專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)天然β－胡蘿卜素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法，更確切地說(shuō)是涉及一種采用微生物菌種發(fā)酵生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的方法。
在現(xiàn)有技術(shù)中，中國(guó)專利CN1193048A(申請(qǐng)?zhí)?8111199.8，申請(qǐng)日1998年3月23日)公開(kāi)了一種發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法，該方法采用將孢子接種在氣升式發(fā)酵罐中培養(yǎng)絲狀真菌發(fā)酵制備β-胡蘿卜素，包括一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)及發(fā)酵等工序，其特點(diǎn)是將代謝產(chǎn)生β-胡蘿卜素的微生物菌種在一定條件下培養(yǎng)形成大量孢子，用氣升式發(fā)酵罐作為培養(yǎng)種子和發(fā)酵的生物反應(yīng)器，發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生β-胡蘿卜素。但是產(chǎn)生β-胡蘿卜素的菌種分正負(fù)兩種菌株，上述方法在種子培養(yǎng)過(guò)程中是分別在兩個(gè)反應(yīng)器中先進(jìn)行正、負(fù)菌株的一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)種子培養(yǎng)，然后將分別培養(yǎng)的正、負(fù)菌株的種子液在發(fā)酵工序中接入氣升式生物反應(yīng)器中混合培養(yǎng)，最終發(fā)酵產(chǎn)生β-胡蘿卜素。所以，上述方法在種子培養(yǎng)過(guò)程中就需用兩只氣升式發(fā)酵罐分別培養(yǎng)正、負(fù)三孢布拉霉菌株，增加了設(shè)備投資，生產(chǎn)操作步驟也較繁復(fù)。
日本《食品と科學(xué)》1994年別冊(cè)報(bào)導(dǎo)了一種β-胡蘿卜素的發(fā)酵方法，該方法正、負(fù)菌株先在27℃下斜面培養(yǎng)7天，正、負(fù)菌株再分別在2升三角燒瓶中26℃下?lián)u床培養(yǎng)48小時(shí)，然后再將正、負(fù)菌株接入170升發(fā)酵罐中混合種子培養(yǎng)40小時(shí)，最終在800升發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)185小時(shí)，產(chǎn)生β-胡蘿卜素。
另一方面，國(guó)內(nèi)外目前通用的攪拌式發(fā)酵罐及種子罐的攪拌槳葉都是渦輪式槳葉，存在剪切力大而混合性能差的特點(diǎn)，易將絲狀真菌的菌絲打斷，造成菌絲體損傷，生物量減少，使發(fā)酵β-胡蘿卜素的產(chǎn)量降低。另外，現(xiàn)有發(fā)酵罐中的上下層攪拌都為渦輪式槳葉，攪拌時(shí)缺少軸向混合，造成發(fā)酵液的混合不均勻，影響發(fā)酵水平。而中國(guó)專利CN1193048A采用的氣升式發(fā)酵罐。由于考慮空壓機(jī)送出壓縮空氣壓力可適當(dāng)降低而減少空壓機(jī)電耗，而攪拌槳葉采用混合性能好而能耗低的寬葉推進(jìn)式，故采用上、中層為寬葉推進(jìn)式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的組合式攪拌槳葉的攪拌式發(fā)酵罐。
本發(fā)明的目的是將種子培養(yǎng)對(duì)正、負(fù)菌株分別在兩只種子罐的分別培養(yǎng)，變?yōu)檎?、?fù)菌株接入一只種子罐中進(jìn)行混合培養(yǎng)，這樣可以減少一半種子罐的數(shù)量，即簡(jiǎn)化了種子制備工藝，減少了雜菌污染的機(jī)會(huì)，又降低了設(shè)備投資。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將種子罐和發(fā)酵罐的攪拌槳葉改進(jìn)為上、中層槳葉為寬葉推動(dòng)式槳葉，下層槳葉為渦輪式槳葉的組合式槳葉，這樣降低了攪拌槳葉對(duì)菌絲體的剪切傷害，增加了氣液接觸。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的方法，其生產(chǎn)步驟包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵等工序，所述的種子培養(yǎng)是將正、負(fù)兩種菌株接入同一只種子罐中進(jìn)行混合培養(yǎng)。
本發(fā)明所述的方法，所述的種子培養(yǎng)包括一級(jí)種子培養(yǎng)或一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)種子培養(yǎng)或一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)和三級(jí)種子培養(yǎng)。
本發(fā)明所述的方法，在種子培養(yǎng)工序中，進(jìn)行種子培養(yǎng)時(shí)接入的正菌株與負(fù)菌株的比例是1∶1～1∶200，較好的比例是1∶1～1∶20。
