專利名稱：一種人的血清抑制基因的制作方法
眾所周知，細(xì)胞增殖調(diào)控與腫瘤，骨質(zhì)增生，傷口愈合等疾病和人類健康問題緊密聯(lián)系，是探討這一類疾病的發(fā)病機(jī)制和檢測治療的基礎(chǔ)。然而目前雖然了解某些基因與細(xì)胞的增殖調(diào)控有關(guān)，如CDK基因家族，cyclin基因家族，CDI基因家族，蛋白激酶，泛素依賴的蛋白水解酶等。但細(xì)胞增殖控制的機(jī)制，或者說控制細(xì)胞的開關(guān)并不清楚，人們還不能隨心所欲的改變細(xì)胞生長和分化。繼續(xù)克隆一些新的與細(xì)胞生長控制有關(guān)的基因，探討其功能，對了解細(xì)胞周期控制機(jī)制，并應(yīng)用與疾病的診斷治療是及其重要的。
細(xì)胞增殖過程分為四個時期，即G1，S，G2和M期。G1期是細(xì)胞增殖前期，細(xì)胞完成一次增殖即進(jìn)入G1期，如果細(xì)胞不進(jìn)入下一次增殖，即傳入G0期(即休止期)。如果細(xì)胞啟動了增殖程序，細(xì)胞從G1期轉(zhuǎn)入S期，進(jìn)行DNA的復(fù)制。完成DNA復(fù)制后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入G2期，進(jìn)行分裂前的準(zhǔn)備。完成分裂前的準(zhǔn)備后從G2期轉(zhuǎn)入M期，細(xì)胞進(jìn)行分裂，一分為二，由一個細(xì)胞分裂成兩個細(xì)胞。分裂完成后又進(jìn)入G1期。整個分裂周期有兩個控制位點，一是G1/S過度，二是G2/M過度。一般認(rèn)為G1/S過度點最關(guān)鍵，G2/M過度點的作用是保證細(xì)胞完成DNA復(fù)制后才進(jìn)行M期。目前還不知道哪一個是控制G1/S的關(guān)鍵基因，或者說至關(guān)重要的基因。
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠控制G1/S過度點，并對了解細(xì)胞周期控制的機(jī)制，對腫瘤診斷與治療有重要的參考價值的人的血清抑制基因。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的血清是大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的必須成份，它含有刺激細(xì)胞生長的細(xì)胞因子。無血清時，細(xì)胞處于G0期，停止增殖。在培養(yǎng)基中加入血清因子，細(xì)胞即可開始增殖，所以控制血清可以控制細(xì)胞的增殖。通過比較血清培養(yǎng)細(xì)胞和無血清培養(yǎng)細(xì)胞中基因表達(dá)的差異，是克隆控制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的有效途徑。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫資料查詢，序列的W95909用于DNA芯片檢測結(jié)果顯示(見


圖1)，該序列在血清饑餓后，恢復(fù)血清培養(yǎng)30分鐘和12小時，表達(dá)水平驟然下降。根據(jù)細(xì)胞周期推斷，該基因的表達(dá)是處于G1/S期和G2/M期過度控制點。根據(jù)這一線索，通過計算機(jī)克隆及PCR擴(kuò)增、重組克隆、測序等技術(shù)，獲得了該基因。再通過蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源比較，與線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子有29％的同源性，由此可以判斷該基因是一個轉(zhuǎn)錄終止因子。人的血清抑制基因(Si-2)即是這樣克隆得到的基因。Si-2基因全長1.478Kb，蛋白質(zhì)編碼框365個氨基酸殘基。其氨基酸序列和核苷酸序列分別如下MLWKLLLRSQSCRLCSFRKMRSPPKYRPFLACFTYTTDKQSSKENTRTVEKLYKCSVDIRKIRRLKGWVLLEDETYVEEIANILQELGADETAVASILERCPEAIVCSPTAVNTQRKLWQLVCKNEEELIKLIEQFPESFFTIKDQENQKLNVQFFQELGLKNVVISRLLTAAPNVFHNPVEKNKQMVRILQESYLDVGGSEANMKVWLLKLLSQNPFILLNSPTAIKETLEFLQEQGFTSFEILQLLSKLKGFLFQLCPRSIQNSISFSKNAFKCTDHDLKQLVLKCPALLYYSVPVLEERMQGLLREGISIAQIRETPMVLELTPQIVQYRIRKLNSSGYRIKDGHLANLNGSKKEFEANFGKIQAKKVRP1 ggtgctgaga actgtcggga gcttcttgag accgaggacc gaaatcccgg ctccaggcct61 cggggactgc ggactgtggg gaggctggcc ggagagagag ggaaggacgg ggcctggccc121 ccgggactcc ctgtgccttg cttggagctg acgccgacgg ggaactgaca agatcacatt181 ttgagaagaa gttggaaaga atcccaagtg gatgaactga atatctggat gaggacaaga241 tctgtgggga gagactgtaa gatagaatga gtccatttaa gtcccaggac ggtggaaact301 agctagtaga ttgcagccat gttgtggaag ctgctgctga gatcccagtc ctgcaggctg361 tgttctttca gaaagatgcg atcacctcca aaatacagac ctttcttagc atgcttcacc421 tatacaactg ataaacagtc gagcaaagaa aatacaagaa cagtggaaaa gctctataaa
