yǎng)溫度為15-50℃，培養(yǎng)時間通常為16小時-7天。培養(yǎng)中pH保持在3.0-9.0?？捎脽o機或有機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等調(diào)整pH值。
另外，培養(yǎng)過程中必要時可向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素和四環(huán)素等抗生素。
用誘導性啟動子作為啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化得到的微生物在培養(yǎng)時，必要時也可以向培養(yǎng)基中加入誘導物。例如，培養(yǎng)用lac啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化得到的微生物時，可以向培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)；培養(yǎng)用trp啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化得到的微生物時，可以向培養(yǎng)基中加入吲哚丙烯酸(IAA)等；培養(yǎng)用xylA啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化得到的微生物時，可以向培養(yǎng)基中加入木糖。
培養(yǎng)以動物細胞作宿主細胞所得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基可以使用通常慣用的RPMT1640培養(yǎng)基(The Journal of the American MedicalAssociation，199，519(1967))，Eagle的MEM培養(yǎng)基(Science，122，501(1952))，DEME培養(yǎng)基(Virology，8，396(1959))，199培養(yǎng)基(Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950))或者向這些培養(yǎng)基中添加了胎牛血清的培養(yǎng)基等。
通常在pH6-8、30-40℃、5％CO2存在等條件下培養(yǎng)1-7天。
另外，在培養(yǎng)過程中必要時也可以向培養(yǎng)基中加入卡那霉素、青霉素等抗生素。
培養(yǎng)以昆蟲細胞作宿主細胞所得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基可以使用通常慣用的TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen公司制)、Sf-900IISFM培養(yǎng)基(GibcolBRL公司制)、ExCe11400、ExCe11405(均由JRHBiosciences公司制)、Grace′s Insect Medium(Grace，T.C.C.，Nature，195，788(1962))等。
通常在pH6-7、25-30℃等條件下培養(yǎng)1-5天。
另外，在培養(yǎng)過程中必要時也可以向培養(yǎng)基中加入慶大霉素等抗生素。
由本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物中分離純化催化由化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)反應的蛋白質(zhì)時，可以用通常的分離、純化方法。
例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)以溶解狀態(tài)表達時，培養(yǎng)終止后，通過離心回收細胞，懸浮到水性緩沖液中，然后用超聲破碎儀、弗氏壓碎機、Manton-Gaulin勻漿器、Dyno碾磨機等將細胞破碎，得到無細胞提取液。將該無細胞提取液離心獲得的上清液通過常規(guī)的酶分離、純化方法，可以得到純化標準品，即單獨或組合使用溶劑抽提法，硫酸銨鹽析法，脫鹽法，有機溶劑沉淀法，使用二乙氨基乙基(DEAE)-Sepharose、DIATON HPA-75(三菱化成社制)等樹脂的陰離子交換色譜法，使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等樹脂的陽離子交換色譜法，使用丁基-Sepharose、苯基-Sepharose等樹脂的疏水性色譜法，使用分子篩的凝膠過濾法，親和色譜法，聚焦色譜法，等電聚焦電泳等電泳法等方法。
另外，蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)以不溶解狀態(tài)表達時，同樣在回收細胞后將之破碎，通過離心，從沉淀部分用常規(guī)方法回收該蛋白質(zhì)。用蛋白質(zhì)變性劑使回收的蛋白質(zhì)不溶物可溶化。將該可溶化液用不合蛋白質(zhì)變性劑或蛋白質(zhì)變性劑的濃度達不到使蛋白質(zhì)變性的程度的稀溶液進行稀釋或進行透析，使蛋白質(zhì)形成正常的立體結(jié)構(gòu)后，用與上述同樣的分離純化方法得到純化標準品。
當本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其糖修飾體等衍生物分泌到細胞外時，可從培養(yǎng)上清液中回收該蛋白質(zhì)或其糖修飾體等的衍生物。即，用與上述同樣的離心等方法處理該培養(yǎng)物，獲得可溶性組分，用與上述同樣的分離純化方法從該可溶性組分獲得純化標準品。
如此所得的蛋白質(zhì)，例如具有序列號1、42或45所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。另外，通過上述方法表達的蛋白質(zhì)也可通過Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化學合成方法進行制備。另外，該蛋白質(zhì)也可用桑和貿(mào)易(美國Advanced chemTech公司制)、Perkin-Elmer日本公司(美國Perkin-Elmer公司制)、Pharmacia Biotech公司(瑞典Pharmacia Biotech公司制)、ァロカ(美國Protein Technology Instrument公司制)、クラボゥ(美國Synthecell-Vega公司制)、日本PerSeptive Limited(美國PerSeptive公司制)、島津制作所等的肽合成儀進行合成。III.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制備上述II中獲得的轉(zhuǎn)化體按上述II的方法培養(yǎng)而得的細胞、該細胞的培養(yǎng)物、該培養(yǎng)物的處理物、或從該細胞提取出的酶等作為酶源，使化合物(I-a)或化合物(I-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(II-a)或化合物(II-b)在該水性介質(zhì)中生成、蓄積，通過從該水性介質(zhì)中提取化合物(II-a)或化合物(II-b)就可制備出化合物(II-a)或化合物(II-b)。
細胞培養(yǎng)物的處理物例如該細胞的干燥物、該細胞的冷凍干燥物、該細胞的表面活性劑處理物、該細胞的酶處理物、該細胞的超聲波破碎物、該細胞的機械磨碎物、該細胞的溶劑處理物等細胞處理物，該細胞的蛋白級分物，該細胞及該細胞處理物的固定化物等。
從化合物(I-a)或化合物(I-b)向化合物(II-a)或化合物(II-b)的轉(zhuǎn)換方法可采用(a)(b)任一種方法，(a)向培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中預先添加化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法，(b)培養(yǎng)過程中添加化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法。另外，也可采用使培養(yǎng)細胞而得的酶源在水性介質(zhì)中作用于化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法。
向培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中添加化合物(I-a)或化合物(I-b)時，無論在培養(yǎng)開始還是培養(yǎng)過程中添加，添加化合物(I-a)或化合物(I-b)的量為每1ml培養(yǎng)基0.1-10mg，優(yōu)選0.2-1mg。優(yōu)選將化合物(I-a)或化合物(I-b)溶解到水或甲醇、乙醇等有機溶劑中后添加到培養(yǎng)基中。
采用使培養(yǎng)細胞而得的酶源在水性介質(zhì)中作用于化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法時，所用酶源的量根據(jù)該酶源的比活性而變化。例如，用細胞的培養(yǎng)物或細胞或者它們的處理物作為酶源時，每1mg化合物(I-a)或化合物(I-b)添加該酶源5-1000mg，優(yōu)選添加10-400mg。反應優(yōu)選在水性介質(zhì)中20-50℃進行，特別優(yōu)選在25-37℃進行。反應時間根據(jù)所用酶源的量及比活性等而變化，通常是2-150小時，優(yōu)選6-120小時。
水性介質(zhì)例如水、磷酸緩沖液、HEPES(N-2羥乙基哌嗪-N-乙磺酸)緩沖液、Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)鹽酸緩沖液等緩沖液。可向該緩沖液中添加有機溶劑，只要不阻礙反應即可。有機溶劑例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。有機溶劑和水性介質(zhì)的混合液，例如在應用化合物(I-b)時優(yōu)選應用。
將化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到水性介質(zhì)中時，將化合物(I-a)或化合物(I-b)溶解到可以溶解化合物(I-a)或化合物(I-b)的水性介質(zhì)中，然后添加到水性介質(zhì)中?？上蛉芙獾脑撍越橘|(zhì)中添加有機溶劑，只要不阻礙反應即可。有機溶劑例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。
應用后述例舉的內(nèi)酯體開環(huán)方法，可容易地由化合物(I-b)或化合物(II-b)分別轉(zhuǎn)換成化合物(I-a)或化合物(II-a)。另外，應用后述例舉的內(nèi)酯體生成方法，可容易地由化合物(I-a)或化合物(II-a)分別轉(zhuǎn)換成化合物(I-b)或化合物(II-b)。
內(nèi)酯體開環(huán)方法例如將化合物(I-b)或化合物(II-b)溶解到水性介質(zhì)中，添加酸或堿的方法。水性介質(zhì)如水、磷酸緩沖液、Tris緩沖液等含有不阻礙反應的鹽類的水溶液。該水溶液中可含有不阻礙反應的濃度的甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑。酸例如醋酸、鹽酸、硫酸等，堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨等。
內(nèi)酯體生成方法例如將化合物(I-a)或化合物(II-a)溶解到非水系溶劑中，添加酸或堿催化劑的方法。非水系溶劑只要是實質(zhì)上不含水的有機溶劑，能溶解化合物(I-a)或化合物(II-a)即可。非水系溶劑例如二氯甲烷、乙酸乙酯等。作為催化劑，只要能催化內(nèi)酯化反應，不對底物和反應產(chǎn)物產(chǎn)生內(nèi)酯化以外的作用即可采用任何一種催化劑。該催化劑例如三氟醋酸和對甲苯磺酸等。反應溫度無特別限制，但優(yōu)選0-100℃，特別優(yōu)選20-80℃。
從反應溶液提取化合物(II-a)或化合物(II-b)可以采用通常有機合成化學中采用的方法，例如用有機溶劑萃取、結(jié)晶、薄層色譜、高效液相色譜等。
本發(fā)明所得化合物(II-a)或化合物(II-b)的定性或定量方法只要是對化合物(II-a)和/或化合物(II-b)能進行定性或定量的方法，任一種方法均可。例如，13C-NMR譜、1H-NMR譜、質(zhì)譜、高效液相色譜(HPLC)等方法。
本發(fā)明的化合物(I-a)、化合物(I-b)、化合物(II-a)和化合物(II-b)中，可以存在光學異構(gòu)體等立體異構(gòu)體，本發(fā)明包含連同這些異構(gòu)體在內(nèi)的所有可能的異構(gòu)體及其混合物。