能夠生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的微生物有多種，其中以三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)的性能最優(yōu)，是國(guó)際上公認(rèn)的實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)β-胡蘿卜素的好菌種。三孢布拉霉菌屬于真菌界真菌門(mén)(Fungi)，接合菌亞門(mén)，毛霉目(Order Mucorales)，笄霉科(Family Choanephoraceae)，布氏笄霉屬(Genus Blakeslea)，三孢布氏笄霉(B.trispora Thaxter)。三孢布拉霉生長(zhǎng)迅速，能產(chǎn)生發(fā)達(dá)的長(zhǎng)菌絲，菌絲白色，為長(zhǎng)管單細(xì)胞，沒(méi)有隔膜，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含多個(gè)細(xì)胞核，不產(chǎn)生假根，是單細(xì)胞低等真菌。生長(zhǎng)過(guò)程表現(xiàn)為菌絲的延長(zhǎng)和細(xì)胞核的裂殖增多及細(xì)胞質(zhì)的增加。三孢布拉霉既能無(wú)性繁殖，也能有性繁殖。無(wú)性繁殖形成孢子囊和孢囊孢子；有性繁殖屬異宗配合，由來(lái)源不同的“+”、“-”菌的菌絲體相互接觸時(shí)，發(fā)生原生質(zhì)和細(xì)胞核的結(jié)合，形成接合孢子，最后減數(shù)分裂形成單倍的營(yíng)養(yǎng)體。
本發(fā)明所述的方法，發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的菌株即為三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)，分正、負(fù)兩種菌株，保藏于上?；ぱ芯吭壕N保藏處，菌號(hào)為f5H，(正菌株)和f6R(負(fù)菌株)。
本發(fā)明所述的方法，所述的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成為粕餅粉5～15％(重量)，玉米粉3～8％(重量)，維生素B13～10ppm，培養(yǎng)基pH6.5～7.5，種子培養(yǎng)溫度26～28℃，培養(yǎng)時(shí)間16～24小時(shí)。
本發(fā)明所述的方法，所述的發(fā)酵工序的培養(yǎng)基組成為淀粉5～8％(重量)，粕餅粉1.2～2.8％(重量)，植物油5.1～7.0％(重量)，磷酸二氫鉀0.04～0.09％(重量)，硫酸錳0.01～0.06％(重量)，維生素B13～10ppm，非離子表面活性劑烷基酚聚氧乙烯醚0.05～0.20％(重量)。培養(yǎng)溫度26～28℃，培養(yǎng)時(shí)間120～168小時(shí)。
本發(fā)明所述的方法，所述的種子培養(yǎng)或發(fā)酵工序中使用的種子罐或發(fā)酵罐的攪拌槳葉是上、中層為寬葉推進(jìn)式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的組合式攪拌槳葉。
目前，國(guó)內(nèi)外通用的攪拌槳葉型式一般上、下層槳葉均采用渦輪式攪拌槳葉，但渦輪式攪拌槳葉的剪切力大，易將絲狀真菌的菌絲體切斷，而三孢布拉霉菌絲在發(fā)酵長(zhǎng)大過(guò)程中要盡量減少對(duì)菌絲體的剪切；另一方面，上、下層都是渦輪式攪拌槳葉，使發(fā)酵罐中的發(fā)酵液缺少軸向混合。因此，本發(fā)明的種子罐或發(fā)酵罐的攪拌槳葉均采用上、中層為寬葉推進(jìn)式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的混合式攪拌槳葉，既可避免攪拌槳葉對(duì)菌絲體的過(guò)度剪切，又可防止發(fā)酵罐中發(fā)酵液上、下層短路，增加了氣液接觸時(shí)間，從而提高了種子罐或發(fā)酵罐的傳質(zhì)性能和氣液接觸效率，使發(fā)酵液混合得更為均勻。
本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)一、本發(fā)明的天然β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法，在種子培養(yǎng)工序采用將正、負(fù)菌株在一只種子罐中混合培養(yǎng)的方式，種子罐罐數(shù)可減少一半，簡(jiǎn)化了操作工藝，降低了設(shè)備投資和操作費(fèi)用及生產(chǎn)成本，而且減少了因設(shè)備多而造成染菌機(jī)會(huì)增加的缺點(diǎn)，發(fā)酵水平可達(dá)2.0克/升以上。二、本發(fā)明的種子罐或發(fā)酵罐的攪拌槳葉采用上、中層為寬葉推進(jìn)式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的混合式攪拌槳葉，克服了現(xiàn)有發(fā)酵罐中攪拌槳葉對(duì)菌絲體的過(guò)度剪切，影響菌絲體生長(zhǎng)，使發(fā)酵β-胡蘿卜素產(chǎn)量降低的缺陷，而且本發(fā)明的混合式攪拌槳葉提高了發(fā)酵液的傳質(zhì)性能和氣液接觸效率。
下面將通過(guò)本發(fā)明的具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1(1)斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基的組成及配制方法如下去皮土豆20g，加水100mL，煮沸20分鐘，過(guò)濾，濾液補(bǔ)足100mL，加葡萄糖1.5g，蛋白胨1g，瓊脂2g，維生素B15ppm，pH自然，115℃滅菌20分鐘。
將保藏于上?；ぱ芯吭壕N保藏處，菌號(hào)為f5H(正菌株)、f6R(負(fù)菌株)的三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)正、負(fù)菌株砂土管菌種分別接種于斜面培養(yǎng)基上，在27℃條件下培養(yǎng)3天，即可接入種子液。
(2)一級(jí)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基的組成為粕餅粉10％(重量)，玉米粉5.5％(重量)，維生素B15ppm，調(diào)節(jié)pH6.5～7.5，121℃滅菌30分鐘。