481 tgttcagttg acattaggaa aattcgtaga ttaaaaggat gggtactttt agaggatgaa541 acctatgttg aagaaattgc gaatatttta caagaactag gtgccgatga gactgctgta601 gccagtattt tggaacgctg cccggaagca attgtctgta gtccaaccgc tgttaacacc661 cagagaaaac tctggcagtt ggtctgcaaa aatgaggaag agttaatcaa gttaatagag721 cagtttccag aatctttctt tactattaaa gaccaagaga accagaagct gaatgttcag781 ttctttcaag agttgggact aaaaaatgtg gtcattagca gacttttgac agctgcacct841 aatgtttttc ataatcctgt tgagaagaat aagcaaatgg taagaattct ccaagagagt901 tatctagatg taggtggctc tgaggccaac atgaaagttt ggctactaaa attgttaagc961 caaaacccat ttattttgtt aaattctccc acagctataa aggaaacact agaatttctc1021 caggagcaag gtttcaccag ctttgaaatt ctccagcttc tatccaaact caaaggattt1081 ctttttcaac tttgcccaag aagtatacag aatagtattt ccttctctaa aaatgctttt1141 aaatgcacag atcatgacct gaagcaatta gttttgaaat gtcctgccct tttatattat1201 tctgttccag ttttagaaga gagaatgcaa ggattattga gagaaggaat ttccatagct1261 cagataagag agacgccaat ggttcttgaa ttaacaccac agatagtaca gtacaggata1321 aggaaactga attcctcagg ctacagaata aaggatggac atctagcaaa tctaaatgga1381 tcaaaaaaag agtttgaagc taattttggc aaaattcagg ccaaaaaagt aaggccatta1441 tttaaccctg tggcaccatt aaatgttgaa gaatgaca附
圖1為Si-2基因同源序列W95909在血清饑餓恢復(fù)后血清培養(yǎng)的芯片檢測結(jié)果。圖中從左至右為血清饑餓，恢復(fù)血清15分鐘，30分鐘，1小時，2小時，4小時，6小時，8小時，12小時，16小時，20小時，24小時的表達(dá)結(jié)果。綠色為表達(dá)降低，紅色為表達(dá)增強(qiáng)，黑色為表達(dá)不變。
附圖2為Si-2基因蛋白質(zhì)序列與人線線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子的同源性比較。
附圖3為Si-2基因蛋白質(zhì)序列與海膽粒體轉(zhuǎn)錄終止因子的同源性比較。
附圖4、附圖4(續(xù))為Si-2基因測序圖譜。
附圖5、附圖5(續(xù))為Si-2基因測序結(jié)果。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述本實驗室近年來一直從事細(xì)胞周期調(diào)控研究，并通過血清饑餓處理進(jìn)行細(xì)胞基因表達(dá)的差異比較克隆新的細(xì)胞周期調(diào)控基因。通過網(wǎng)絡(luò)查詢，發(fā)現(xiàn)Stanford大學(xué)DavidBotstein小組的血清處理細(xì)胞的芯片檢查結(jié)果中，有一個EST序列的表達(dá)水平在血清饑餓后恢復(fù)血清培養(yǎng)30分中時，驟然下降，這正與本實驗室近年來希望尋找的基因的表達(dá)模式一致。根據(jù)這一信息，通過計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)這是一測序工程小組測出的300多堿基的序列，其功能并不知道。我們采用計算機(jī)與網(wǎng)絡(luò)資料查詢，并通用的方法進(jìn)行計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)克隆，獲得一個全長1.478Kb的序列，在人類基因組中第12號染色體短臂24.1位點(12q24.1)找到了全部序列。于是，通過PCR擴(kuò)增獲，得到了該序列的全部編碼框(見圖4、圖5、)。該序列已被GenBank收錄。該基因的氨基酸序列和核苷酸序列分別如下MLWKLLLRSQSCRLCSFRKMRSPPKYRPFLACFTYTTDKQSSKENTRTVEKLYKCSVDIRKIRRLKGWVLLEDETYVEEIANILQELGADETAVASILERCPEAIVCSPTAVNTQRKLWQLVCKNEEELIKLIEQFPESFFTIKDQENQKLNVQFFQELGLKNVVISRLLTAAPNVFHNPVEKNKQMVRILQESYLDVGGSEANMKVWLLKLLSQNPFILLNSPTAIKETLFFLQEQGFTSFEILQLLSKLKGFLFQLCPRSIQNSISFSKNAFKCTDHDLKQLVLKCPALLYYSVPVLEERMQGLLREGISIAQIRETPMVLELTPQIVQYRIRKLNSSGYRIKDGHLANLNGSKKEFEFAFGKIQAKKVRP1 ggtgctgaga actgtcggga gcttcttgag accgaggacc gaaatcccgg ctccaggcct
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本發(fā)明的人的血清抑制基因具有能夠控制G1/S過度點的作用，對了解細(xì)胞周期控制的機(jī)制有重要的參考價值，具有可應(yīng)用于腫瘤診斷與治療等優(yōu)點。