化合物(I-a)優(yōu)選化合物(III-a)、更優(yōu)選化合物(V-a)、特別優(yōu)選化合物(VII-a)。
化合物(I-b)優(yōu)選化合物(III-b)、更優(yōu)選化合物(V-b)、特別優(yōu)選化合物(VII-b)。
化合物(II-a)優(yōu)選化合物(IV-a)、更優(yōu)選化合物(VI-a)、特別優(yōu)選化合物(VIII-a)。
化合物(II-b)優(yōu)選化合物(IV-b)、更優(yōu)選化合物(VI-b)、特別優(yōu)選化合物(VIII-b)。
烷基為直鏈或支鏈狀的，碳數(shù)為1-10，優(yōu)選1-6的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、異己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、它們的各種支鏈異構(gòu)體等。
芳香基例如苯基、萘基等。
取代烷基的取代基相同或不同，例如1-3個鹵素、羥基、氨基、烷氧基、芳香基等。
取代芳香基的取代基相同或不同，例如1-3個鹵素、羥基、氨基、烷基、烷氧基等。
烷氧基中的烷基部分與上述的烷基同義。
堿金屬表示鋰、鈉、鉀、銣、銫、鈁等各元素。
以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
將化合物(VII-b)(Sigma公司制)100mg溶解到9.5ml甲醇中，加入1mol/l氫氧化鈉0.5ml，室溫振蕩1小時。將所得溶液干燥固化，加入5ml去離子水溶解，用1mol/l鹽酸約0.1ml調(diào)pH值到7左右，再加入去離子水4.9ml，得到終濃度為10mg/ml的化合物(VII-a)(式中R為鈉的化合物)10mL。
將枯草芽孢桿菌Marburg 168株(ATCC15563株)1接種環(huán)接種到10ml的LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)一晚。培養(yǎng)后，通過將所得培養(yǎng)液離心，得到菌體。
用常規(guī)方法從該菌體中分離、純化出染色體DNA。
用DNA合成儀合成具有序列號3和4、序列號5和6、序列號7和8、序列號9和10、序列號11和12、序列號13和14、序列號15和16的堿基序列組合的正向引物和反向引物。
以染色體DNA作模板，用這些引物和TaKaRa LA-PCR TM KitVer.2(寶酒造社制)，Expand TM High-Fidelity PCR System(ベ-リンガ-·マ ンィム公司制)或Taq DNA聚合酶(Boelinnger公司制)，用DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer日本公司制)進行PCR。
PCR在下述條件下進行2kb以下的DNA片段以94℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘構(gòu)成的反應程序為一個循環(huán)，超過2kb的DNA片段以98℃20秒、68℃3分鐘構(gòu)成的反應程序為一個循環(huán)，進行30個循環(huán)后，在72℃反應7分鐘。
分別用限制酶EcoR I和Sal I酶切用PCR擴增的DNA片段中，應用序列號3和4的引物組合擴增出的DNA片段(含bioI基因)，用限制酶Xbal和SmaI酶切應用序列號5和6的引物組合擴增出的DNA片段(含cypA基因)，用限制酶SmaI和SalI酶切應用序列號7和8的引物組合擴增出的DNA片段(含cypX基因)，用限制酶EcoRI和Sal I酶切應用序列號9和10的引物組合擴增出的DNA片段(含pksS基因)，用限制酶XbaI和Bgl II酶切應用序列號11和12的引物組合擴增出的DNA片段(含yet0基因)，用限制酶XbaI和SmaI酶切應用序列號13和14的引物組合擴增出的DNA片段(含yjiB基因)，用限制酶XbaI和SmaI酶切應用序列號15和16的引物組合擴增出的DNA片段(含yrhJ基因)。
酶切后，將這些限制酶處理的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，得到各限制酶處理的DNA片段。
用限制酶Sal I和EcoR I酶切載體質(zhì)粒pUC119(寶酒造社制)后，進行瓊脂糖凝膠電泳，得到Sal I-EcoR I處理的pUC119片段。同樣用限制酶Sal I和SmaI酶切載體質(zhì)粒pUC119后，進行瓊脂糖凝膠電泳，得到Sal I-SmaI處理的pUC119片段。
用限制酶XbaI和SmaI酶切pSTV28(寶酒造社制)后，進行瓊脂糖凝膠電泳，得到XbaI-SmaI處理的pSTV28片段。同樣，用限制酶XbaI和BamH I酶切pSTV28后，進行瓊脂糖凝膠電泳，得到XbaI-BamH I處理的pSTV28片段。
分別將上述所得EcoR I-Sal I處理的DNA片段(應用序列號3和4的引物組合進行PCR擴增)與Sal I-EcoR I處理的pUC119片段混合，XbaI-SmaI處理的DNA片段(應用序列號5和6的引物組合進行PCR擴增)與XbaI-SmaI處理的pSTV28片段混合，SmaI-SalI處理的DNA片段(應用序列號7和8的引物組合進行PCR擴增)與Sal I-SmaI處理的pUC119片段混合，EcoR I-Sal I處理的DNA片段(應用序列號9和10的引物組合進行PCR擴增)與Sal I-EcoR I處理的pUC119片段混合，XbaI-Bgl II處理的DNA片段(應用序列號11和12的引物組合進行PCR擴增)與XbaI-BamH I處理的pSTV28片段混合，XbaI-SmaI處理的DNA片段(應用序列號13和14的引物組合進行PCR擴增)與XbaI-SmaI處理的pSTV28片段混合，XbaI-SmaI處理的DNA片段(應用序列號15和16的引物組合進行PCR擴增)與XbaI-SmaI處理的pSTV28片段混合，然后進行乙醇沉淀，得到的DNA沉淀物溶解于5μl蒸餾水，并進行連接反應，分別得到各重組DNA。
用該重組DNA按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(購自東洋紡)DH5α株，然后將轉(zhuǎn)化體涂到LB瓊脂培養(yǎng)基上，用pUC119作為載體質(zhì)粒時，涂到含氨芐青霉素100μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基(1L中有細菌用胰化蛋白胨(Difco公司制)10g，細菌用酵母提取物(Difco公司制)5g，NaCl 5g，用1mol/l NaOH調(diào)pH到7.4，含瓊脂1.5％)，用pSTV28作為載體質(zhì)粒時，涂到含氯霉素25μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2天。
挑選數(shù)個長出的氨芐青霉素抗性或氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體菌落，接種到含氨芐青霉素100μg/ml或氯霉素25μg/ml的LB液體培養(yǎng)基(1L中有細菌用胰化蛋白胨(Difco公司制)10g，細菌用酵母提取物(Difco公司制)5g，NaCl 5g，用1mol/l NaOH調(diào)pH到7.4)10ml上，25℃振蕩培養(yǎng)2天。
將所得培養(yǎng)液離心，得到菌體。
用常規(guī)方法從該菌體中分離純化質(zhì)粒。
用各種限制酶酶切分離純化出的質(zhì)粒，進行酶切鑒定并測定堿基序列，根據(jù)結(jié)果判定該質(zhì)粒中插入了目的DNA片段。分別將EcoR I-Sal I處理的DNA片段(應用序列號3和4的引物組合進行PCR擴增)與Sal I-EcoR I處理的pUC119片段連接所得的質(zhì)粒命名為pUbioI，XbaI-SmaI處理的DNA片段(應用序列號5和6的引物組合進行PCR擴增)與XbaI-SmaI處理的pSTV28片段連接所得的質(zhì)粒命名為pScypA，SmaI-SalI處理的DNA片段(應用序列號7和8的引物組合進行PCR擴增)與Sal I-SmaI處理的pUC119片段連接所得的質(zhì)粒命名為pUcypX，EcoR I-Sal I處理的DNA片段(應用序列號9和10的引物組合進行PCR擴增)與Sal I-EcoR I處理的pUC119片段連接所得的質(zhì)粒命名為pUpksS，XbaI-Bgl II處理的DNA片段(應用序列號11和12的引物組合進行PCR擴增)與XbaI-BamH I處理的pSTV28片段連接所得的質(zhì)粒命名為pSyetO，XbaI-SmaI處理的DNA片段(應用序列號13和14的引物組合進行PCR擴增)與XbaI-SmaI處理的pSTV28片段連接所得的質(zhì)粒命名為pSyjiB，XbaI-SmaI處理的DNA片段(應用序列號15和16的引物組合進行PCR擴增)與XbaI-SmaI處理的pSTV28片段連接所得的質(zhì)粒命名為pSyrhJ。
分別將含有這些質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α、含有pUC119或pSTV28的大腸桿菌DH5α及不含質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α接種到LB液體培養(yǎng)基3ml(添加載體質(zhì)粒具有的抗藥性基因所對應的藥物)中，28℃振蕩培養(yǎng)12小時。將該培養(yǎng)液0.5ml接種到含1％葡萄糖、CaCO31％的LB液體培養(yǎng)基(添加抗藥性基因所對應的藥物)中，28℃振蕩培養(yǎng)12小時。取1ml培養(yǎng)液放入到阿氏試管中(Assist公司制)，添加葡萄糖和先前得到的化合物(VII-a)(R1為鈉的化合物)，使終濃度分別達1％和100mg/l，28℃振蕩培養(yǎng)24小時。反應終止后，通過離心去除菌體，向所得反應上清液中加入等量的乙酸乙酯，充分振蕩。通過離心從該溶液分離出上層的乙酸乙酯層，將乙酸乙酯層用離心蒸發(fā)儀干燥。將干燥物溶解到最初培養(yǎng)上清液1/5量的甲醇中，進行HPLC分析(柱Intersil ODS-2(5μm，4×250mm，GL science公司制)，柱溫度60℃，移動相乙腈∶水∶磷酸＝55∶45∶0.05，流速0.9ml/min，檢測波長237nm)，進行化合物(VIII-a)(式中，R1為鈉的化合物)的檢測、定量。結(jié)果如表1所示。
表1質(zhì)粒 化合物(VIII-a)(mg/l)無 0pUC119 0pSTV28 0pUbioI 0pScypA 0pUcypX 0pUpksS 0pSyetO 0pSyjiB 0.6pSyrhJ 0實施例2 枯草桿菌作宿主時yjiB基因的表達以及該基因編碼的蛋白質(zhì)活性的確認用DNA合成儀合成具有序列號17和18、序列號19和20、序列號21和22、序列號23和24、序列號25和26、序列號27和28、序列號29和30的堿基序列組合的正向引物和反向引物。
以實施例1中獲得的枯草桿菌染色體DNA作模板，用這些引物和TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2(寶酒造社制)、Expand TM High-Fidelity PCR System(ベ-リンガ-·マンハィム公司制)或Taq DNA聚合酶(Boelinnger公司制)，用DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer日本公司制)進行PCR。
PCR在下述條件下進行2kb以下的DNA片段以94℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘構(gòu)成的反應程序為一個循環(huán)，超過2kb的DNA片段以98℃20秒、68℃3分鐘構(gòu)成的反應程序為一個循環(huán)，進行30個循環(huán)后，在72℃反應7分鐘。
分別用限制酶Spe I和BamH I酶切在PCR擴增的DNA片段中，應用序列號17和18的引物組合擴增出的DNA片段(含bioI基因)，用限制酶Spe I和BamH I酶切應用序列號19和20的引物組合擴增出的DNA片段(含cypA基因)，用限制酶Spe I和Nru I酶切應用序列號21和22的引物組合擴增出的DNA片段(含cypX基因)，用限制酶Spe I和BamH I酶切應用序列號23和24的引物組合擴增出的DNA片段(含pksS基因)，用限制酶Spe I和BamH I酶切應用序列號25和26的引物組合擴增出的DNA片段(含yetO基因)，用限制酶Spe I和BamH I酶切應用序列號27和28的引物組合擴增出的DNA片段(含yjiB基因)，用限制酶Spe I和BamH I酶切應用序列號29和30的引物組合擴增出的DNA片段(含yrhJ基因)。