將斜面培養(yǎng)的三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)正菌株或負(fù)菌株的菌絲或孢子洗脫液按“+”、“-”菌株比例1∶10接入已加入種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26～28℃，搖床轉(zhuǎn)速230rpm，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)。
(3)二級(jí)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組成同一級(jí)種子培養(yǎng)。將一級(jí)種子液接入二級(jí)種子罐，種子罐的容積為100L，二級(jí)種子培養(yǎng)在27℃下培養(yǎng)24小時(shí)，種子罐攪拌轉(zhuǎn)速250rpm，通風(fēng)量1V/V·m。
(4)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成為淀粉6.0％(重量)，粕餅粉1.4％(重量)，植物油6％(重量)，磷酸二氫鉀0.06％(重量)，曲拉通(Triton)0.12％(重量)，維生素B13ppm，硫酸錳0.03％(重量)。
將二級(jí)種子液接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐的容積為1m3，在溫度約27℃，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通風(fēng)量為1V/V·m下，經(jīng)過(guò)120小時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)，β-胡蘿卜素的發(fā)酵水平為1.877g/L。
種子罐或發(fā)酵罐的攪拌槳葉采用上、中層為寬葉推進(jìn)式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的混合式攪拌槳。
實(shí)施例2(1)斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1。
(2)一級(jí)種子培養(yǎng)除種子培養(yǎng)基的組成為粕餅粉5％(重量)，玉米粉3％(重量)，維生素B13ppm，接入“+”、“-”菌株比例是1∶20，培養(yǎng)時(shí)間16小時(shí)外，其它同實(shí)施例1。
(3)二級(jí)種子培養(yǎng)除培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)時(shí)間同一級(jí)種子培養(yǎng)外，其它同實(shí)施例1。
(4)發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng)基組成為淀粉5％(重量)，粕餅粉1.2％(重量)，植物油5.1％(重量)，磷酸二氫鉀0.04％(重量)，曲拉通(Triton)0.05％(重量)，維生素B15ppm，硫酸錳0.01％(重量)。
將二級(jí)種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵罐，在溫度約27℃，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通風(fēng)量為1V/V·m下，經(jīng)過(guò)144小時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)，β-胡蘿卜素的發(fā)酵水平為1.92g/L。
實(shí)施例3(1)斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1。
(2)一級(jí)種子培養(yǎng)除種子培養(yǎng)基的組成為粕餅粉15％(重量)，玉米粉8％(重量)，維生素B110ppm，接入“+”、“-”菌株比例是1∶1，培養(yǎng)時(shí)間20小時(shí)外，其它同實(shí)施例1。
(3)二級(jí)種子培養(yǎng)除培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)時(shí)間同一級(jí)種子培養(yǎng)外，其它同實(shí)施例1。
(4)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成為淀粉8％(重量)，粕餅粉2.8％(重量)，植物油7.0％(重量)，磷酸二氫鉀0.09％(重量)，曲拉通(Triton)0.20％(重量)，維生素B110ppm，硫酸錳0.06％(重量)。
將二級(jí)種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵罐，在溫度約26～28℃，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通風(fēng)量為1V/V·m下，經(jīng)過(guò)168小時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)，β-胡蘿卜素的發(fā)酵水平為2.01g/L。
實(shí)施例4(1)斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1。
(2)一級(jí)種子培養(yǎng)除種子培養(yǎng)基的組成為粕餅粉8％(重量)，玉米粉3％(重量)，維生素B15ppm，接入“+”、“-”菌株比例是1∶100外，其它同實(shí)施例1。