權(quán)利要求
一種人的血清抑制基因，其特征在于該血清抑制基因全長1.478Kb，蛋白質(zhì)編碼框為365個氨基酸殘基；其氨基酸序列和核苷酸序列分別如下MLWKLLLRSQSCRLCSFRKMRSPPKYRPFLACFTYTTDKQSSKENTRTVEKLYKCSVDIRKIRRLKGWVLLEDETYVEEIANILQELGADETAVASILERCPEAIVCSPTAVNTQRKLWQLVCKNEEELIKLIEQFPESFFTIKDQENQKLNVQFFQELGLKNVVISRLLTAAPNVFHNPVEKNKQMVRILQESYLDVGGSEANMKVWLLKLLSQNPFILLNSPTAIKETLEFLQEQGFTSFEILQLLSKLKGFLFQLCPRSIQNSISFSKNAFKCTDHDLKQLVLKCPALLYYSVPVLEERMQGLLREGISIAQIRETPMVLELTPQIVQYRIRKLNSSGYRIKDGHLANLNGSKKEFEANFGKIQAKKVRP1 ggtgctgaga actgtcggga gcttcttgag accgaggacc gaaatcccgg ctccaggcct61 cggggactgc ggactgtggg gaggctggcc ggagagagag ggaaggacgg ggcctggccc121 ccgggactcc ctgtgccttg cttggagctg acgccgacgg ggaactgaca agatcacatt181 ttgagaagaa gttggaaaga atcccaagtg gatgaactga atatctggat gaggacaaga241 tctgtgggga gagactgtaa gatagaatga gtccatttaa gtcccaggac ggtggaaact301 agctagtaga ttgcagccat gttgtggaag ctgctgctga gatcccagtc ctgcaggctg361 tgttctttca gaaagatgcg atcacctcca aaatacagac ctttcttagc atgcttcacc421 tatacaactg ataaacagtc gagcaaagaa aatacaagaa cagtggaaaa gctctataaa481 tgttcagttg acattaggaa aattcgtaga ttaaaaggat gggtactttt agaggatgaa541 acctatgttg aagaaattgc gaatatttta caagaactag gtgccgatga gactgctgta601 gccagtattt tggaacgctg cccggaagca attgtctgta gtccaaccgc tgttaacacc661 cagagaaaac tctggcagtt ggtctgcaaa aatgaggaag agttaatcaa gttaatagag721 cagtttccag aatctttctt tactattaaa gaccaagaga accagaagct gaatgttcag781 ttctttcaag agttgggact aaaaaatgtg gtcattagca gacttttgac agctgcacct841 aatgtttttc ataatcctgt tgagaagaat aagcaaatgg taagaattct ccaagagagt901 tatctagatg taggtggctc tgaggccaac atgaaagttt ggctactaaa attgttaagc961 caaaacccat ttattttgtt aaattctccc acagctataa aggaaacact agaatttctc1021 caggagcaag gtttcaccag ctttgaaatt ctccagcttc tatccaaact caaaggattt1081 ctttttcaac tttgcccaag aagtatacag aatagtattt ccttctctaa aaatgctttt1141 aaatgcacag atcatgacct gaagcaatta gttttgaaat gtcctgccct tttatattat1201 tctgttccag ttttagaaga gagaatgcaa ggattattga gagaaggaat ttccatagct1261 cagataagag agacgccaat ggttcttgaa ttaacaccac agatagtaca gtacaggata1321 aggaaactga attcctcagg ctacagaata aaggatggac atctagcaaa tctaaatgga1381 tcaaaaaaag agtttgaagc taattttggc aaaattcagg ccaaaaaagt aaggccatta1441 tttaaccctg tggcaccatt aaatgttgaa gaatgaca
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人的血清抑制基因,屬生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用計算機(jī)與網(wǎng)絡(luò)資料查詢,并按現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行計算機(jī)克隆,獲得一個全長1.478Kb的序列,在人類基因組中第12號染色體短臂24.1位點(12q24.1)找到了全部序列,并通過PCR擴(kuò)增獲,得到了該序列全部編碼序列。人的血清抑制基因(Si－1)具有能夠控制G1/S過度點的作用,對了解細(xì)胞周期控制的機(jī)制有重要的參考價值,具有可應(yīng)用于腫瘤診斷與治療等優(yōu)點。
文檔編號C12N15/11GK1361283SQ00136900
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月25日
發(fā)明者譚德勇, 何云剛, 賴建華, 錢偉, 余敏 申請人:云南大學(xué)