酶切后，將這些限制酶處理的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，得到各限制酶處理的DNA片段。
用限制酶Spe I和BamH I酶切載體質(zhì)粒pWH1520(MoBiTec公司制)后，進行瓊脂糖凝膠電泳，得到Spe I-BamH I處理的pWH1520片段。同樣用限制性酶Spe I和Nru I酶切載體質(zhì)粒pWH1520后，進行瓊脂糖凝膠電泳，得到Spe I-Nru I處理的pWH1520片段。
分別將上述得到的Spe I-BamH I處理DNA片段(用序列號17和18、19和20、23和24、25和26、27和28、29和30的引物組合進行PCR擴增)與Spe I-BamH I處理的pWF1520片段混合，Spe I-NruI處理的DNA片段(用序列號21和22的引物組合進行PCR擴增)與Spe I-Nru I處理的pWF1520片段混合，然后乙醇沉淀，將所得DNA沉淀物溶解到5μl蒸餾水中，進行連接反應，獲得各個的重組DNA。
應用重組DNA按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(購自東洋紡)DH5α株，然后涂到含四環(huán)素10μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2天。將所得培養(yǎng)液離心，得到菌體。
用常規(guī)方法從該菌體中分離純化質(zhì)粒。
用各種限制酶酶切分離純化出的質(zhì)粒，進行酶切鑒定并測定堿基序列，根據(jù)結(jié)果判定該質(zhì)粒中插入了目的DNA片段。分別將應用序列號17和18的引物組合進行PCR擴增的DNA片段與pWH1520連接所得的質(zhì)粒命名為pWbioI，應用序列號19和20的引物組合進行PCR擴增的DNA片段與pWH1520連接所得的質(zhì)粒命名為pWcypA，應用序列號21和22的引物組合進行PCR擴增的DNA片段與pWH1520連接所得的質(zhì)粒命名為pWcypX，應用序列號23和24的引物組合進行擴增的DNA片段與pWH1520連接所得的質(zhì)粒命名為pWpksS，應用序列號25和26的引物組合進行擴增的DNA片段與pWH1520連接所得的質(zhì)粒命名為pWyetO，應用序列號27和28的引物組合進行擴增的DNA片段與pWH1520連接所得的質(zhì)粒命名為pWyjiB，應用序列號29和30的引物組合進行擴增的DNA片段與pWH1520連接所得的質(zhì)粒命名為pWyrhJ。
按照S.chang and S.N.cohen(S.chang and S.N.cohenMol.Gen.Genet.，168，111(1979))等的方法，將所得質(zhì)粒及載體質(zhì)粒pWH1520導入枯草芽孢桿菌ATCC33712株中。
即，將ATCC33712株接種到裝有5ml Pen培養(yǎng)基(將DifcoAntibiotic medium No.3 1.75g溶解到100ml水中，高壓滅菌)的粗試管中，37℃振蕩培養(yǎng)一晚。然后，將培養(yǎng)了一晚的菌體全部接種到裝有100ml Pen培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)3小時，使之生長到對數(shù)生長期中期。將該培養(yǎng)液在無菌條件下，5000rpm離心10分鐘，使菌體沉淀。去除上清液后，懸浮到4.5ml SMMP(×2SMMP(將蔗糖34.2g，馬來酸0.464g，氯化鎂.6水合物0.813g溶解于水中，用氫氧化鈉調(diào)至pH6.5后，制成100ml，高壓滅菌)與×4 Pen培養(yǎng)基(Difco Antibiotic medium No.3 7g溶解到100ml水中，高壓滅菌)的等量混合物)，加入0.5ml溶菌酶溶液(將10mg的溶菌酶(生化學工業(yè)) 溶解到0.5ml SMMP中，用孔徑0.45μm的微孔濾膜過濾除菌)，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)2小時。顯微鏡下確認90％以上的細胞原生質(zhì)體化后，3000rpm離心20分鐘，使原生質(zhì)體沉淀。除去上清液，將所得原生質(zhì)體再懸浮到5ml SMMP中。再3000rpm離心20分鐘，收集原生質(zhì)體，懸浮到2ml SMMP中，作為轉(zhuǎn)化受體菌的原生質(zhì)體懸浮液。
將質(zhì)粒DNA約1μg溶解到SMMP中，與原生質(zhì)體懸浮液0.5ml充分混合?；旌虾罅⒓醇尤?0％聚乙二醇溶液(聚乙二醇6000(ナカラィテスク)40g溶解到×2 SMMP中，加水到100ml后，高壓滅菌)1.5ml，并充分混合。室溫放置2分鐘后，加入5ml SMMP并混合，3000rpm離心20分鐘。除去上清液后，向沉淀的原生質(zhì)體中加入1mlSMMP并懸浮，30℃緩慢振蕩3小時。用SMMP適當稀釋后，涂到加入藥物(四環(huán)素的場合，加到10μg/ml)的DM3培養(yǎng)基(細菌用瓊脂(Difco公司制)80g/L 45ml，酪蛋白氨基酸(casamino acid)50g/L 50ml，琥珀酸鈉6水合物338g/L pH7.3 250ml，磷酸緩沖液(磷酸氫二鉀35g/L，磷酸二氫鉀15g/L)50ml，酵母提取物100g/L 25ml，氯化鎂·6水合物203g/L 10ml，葡萄糖100g/L 25ml，分別高壓滅菌后，混合，加入3.5ml 20mg/ml用0.45um微孔濾膜過濾除菌的牛血清白蛋白)上。37℃培養(yǎng)1-2天，得到轉(zhuǎn)化株。
如此獲得具有上述各質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌ATCC33712株。
分別將所得轉(zhuǎn)化體以及未導入質(zhì)粒的ATCC33712株接種到LB液體培養(yǎng)基3ml(對含有質(zhì)粒的菌株添加10mg/l的四環(huán)素)，30℃振蕩培養(yǎng)24小時。取該培養(yǎng)液0.25ml接種到含有TB培養(yǎng)基(細菌用胰化蛋白胨(Difco公司制)1.4％，細菌用酵母提取物(Difco公司制)2.4％，KH2PO40.231％，K2HPO41.251％，用1mol/l氫氧化鈉調(diào)至pH7.4)5ml的試管中，30℃振蕩培養(yǎng)3小時。3小時后，取1ml培養(yǎng)液移到阿氏試管No.60.54OS(Assist公司制)，添加40μl滅菌后的50％木糖溶液，再振蕩培養(yǎng)3小時，然后將實施例1所得化合物(VII-a)(R為鈉的化合物)以終濃度0.2mg/ml分別加到試管中，再30℃振蕩培養(yǎng)16小時，進行反應。
反應終止后，用醋酸將反應液的pH調(diào)整為3.5。向該反應液0.5ml中加入乙酸乙酯1ml，振蕩1小時。振蕩后，3000rpm離心5分鐘，將反應液分為2層，回收上清的乙酸乙酯層，用離心蒸發(fā)儀除去溶劑后，將殘渣溶解到0.5ml甲醇中。
用該甲醇溶液的一部分進行與實施例1同樣的HPLC分析，進行化合物(VIII-a)(式中R1為鈉的化合物)的檢測、定量。結(jié)果如表2所示。
表2質(zhì)?；衔?VIII-a)(mg/l)無0.5pWH1520 0.5pWbioI 0.5pWcypA 0.5pWcypX 0.5pWpksS 0.5pWyetO 0.5pWyjiB 24.6pWyrhJ 0.5由實施例1、2的結(jié)果可以看出，yjiB基因編碼由化合物(VII-a)或化合物(VII-b)生成化合物(VIII-a)或化合物(VIII-b)的活性。
另外，用上述序列號27和28的引物組合進行PCR擴增的DNA片段中含有序列號2記載的堿基序列，該堿基序列中含有編碼具有序列號1記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列。
實施例3以巨大芽孢桿菌作宿主時yjiB基因的表達及化合物(VIII-a)的生成用與實施例2中記載的枯草桿菌轉(zhuǎn)化法相同的方法，將實施例2中制備的pWyjiB導入巨大芽孢桿菌(MoBiTec公司制)及芽孢桿菌屬FERM BP-6030。
與實施例2同樣培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體及不帶有質(zhì)粒的宿主，進行反應，測定生成的化合物(VIII-a)的量。結(jié)果如表3所示。
表3宿主質(zhì)?；衔?VIII-a)(mg/l)B.megaterium 無 2.0″ pWyjiB27.2FERM BP-6030 無 4.5″ pWyjiB30.3實施例4 制備在棒狀桿菌中表達生成化合物(VIII-a)的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒為了使實施例1中獲得的yjiB基因能在棒狀桿菌中有效表達，用DNA合成儀合成具有序列號31、32、33、34、35、36、37、38、39記載的堿基序列的DNA。
將含有可在棒狀桿菌中表達的啟動子序列p54-6(GeneBankAJ132582)、具有序列號40記載的堿基序列的DNA片段，插入到質(zhì)粒載體pCS299P(特愿平11-110437)的Sse83871-BamH I位點間的質(zhì)粒pRI 109 DNA，由該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌NM522株按常規(guī)方法制備。
以實施例2中得到的pWyjiB DNA作模板，用具有序列號31和32堿基序列的DNA引物和Taq DNA聚合酶(寶酒造社制)，用DNA ThermalCycler 480(Perkin Elmer日本公司制)進行PCR。
PCR在下述條件下進行以96℃30秒、50℃45秒、72℃3分鐘構(gòu)成的反應程序為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)的反應。
用Sal I和BamH I酶切通過PCR擴增的DNA片斷后，進行瓊脂糖凝膠電泳，按常規(guī)方法純化大約1.2kb的DNA片段，得到Sal I-BamH I處理的DNA片段。
用限制酶Sal I和BamH I酶切上述得到的質(zhì)粒pRT109DNA后，進行瓊脂糖凝膠電泳，按常規(guī)方法純化大約62kb的DNA片段，得到Sal I-BamH I處理的pRI 109片段。
將上述得到的Sal I-BamH I處理的DNA片段與Sal I-BamH I處理的pRT109片段混合，然后進行連接反應，得到重組DNA。
用該重組DNA，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購自東洋紡社)后，涂到含卡那霉素20μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1天，獲得轉(zhuǎn)化體。
按常規(guī)方法從該轉(zhuǎn)化體中分離純化質(zhì)粒。以分離出的質(zhì)粒DNA為模板，分別以具有序列號33、34、35、36、37的堿基序列的DNA作引物，用DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem公司制)及373A測序儀(Applied Biosystem公司制)，確定插入的DNA片段的堿基序列，將序列號41的堿基序列插入到pRT109的Sal I-BamH I位點間的質(zhì)粒命名為pRIyjiB。
序列號41記載的堿基序列中含有編碼具有序列號42記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列。
以實施例1中得到的枯草芽孢桿菌Marburg168株(ATCC15563株)的染色體DNA作模板，使用具有序列號38及39的堿基序列的DNA引物和LA-Taq DNA聚合酶(寶酒造社制)，用DNA Thermal Cycler480(Perkin Elmer日本公司制)進行PCR。
PCR在下述條件下進行以96℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘構(gòu)成的反應程序為一個循環(huán)，進行30個循環(huán)后，72℃反應7分鐘。
將PCR擴增的DNA片段與pT7Blue(購自寶酒造社)混合后，進行連接反應，獲得重組DNA。
用該重組DNA，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購自東洋紡社)后，涂到含有氨芐青霉素100μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1天，獲得轉(zhuǎn)化體。