(3)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成為淀粉4％(重量)，粕餅粉1.8％(重量)，植物油6.0％(重量)，磷酸二氫鉀0.06％(重量)，曲拉通(Triton)0.15％(重量)，維生素B15ppm，硫酸錳0.03％(重量)。
將一級(jí)種子培養(yǎng)液接入250mL三角瓶，內(nèi)裝發(fā)酵液50mL，在搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速230rpm培養(yǎng)溫度約26～28℃，經(jīng)過(guò)168小時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)，β-胡蘿卜素的發(fā)酵水平為2.350g/L。
實(shí)施例5(1)斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1。
(2)一級(jí)種子培養(yǎng)除種子培養(yǎng)基的組成為粕餅粉5％(重量)，玉米粉3％(重量)，維生素B15ppm，接入“+”、“-”菌株比例是1∶200外，其它同實(shí)施例1。
(3)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成為淀粉10％(重量)，粕餅粉2.2％(重量)，植物油6.5％(重量)，磷酸二氫鉀0.06％(重量)，曲拉通(Triton)0.10％(重量)，維生素B15ppm，硫酸錳0.03％(重量)。
將一級(jí)種子培養(yǎng)液接入5L發(fā)酵罐中，內(nèi)裝發(fā)酵液2.5L，在溫度約26～28℃，攪拌轉(zhuǎn)速300～600rpm，通風(fēng)量1V/V·m下，經(jīng)過(guò)120小時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)，β-胡蘿卜素的發(fā)酵水平為2.184g/L。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的方法，生產(chǎn)步驟包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵工序，其特征在于所述的種子培養(yǎng)是將正、負(fù)兩種菌株接入同一只種子罐中進(jìn)行混合培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)包括一級(jí)種子培養(yǎng)或一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)種子培養(yǎng)或一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)和三級(jí)種子培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)工序中，接入的正、負(fù)菌株的比例是1∶1～1∶200。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)工序中，接入的正、負(fù)菌株的比例是1∶1～1∶20。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于產(chǎn)生β-胡蘿卜素的菌株是一種絲狀真菌三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)，分正、負(fù)兩種菌株，保藏于上?；ぱ芯吭壕N保藏處，菌號(hào)為f5H，(正菌株)，f6R(負(fù)菌株)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基的組成為粕餅粉5～15％(重量)，玉米粉3～8％(重量)，維生素B13～10ppm，培養(yǎng)基pH6.5～7.5，種子培養(yǎng)溫度26～28℃，培養(yǎng)時(shí)間16～24小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵工序的培養(yǎng)基組成為淀粉4～10％(重量)，粕餅粉1.2～2.8％(重量)，植物油5.1～7.0％(重量)，磷酸二氫鉀0.04～0.09％(重量)，非離子表面活性劑烷基酚聚氧乙烯醚0.05～0.20％(重量)，維生素B13～10ppm，硫酸錳0.01～0.06％(重量)，培養(yǎng)溫度26～28℃，培養(yǎng)時(shí)間120～168小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)或發(fā)酵工序中使用的種子罐或發(fā)酵罐的攪拌槳葉是上、中層為寬葉推進(jìn)式攪拌槳葉，下層為渦輪式攪拌槳葉的組合式攪拌槳葉。
全文摘要
一種發(fā)酵生產(chǎn)天然β－胡蘿卜素的方法,該方法包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)及發(fā)酵工序,其特點(diǎn)是將絲狀真菌的正、負(fù)菌株接入同一只種子罐中進(jìn)行混合種子培養(yǎng),另外種子罐和發(fā)酵罐的攪拌槳葉采用上、中層為寬葉推進(jìn)式,下層為渦輪式的組合式攪拌槳葉。本發(fā)明簡(jiǎn)化了操作工藝,降低了設(shè)備投資和生產(chǎn)成本,減少了染菌機(jī)率,對(duì)攪拌槳葉的改進(jìn),提高了發(fā)酵液的傳質(zhì)性能和氣液接觸效率,更適合菌絲體的生長(zhǎng),發(fā)酵水平可達(dá)2.0克/升以上。
文檔編號(hào)C12P23/00GK1331343SQ00116698
公開(kāi)日2002年1月16日 申請(qǐng)日期2000年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月22日
發(fā)明者童海寶, 蔡揚(yáng), 徐靜安, 任征, 楊曄, 費(fèi)利江, 何炳林, 馬強(qiáng) 申請(qǐng)人:上?；ぱ芯吭?br>