按常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化體中分離純化質(zhì)粒。按常規(guī)方法用各種限制酶酶切分離出的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定確認是插入了目的DNA片段的質(zhì)粒，命名為pTSYN2-72。
用Xho I和BamH I酶切pTSYN2-72 DNA，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，按常規(guī)方法純化出約1.2kb的DNA片段，獲得Xho I-BamH I處理的DNA片段。
用限制性酶Sal I和BamH I酶切pRI 109 DNA，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，按常規(guī)方法純化出約6kb的DNA片段，獲得Sal I-BamHI處理的pRI 109片段。
將上述取得的Xho I-BamH I處理的DNA片段與Sal I-BamH I處理的pRI 109片段混合后，進行連接反應，得到重組DNA。
用該重組DNA，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購自東洋紡社)，涂到含卡那霉素20μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1天，獲得轉(zhuǎn)化體。
按常規(guī)方法從該轉(zhuǎn)化體中分離純化質(zhì)粒。以分離出的質(zhì)粒DNA為模板，分別以具有序列號33、34、35、36、37的堿基序列的DNA作引物，用DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem公司制)及373A測序儀(Applied Biosystem公司制)，確定插入的DNA片段的堿基序列，將序列號43的序列插入到pRI 109的Sal I-BamH I位點間的質(zhì)粒命名為pSYN2-72。
序列號43記載的堿基序列中含有編碼具有序列號1記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列。
以實施例2中得到的pWyjiB DNA作模板，以具有序列號38及39的堿基序列的DNA作引物，用Z-Taq DNA聚合酶(寶酒造社制)，用DNA Thermal Cycler 480(Perkin Elmer日本公司制)進行PCR。
PCR在下述條件下進行以98℃20秒、55℃20秒、72℃30分鐘構(gòu)成的反應程序為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)的反應。
用Xho I和BamH I酶切PCR擴增的DNA片段，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，按常規(guī)方法純化出約1.2kb的DNA片段，獲得Xho I-BamHI處理的DNA片段。
用限制酶Sal I和BamH I酶切質(zhì)粒pRI 109 DNA，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，按常規(guī)方法純化出約6kb的DNA片段，獲得Sal I-BamH I處理的pRI 109片段。
將上述取得的Xho I-BamH I處理的DNA片段與Sal I-BamH I處理的pRI 109片段混合后，進行連接反應，得到重組DNA。
用該重組DNA，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購自東洋紡社)，涂到含卡那霉素20μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1天，獲得轉(zhuǎn)化體。
按常規(guī)方法從該轉(zhuǎn)化體中分離純化質(zhì)粒。以分離出的質(zhì)粒DNA為模板，分別以具有序列號33、34、35、36、37的堿基序列的DNA作引物，用DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem公司制)及373A測序儀(Applied Biosystem公司制)，確定插入的DNA片段的堿基序列，將序列號44記載的堿基序列插入到pRT109的Sal I-BamH I位點間的質(zhì)粒命名為pSYN2-39。
序列號44記載的堿基序列中含有編碼具有序列號45記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列。
實施例5谷氨酸棒桿菌ATCC13032株的質(zhì)粒導入及活性評價將ATCC13032株接種到加入了8ml肉湯培養(yǎng)基(普通肉湯培養(yǎng)基(極東制藥工業(yè)社制)20g/l，細菌用酵母提取物(Difco公司制)5g/l)的試管中，30℃振蕩培養(yǎng)一晚。然后取培養(yǎng)了一晚的菌體5ml接種在加入了250ml肉湯培養(yǎng)基的21錐形瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)4小時。將所得培養(yǎng)液離心，使菌體沉淀。去除上清液后，懸浮到預冷的30ml EPB(250mmol/l蔗糖，15％(v/v)甘油)中，離心，再度將菌體沉淀。同樣，再度懸浮到EPB中，離心，分離菌體，然后將菌體懸浮到2ml的EPB中。分別將0.1ml得到的菌體懸浮液注入到0.5ml的管中，用干冰速凍，得到轉(zhuǎn)化用的菌體懸浮液。將所得菌體在-80℃下保存。
在冰上融解凍結(jié)的轉(zhuǎn)化用菌體懸浮液0.1ml，43.5℃保持10分鐘后，移到冰上。添加含pRT109DNA約2μg的水溶液2μl后，移到預冷的大腸桿菌GenePulser杯(BioRad公司制)中，通過用GenePulser(BioRad公司制)的電穿孔法，在25μF、200Ω、1.5kV的條件下，將DNA導入到細菌內(nèi)。電穿孔后，立即將菌體懸浮液全部移到加入了1ml肉湯培養(yǎng)基的15ml體積的試管中，30℃振蕩培養(yǎng)1小時。
將所得培養(yǎng)液3500rpm，離心10分鐘，使菌體沉淀。棄上清液后，重新添加0.1ml肉湯培養(yǎng)基，懸浮菌體后，將懸浮液涂到含卡那霉素20μg/ml的肉湯瓊脂培養(yǎng)基(用2％Difco瓊脂固化的肉湯培養(yǎng)基)上，30℃培養(yǎng)2天，得到轉(zhuǎn)化體。
如此獲得具有pRT109的谷氨酸棒桿菌ATCC13032株。
與上述同樣，獲得具有實施例4中獲得的pRIyjiB、pSYN2-72、pSYN2-39各質(zhì)粒的谷氨酸棒桿菌ATCC13032株。
將所得轉(zhuǎn)化體分別接種到加入3ml肉湯培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)基中含卡那霉素100μg/ml，30℃振蕩培養(yǎng)24小時。取培養(yǎng)液0.2ml移入到加入2ml含卡那霉素100μg/ml的LMC培養(yǎng)基(向高壓滅菌的pre-LMC培養(yǎng)基(NH4Cl 1g/l，KH2PO41g/l，K2HPO43g/l，Difco酵母提取物0.2g/l，尿素1g/l，生物素0.05mg/l，硫胺素0.5mg/l，玉米浸漬液10g/l，pH7.2)中分別添加滅菌了的葡萄糖、MgSO4、FeSO4、MnSO4，終濃度分別為30g/l、0.1g/l、2mg/l、2mg/l)的試管中，30℃振蕩培養(yǎng)5小時。添加化合物(VII-a)(式中R為鈉的化合物)終濃度為300mg/l，再30℃振蕩培養(yǎng)16小時。
將反應液0.5ml移入1.5ml的管中，15,000rpm離心2分鐘，分離菌體。用甲醇將所得上清液部分稀釋到5-20倍，15,000rpm離心2分鐘后，用其一部分，進行與實施例1同樣的HPLC分析，進行化合物(VIII-a)(式中R1為鈉的化合物)的檢測、定量。根據(jù)定量結(jié)果算出反應液中化合物(VIII-a)的濃度，結(jié)果如表4所示。
表4質(zhì)粒化合物(VIII-a)(mg/l)pRI109 0.3pSYN2-7230pRIyjiB 61pSYN2-39104實施例6棒狀桿菌的質(zhì)粒導入及活性評價用與實施例5記載的ATCC13032株的轉(zhuǎn)化方法同樣的方法，將實施例4中取得的pRIyjiB DNA導入美棒桿菌ATCC15991、產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6872、黃色短桿菌ATCC14067中，分別由各菌株得到轉(zhuǎn)化株。
將所得轉(zhuǎn)化體分別接種到裝有3ml肉湯培養(yǎng)基、含100μg/ml卡那霉素的試管中，30℃振蕩培養(yǎng)24小時。取0.5ml培養(yǎng)液移入到裝有含100μg/ml卡那霉素、葡萄糖10g/l的5mlTB培養(yǎng)基(細菌用胰化蛋白胨(Difco公司制)14g，細菌用酵母提取物24g(Difco公司制)溶解到900ml水中后，高壓滅菌，再加入高壓滅菌了的PB(KH2PO423.1g/l，K2HPO4125.1g/l)100ml)的試管中，30℃振蕩培養(yǎng)5小時。取培養(yǎng)液1ml移到阿氏試管(Assist公司制)中，添加化合物(VII-a)(式中R為鈉的化合物)終濃度為300mg/l，再30℃振蕩培養(yǎng)16小時。
反應終止后，按實施例2中記載的方法，進行反應液中的化合物(VIII-a)(式中R1為鈉的化合物)的檢測、定量。根據(jù)定量的結(jié)果算出的培養(yǎng)液中化合物(VIII-a)的濃度，如表5所示。
表5宿主 質(zhì)粒 化合物 (VIII-a)(mg/l)C.callunae ATCC15991(KY3510) pRIyjiB 22C.ammoniagenes ATCC6872(KY3454)pRIyjiB 12B.flavum ATCC14067(KY10122)pRIyjiB 23工業(yè)實用性本發(fā)明可高效制備新型的編碼羥化酶的DNA及抑制羥甲基戊二酸單酰CoA(HMG-CoA)還原酶、具有降低血清膽固醇作用的化合物。
序列表說明序列號3合成DNA序列號4合成DNA序列號5合成DNA序列號6合成DNA序列號7合成DNA序列號8合成DNA序列號9合成DNA序列號10合成DNA序列號11合成DNA序列號12合成DNA序列號13合成DNA序列號14合成DNA序列號15合成DNA序列號16合成DNA序列號17合成DNA序列號18合成DNA序列號19合成DNA序列號20合成DNA
序列號21合成DNA序列號22合成DNA序列號23合成DNA序列號24合成DNA序列號25合成DNA序列號26合成DNA序列號27合成DNA序列號28合成DNA序列號29合成DNA序列號30合成DNA序列號31合成DNA序列號32合成DNA序列號33合成DNA序列號34合成DNA序列號35合成DNA序列號36合成DNA序列號37合成DNA序列號38合成DNA序列號39合成DNA序列號40合成DNA
序列表SEQUENCE LISTING<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社<120>HMG-CoA還原酶抑制劑的制備方法<130>H11-0011T4<160>45<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>396<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌<400>1Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn1 5 10 15Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser20 25 30Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp
35 40 45Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu50 55 60Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser65 70 75 80Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val85 90 95Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Val Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile100 105 110Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu115 120 125Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile130 135 140Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phe Lys Ala145 150 155 160Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala165 170 175Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala180 185 190Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln195 200 205Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu210 215 220Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Phe Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly225 230 235240Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Tyr Ser Ile Leu245 250 255Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met260 265 270Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val275 280 285Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile290 295 300Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp305 310 315 320Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro325 330 335Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala340 345 350Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser355 360 365Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser370 375 380Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met385 390 395<210>2<211>1191<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(1191)<400> 2atg aat gtg tta aac cgc cgg caa gcc ttg cag cga gcg ctg ctc aat 48Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn1 5 10 15ggg aaa aac aaa cag gat gcg tat cat ccg ttt cca tgg tat gaa tcg 96Gly Lys Asn Lys Gln Asp ALa Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser20 25 30atg aga aag gat gcg cct gtt tcc ttt gat gaa gaa aac caa gtg tgg 144Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp35 40 45agc gtt ttt ctt tat gat gat gtc aaa aaa gtt gtt ggg gat aaa gag 192Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu50 55 60ttg ttt tcc agt tgc atg ccg cag cag aca agc tct att gga aat tcc 240Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser65 70 75 80atc att aac atg gac ccg ccg aag cat aca aaa atc cgt tca gtc gtg 288Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val85 90 95aac aaa gcc ttt act ccg cgc gtg atg aag caa tgg gaa ccg aga att 336Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Val Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile100 105 110caa gaa atc aca gat gaa ctg att caa aaa ttt cag ggg cgc agt gag 384Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu115 120 125ttt gac ctt gtt cac gat ttt tca tac ccg ctt ccg gtt att gtg ata 432Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile130 135 140tct gag ctg ctg gga gtg cct tca gcg cat atg gaa 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<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成DNA
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<223>合成DNA
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<223>合成DNA<400>39
tcgcggatcc ttacattttc acacggaa28<210>40<211>715<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>40cctgcaggtc atcacccgag caggcgaccc gaacgttcgg aggctcctcg ctgtccattc 60gctcccctgg cgcggtatga accgccgcct catagtgcag tttgatcctg acgagcccag 120catgtctgcg cccaccttcg cggaacctga ccagggtccg ctagcgggcg gccggaaggt 180gaatgctagg catgatctaa ccctcggtct ctggcgtcgc gactgcgaaa tttcgcgagg 240gtttccgaga aggtgattgc gcttcgcaga tctcgtggac ggcttggttg acgccctccg 300cccattgggt gatggtggca ccatttggct gttgactcct ggtgcaggaa aacgtggaac 360tattgctcca ggtgaaattt ccgaatccgc acaattggca ggcctcgtcc agaccaccgc 420agagcgtctc ggtgattggc agggcagctg cttggtcgcg cgcggcgcga tgaagaagta 480agaattagcc gaaaacacct tccagccagg cgatttgctt aagttagaag gtgtggctag 540tattctaaga gtgctcatga ggaagcggaa agcttttaag agagcatgat gcggctttag 600ctcagctgga agagcaactg gtttacaccc agtaggtcgg gggttcgatc cagctgtgaa 660caattgcact ttggatctaa ttaagggatt agtcgactat ggatccccgg gtacc 715<210>41<211>1204<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<220>
<221>CDS<222>(8)..(1195)<400>41gtcgaca atg aat gtg tta aac cgc cgg caa gcc ttg cag cga gcg ctg 49Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu1 5 10ctc aat ggg aaa aac aaa cag gat gcg tat cat ccg ttt cca tgg tat 97Leu Asn Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr15 20 25 30gaa tcg atg aga aag gat gcg cct gtt tcc ttt gat gaa gaa aac caa 145Glu Ser Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln35 40 45gtg tgg agc gtt ttt ctt tat gat gat gtc aaa aaa gtt gtt ggg gat 193Val Trp Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp50 55 60aaa gag ttg ttt tcc agt tgc atg ccg cag cag aca agc tct att gga 241Lys Glu Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly65 70 75aat tcc atc att aac atg gac ccg ccg aag cat aca aaa atc cgt tca 289Asn Ser Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser80 85 90gtc gtg aac aaa gcc ttt act ccg cgc gcg atg aag caa tgg gaa ccg 337Val Val Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met Lys Gln Trp Glu Pro95 100 105 110aga att caa gaa atc aca gat gaa ctg att caa aaa ttt cag ggg cgc 385Arg Ile Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg115 120 125agt gag ttt gac ctt gtt cac gat ttt tca tac ccg ctt ccg gtt att 433Ser Glu Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile130 135 140gtg ata tct gag ctg ctg gga gtg cct tca gcg cat atg gaa cag ttt 481Val Ile Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phe145 150 155aaa gca tgg tct gat ctt ctg gtc agt aca ccg aag gat aaa agt gaa 529Lys Ala Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu160 165 170gaa gct gaa aaa gcc ttt ttg gaa gaa cga gat aag tgt gag gaa gaa 577Glu Ala Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu175 180 185 190ctg gcc gcg ttt ttt gcc ggc atc ata gaa gaa aag cga aac aaa ccg 625Leu Ala Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro195 200 205gaa cag gat att att tct att tta gtg gaa gcg gaa gaa aca ggc gag 673Glu Gln Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu210 215 220aag ctg tcc ggt gaa gag ctg att ccg ttg tgc acg ctg ctg ctg gtg 721Lys Leu Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val225 230 235gcc gga aat gaa acc act aca aac ctg att tca aat gcg atg tac agc 769Ala Gly Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Tyr Ser240 245 250ata tta gaa acg cca ggc gtt tac gag gaa ctg cgc agc cat cct gaa 817Ile Leu Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu255 260 265 270ctg atg cct cag gca gtg gag gaa gcc ttg cgt ttc aga gcg ccg gcc 865Leu Met Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala275 280 285ccg gtt ttg agg cgc att gcc aag cgg gat acg gag atc ggg ggg cac 913Pro Val Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His290 295 300ctg att aaa gaa ggt gat atg gtt ttg gcg ttt gtg gca tcg gca aat 961Leu Ile Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn305 310 315cgt gat gaa gca aag ttt gac aga ccg cac atg ttt gat atc cgc cgc 1009Arg Asp Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg320325 330cat ccc aat ccg cat att gcg ttt ggc cac ggc atc cat ttt tgc ctt 1057His Pro Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu335 340 345 350ggg gcc ccg ctt gcc cgt ctt gaa gca aat atc gcg tta acg tct ttg 1105Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu355 360 365att tct gct ttt cct cat atg gag tgc gtc agt atc act ccg att gaa 1153Ile Ser Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu
370 375 380aac agt gtg ata tac gga tta aag agc ttc cgt gtg aaa atg taaggatcc 1204Asn Ser Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met385 390 395<210>42<211>396<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌<400>42Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn1 5 10 15Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser20 25 30Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp35 40 45Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu50 55 60Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser65 70 75 80Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val85 90 95Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile100 105 110Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu115 120 125Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile130 135 140Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phc Lys Ala145 150 155 160Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala165 170 175Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala180 185 190Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln195 200 205Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu210 215 220Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly225 230 235 240Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Tyr Ser Ile Leu245 250 255Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met260 265 270Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val275 280 285Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile290 295 300Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp305 310 315 320Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro325 330 335Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala340 345 350Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser355 360 365Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser370 375 380Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met385 390 395<210>43<211>1221<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<220><221>CDS<222>(25)..(1212)<400>43ctcgagtcga ggaggtcgac taat atg aac gtt ctg aac cgc cgt caa gcc 51Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala1 5ttg cag cga gcg ctg ctc aat ggg aaa aac aaa cag gat gcg tat cat 99Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His10 15 20 25ccg ttt cca tgg tat gaa tcg atg aga aag gat gcg cct gtt tcc ttt 147Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe30 35 40gat gaa gaa aac caa gtg tgg agc gtt ttt ctt tat gat gat gtc aaa 195Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys45 50 55aaa gtt gtt ggg gat aaa gag ttg ttt tcc agt tgc atg ccg cag cag 243Lys Val Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln60 65 70aca agc tct att gga aat tcc atc att aac atg gac ccg ccg aag cat 291Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His75 80 85aca aaa atc cgt tca gtc gtg aac aaa gcc ttt act ccg cgc gtg atg 339Thr Lys Ile Arg Ser Val Val Asn Lys Ala Phe 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Met315 320 325ttt gat atc cgc cgc cat ccc aat ccg cat att gcg ttt ggc cac ggc 1059Phe Asp Ile Arg Arg His Pro Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly330 335 340 345atc cat ttt tgc ctt ggg gcc ccg ctt gcc cgt ctt gaa gca aat atc 1107Ile His Phe Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile350 355 360gcg tta acg tct ttg att tct gct ttt cct cat atg gag tgc gtc agt 1155Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser365 370 375atc act ccg att gaa aac agt gtg ata tac gga tta aag agc ttc cgt 1203Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg380 385390gtg aaa atg taaggatcc1221Val Lys Met395<210>44<211>1221<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<221>CDS<221>(25)..(1212)<400>44ctcgagtcga ggaggtcgac taat atg aac gtt ctg aac cgc cgt caa gcc 51Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala1ttg ccg cga gcg ctg ctc aat ggg aaa aac aaa cag gat gcg tat cat 99Leu Pro Arg Ala Leu Leu Asn Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His10 15 20 25ccg ttt cca tgg tat gaa tcg atg aga aag gat gcg cct gtt tcc ttt 147Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe30 35 40gat gaa gaa aac caa gtg tgg agc gtt ttt ctt tat gat gat gtc aaa 195Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys45 50 55aaa gtt gtt ggg gat aaa gag ttg ttt tcc agt tgc atg ccg cag cag 243Lys Val Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln60 65 70aca agc tct att gga aat tcc atc att agc atg gac ccg ccg aag cat 291Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser Ile Ile Ser Met Asp Pro Pro Lys His75 80 85aca aaa atc cgt tca gtc gtg aac aaa gcc ttt act ccg cgc gcg atg 339Thr Lys Ile Arg Ser Val Val Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met90 95 100 105aag caa tgg gaa ccg aga att caa gaa atc aca gat gaa ctg att caa 387Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln110 115 120aaa ttt cag ggg cgc agt gag ttt gac ctt gtt cac gat tat tca tac 435Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu Phe Asp Leu Val His Asp Tyr Ser Tyr125 130 135ccg ctt ccg gtt att gtg ata tct gag ctg ctg gga gtg cct tca gcg 483Pro Leu Pro Val Ile Val Ile Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala140 145 150cat atg gaa cag ttt aaa gca tgg tct gat ctt ctg gtc agt aca ccg 531His Met Glu Gln Phe Lys Ala Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro155 160 165aag gat aaa agt gaa gaa gct gaa aaa gcc ttt ttg gaa gaa cga gat 579Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp170 175 180 185aag tgt gag gaa gaa ctg gcc gcg ttt ttt gcc ggc atc ata gaa gaa 627Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu190 195 200aag cga aac aaa ccg gaa cag gat att att tct att tta gtg gaa gcg 675Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala205 210 215gaa gaa aca ggc gag aag ctg tcc ggt gaa gag ctg att ccg ttg tgc 723Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Leu Cys220 225 230acg ctg ctg ctg gtg gcc gga aat gaa acc act aca aac ctg att tca 771Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser235 240 245aat gcg atg ttc agc ata tta gaa acg cca ggc gtt tac gag gaa ctg 819ASh Ala Met Phe Ser Ile Leu Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu250 255 260 265cgc agc cat cct gaa ctg atg ccc cag gca gtg gag gaa gcc ttg cgt 867Arg Ser His Pro Glu Leu Met Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg270 275 280ttc aga gcg ccg gcc ccg gtt ttg agg cgc att gcc aag cgg gat acg 915Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr285 290 295gag atc ggg ggg cac ctg att aaa gaa ggt gat acg gtt ttg gcg ttt 963Glu Ile Gly Gly His Leu Ile Lys Glu Gly Asp Thr Val Leu Ala Phe300 305 310gtg gca tcg gca aat cgt gat gaa gca aag ttt gac aga ccg cac atg 1011Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met315 320 325ttt gat atc cgc cgc cat ccc aat ccg cat att gcg ttt ggc cac ggc 1059Phe Asp Ile Arg Arg His Pro Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly330 335 340 345atc cat ttt tgc ctt ggg gcc ccg ctt gcc cgt ctt gaa gca aat atc 1107Ile His Phe Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile350 355 360gcg tta acg tct ttg att tct gct ttt cct cat atg gag tgc gtc agt 1155Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser365 370 375atc act ccg att gaa aac agt gtg ata tac gga tta aag agc ttc cgt 1203Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg380 385 390gtg aaa atg taaggatcc1221Val Lys Met395<210>45<211>396<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌<400>45Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Pro Arg Ala Leu Leu Asn1 5 10 15Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser20 25 30Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp35 40 45Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu50 55 60Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser65 70 75 80Ile Ile Ser Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val85 90 95Asn Lys Ala Phe Thr Pro ArgAla Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile100105 110Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu115 120 125Phe Asp Leu Val His Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile130 135 140Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phe Lys Ala145 150 155 160Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala165 170 175Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala180 185 190Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln195 200 205Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu210 215 220Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly225 230 235 240Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Phe Ser Ile Leu245 250 255Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met260 265 270Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val275 280 285Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile290 295 300Lys Glu Gly Asp Thr Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp305 310 315 320Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro325 330 335Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala340 345 350Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser355 360 365Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser370 375 380Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met385 390 39權(quán)利要求
1.芽孢桿菌屬微生物來源的蛋白質(zhì)，且具有這樣的活性從通式(I-a)表示的化合物，以下叫做化合物(I-a)， 或通式(I-b)表示的化合物(I-a)的內(nèi)酯體，以下叫做化合物(I-b)， 生成通式(II-a)表示的化合物，以下叫做化合物(II-a)， 或通式(II-b)表示的化合物(II-a)的內(nèi)酯體，以下叫做化合物(II-b)， 通式(I-a)中，R1表示氫原子，取代或未取代的烷基或堿金屬，R2表示取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳香基；通式(I-b)中，R2同前；通式(II-a)中，R1和R2同前；通式(II-b)中，R2同前。
2.芽孢桿菌屬微生物來源的蛋白質(zhì)，且具有這樣的活性從通式(III-a)表示的化合物，以下叫做化合物(III-a)， 或通式(III-b)表示的化合物(III-a)的內(nèi)酯體，以下叫做化合物(III-b)， 生成通式(IV-a)表示的化合物，以下叫做化合物(IV-a)， 或通式(IV-b)表示的化合物(IV-a)的內(nèi)酯體，以下叫做化合物(IV-b)， 通式(III-a)中，R1表示氫原子，取代或未取代的烷基或堿金屬，R2表示取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳香基；通式(III-b)中，R2同前；通式(IV-a)中，R1和R2同前；通式(IV-b)中，R2同前。
3.芽孢桿菌屬微生物來源的蛋白質(zhì)，且具有這樣的活性從通式(V-a)表示的化合物，以下叫做化合物(V-a)， 或通式(V-b)表示的化合物(V-a)的內(nèi)酯體，以下叫做化合物(V-b)， 生成通式(VI-a)表示的化合物，以下叫做化合物(VI-a)， 或通式(VI-b)表示的化合物(VI-a)的內(nèi)酯體，以下叫做化合物(VI-b)， 通式(V-a)中，R1表示氫原子，取代或未取代的烷基或堿金屬；通式(VI-a)中，R1同前。
4.芽孢桿菌屬微生物來源的蛋白質(zhì)，且具有這樣的活性從通式(VII-a)表示的化合物，以下叫做化合物(VII-a)， 或通式(VII-b)表示的化合物(VII-a)的內(nèi)酯體，以下叫做化合物(VII-b)， 生成通式(VIII-a)表示的化合物，以下叫做化合物(VIII-a)， 或通式(VIII-b)表示的化合物(VIII-a)的內(nèi)酯體，以下叫做化合物(VIII-b)， 通式(VII-a)中，R1表示氫原子，取代或未取代的烷基或堿金屬；通式(VIII-a)中，R1同前。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的蛋白質(zhì)，其中芽孢桿菌屬的微生物選自枯草芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，側(cè)孢芽孢桿菌，球形芽孢桿菌，短小芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，蠟樣芽孢桿菌，栗褐芽孢桿菌，短芽孢桿菌，蜂房芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌和浸麻芽孢桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的蛋白質(zhì)，其中芽孢桿菌屬的微生物選自枯草芽孢桿菌ATCC6051株，巨大芽孢桿菌ATCC10778株，巨大芽孢桿菌ATCC11562株，巨大芽孢桿菌ATCC13402株，巨大芽孢桿菌ATCC15177株，巨大芽孢桿菌ATCC15450株，巨大芽孢桿菌ATCC19213株，巨大芽孢桿菌IAM1032株，側(cè)孢芽孢桿菌ATCC4517株，短小芽孢桿菌FERM BP-2064株，栗褐芽孢桿菌ATCC14574株，短芽孢桿菌NRRL B-8029株，蜂房芽孢桿菌ATCC6344株，環(huán)狀芽孢桿菌NTCT-2610株及浸麻芽孢桿菌NCIMB-9368株。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的蛋白質(zhì)，其中芽孢桿菌屬的微生物選自芽孢桿菌屬FERM BP-6029株和芽孢桿菌屬FERM BP-6030株。
8.一種蛋白質(zhì)，它具有序列號1記載的氨基酸序列。
9.一種蛋白質(zhì)，它具有序列號1記載的氨基酸序列中1個以上的氨基酸發(fā)生缺失、置換或添加了的氨基酸序列，且具有從化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)的活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)，它具有序列號42或45記載的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)，其中化合物(I-a)是化合物(III-a)，化合物(I-b)是化合物(III-b)，化合物(II-a)是化合物(IV-a)，化合物(II-b)是化合物(IV-b)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)，其中化合物(I-a)是化合物(V-a)，化合物(I-b)是化合物(V-b)，化合物(II-a)是化合物(VI-a)，化合物(II-b)是化合物(VI-b)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)，其中化合物(I-a)是化合物(VII-a)，化合物(I-b)是化合物(VII-b)，化合物(II-a)是化合物(VIII-a)，化合物(II-b)是化合物(VIII-b)。
14.一種分離純化得到的DNA，它具有序列號2記載的堿基序列。
15.一種分離純化得到的DNA，它能與權(quán)利要求14所述的DNA在嚴格條件下進行雜交，且能編碼具有從化合物(I-a)或化合物(I-b)生成化合物(II-a)或化合物(II-b)活性的蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的DNA，它具有選自序列號41、43及44記載的堿基序列構(gòu)成的組的堿基序列。
17.一種分離純化得到的DNA，編碼權(quán)利要求1-12中任一項所述的蛋白質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的DNA，其中化合物(I-a)是化合物(III-a)，化合物(I-b)是化合物(III-b)，化合物(II-a)是化合物(IV-a)，化合物(II-b)是化合物(IV-b)。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的DNA，其中化合物(I-a)是化合物(V-a)，化合物(I-b)是化合物(V-b)，化合物(II-a)是化合物(VI-a)，化合物(II-b)是化合物(VI-b)。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的DNA，其中化合物(I-a)是化合物(VII-a)，化合物(I-b)是化合物(VII-b)，化合物(II-a)是化合物(VIII-a)，化合物(II-b)是化合物(VIII-b)。
21.重組DNA載體，它包含權(quán)利要求14-20中任一項所述的DNA。
22.一種轉(zhuǎn)化體，是將權(quán)利要求21所述的重組DNA載體導入宿主細胞而得到的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化體，它屬于選自埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬和鏈霉菌屬的微生物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的轉(zhuǎn)化體，它屬于選自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌、美棒桿菌和淺青紫鏈霉菌的微生物。
25.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制備方法，其特征在于，用權(quán)利要求22-24中任一項所述的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(I-a)或化合物(I-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(II-a)或化合物(II-b)在水性介質(zhì)中生成、蓄積，然后從該水性介質(zhì)中提取化合物(II-a)或化合物(II-b)。
26.化合物(IV-a)或化合物(IV-b)的制備方法，其特征在于，用權(quán)利要求22-24中任一項所述的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(III-a)或化合物(III-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(IV-a)或化合物(IV-b)在水性介質(zhì)中生成、蓄積，然后從該水性介質(zhì)中提取化合物(IV-a)或化合物(IV-b)。
27.化合物(VI-a)或化合物(VI-b)的制備方法，其特征在于，用權(quán)利要求22-24中任一項所述的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(V-a)或化合物(V-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(VI-a)或化合物(VI-b)在水性介質(zhì)中生成、蓄積，然后從該水性介質(zhì)中提取化合物(VI-a)或化合物(VI-b)。
28.化合物(VIII-a)或化合物(VIII-b)的制備方法，其特征在于，用權(quán)利要求22-24中任一項所述的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(VII-a)或化合物(VII-b)存在于水性介質(zhì)中，并使化合物(VIII-a)或化合物(VIII-b)在水性介質(zhì)中生成、蓄積，然后從該水性介質(zhì)中提取化合物(VIII-a)或化合物(VIII-b)。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的制備方法，其中化合物(II-b)是由化合物(II-a)形成內(nèi)酯而得到的。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的制備方法，其中化合物(II-a)是使化合物(II-b)的內(nèi)酯開環(huán)而得到的。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的制備方法，其中化合物(IV-b)是由化合物(IV-a)形成內(nèi)酯而得到的。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的制備方法，其中化合物(IV-a)是使化合物(IV-b)的內(nèi)酯開環(huán)而得到的。
33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的制備方法，其中化合物(VI-b)是由化合物(VI-a)形成內(nèi)酯而得到的。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的制備方法，其中化合物(VI-a)是使化合物(VI-b)的內(nèi)酯開環(huán)而得到的。
35.根據(jù)權(quán)利要求28所述的制備方法，其中化合物(VIII-b)是由化合物(VIII-a)形成內(nèi)酯而得到的。
36.根據(jù)權(quán)利要求28所述的制備方法，其中化合物(VIII-a)是使化合物(VIII-b)的內(nèi)酯開環(huán)而得到的。
37.根據(jù)權(quán)利要求25-28中任一項所述的制備方法，其中轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物的處理物是選自培養(yǎng)菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的酶處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機械磨碎物、該菌體的溶劑處理物等菌體處理物，菌體的蛋白級分物，菌體及菌體處理物的固定化物的處理物。
38.權(quán)利要求1-12中任一項所述蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求22-24中任一項所述的轉(zhuǎn)化體，讓權(quán)利要求1-12中任一項所述的蛋白質(zhì)在培養(yǎng)物中生成、蓄積，然后從培養(yǎng)物中提取該蛋白質(zhì)。
39.相當于選自序列號2、41、43及44記載的堿基序列構(gòu)成的組的堿基序列中連續(xù)5-60個堿基構(gòu)成的序列的寡核苷酸，或相當于與該寡核苷酸互補的序列的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有羥化活性的蛋白質(zhì),它能羥化來源于芽孢桿菌屬微生物且用通式(I－a),(式中,R
文檔編號C12N1/21GK1345371SQ00805629
公開日2002年4月17日 申請日期2000年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
發(fā)明者遠藤博文, 米谷良之, 溝口寬, 橋本信一, 尾崎明夫 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社