采用安瓿管冷凍干燥保藏菌種的活化方 法:在超凈工作臺中用70%酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中挫一道溝，用無菌紗布 墊或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿管向其中加入0.5-1.Oml液體培養(yǎng)基PDB，慢慢 旋轉安瓿，使凍干菌種復水，然后再將此轉接到試管斜面培養(yǎng)基HM中活化，在28 ± 2°C的環(huán) 境中培養(yǎng)3-5天后備用。
[0021] b)液體培養(yǎng) 將試管活化好的所述綠色木霉挑取三塊直徑8mm左右的菌塊分別接種在三個容積為 250m 1的裝有80ml液體培養(yǎng)基PDB三角瓶中，置于搖床，搖床的轉速160r/min，在28±2°C 的環(huán)境中培養(yǎng)3-4天后備用。
[0022] c)固體培養(yǎng) 將液體培養(yǎng)好的250ml綠色木霉培養(yǎng)物接入5kg固體培養(yǎng)基中，將固體培養(yǎng)物平鋪在淺 盤中（淺盤經福爾馬林溶液浸泡過夜晾干后施用），厚度5-8cm，上面蓋上雙層經高壓滅菌處 理的紗布，在28±2°C環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)6-8天，每隔2-3天翻拌一次，同時適當補加無菌水，培 養(yǎng)至產孢;最后自然風干或30°C烘干(水分含量小于10%)即為綠色木霉菌劑，菌劑含菌量為 10 10-ncfu/g。
[0023] 本實施例所有接種操作必須在無菌條件下，即在超凈工作臺的酒精燈旁或經紫外 線滅菌處理1-2小時的房間，固體培養(yǎng)的房間也需事先用紫外線滅菌處理1-2小時 實施例2含有綠色木霉TV41菌的生物炭(下稱含有木霉的生物)的制備 將玉米秸桿生物炭粉碎后過2毫米篩，然后加入綠色木霉TV41的固體菌劑，混勻，使得 加入后生物炭中木霉數(shù)量不低于2X10 7cfu/克，放置在陰涼干燥處備用。
[0024] 在具體生產中，也可以使用小麥或水稻秸桿燒制的生物炭。
[0025] 實施例3綠色木霉菌對辣椒疫霉的生長抑制試驗 試驗方法:將綠色木霉菌和辣椒疫霉分別單獨接種到PDA平板上，30°C恒溫培養(yǎng)3天后， 獲得每個菌株的新鮮菌絲塊(直徑5毫米），再將綠色木霉與辣椒疫霉菌絲塊接種到同一個 PDA平板中（每個平板接種1個綠色木霉菌絲塊及1個辣椒疫霉菌絲塊），兩個菌絲塊之間相 距5厘米，置于30°C恒溫箱中培養(yǎng)觀察。
[0026]試驗結果如圖1所示，其中，圖I(A)為培養(yǎng)24小時后觀察結果，圖I(B)為培養(yǎng)48小 時后觀察結果，圖1培養(yǎng)皿中，上部為辣椒疫霉菌絲，下部為綠色木霉菌絲，可見，該綠色木 霉菌對辣椒疫霉病菌有比較明顯的生長抑制作用。經過進一步研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉主要是 通過重寄生作用抑制或殺滅病原菌，即通過分泌多種復合抗菌物質或者能降解病原菌細胞 壁的多種酶達到抑制靶標病原菌生長的效果。
[0027]實施例4生物炭與綠色木霉TV41配合施用效果試驗 試驗在江蘇省農科院資環(huán)所大棚內利用盆缽栽培的方式進行，自然光照，溫度25-35 0C。
[0028]試驗方法為:將制備好的辣椒疫霉游動孢子液(制備方法見文獻王光飛（2015，微 生物學報））均勻加入土壤中，使得土壤辣椒疫霉數(shù)量為80個游動孢子/克干土。試驗設4個 處理，依次為： ⑴對照，土壤不加入木霉和生物炭； ⑵木霉TV41，土壤中加入實施例1獲得的綠色木霉菌劑，使得土壤中木霉數(shù)量為IO5^ 6Cfu/克土壤； (3)生物炭，生物炭施用量為土壤質量的1.0%; ⑷木霉TV41+生物炭，將含有木霉TV41的生物炭以土壤質量的1%均勻加入，使得土壤中 數(shù)量為I0Hcfu/克土壤 各處理土壤分裝到10盆圓口盆缽中，每盆500 g鮮土，分裝后即每盆種植一棵六葉期辣 椒苗。每個處理三個重復，即每處理共30盆。實驗時間30天，在第15天和30天分別統(tǒng)計各處 理的發(fā)病率。
[0029] 表1不同處理下，辣椒疫病的發(fā)病率(％)
從表1可以看出，單獨使用木霉TV41或者生物炭對辣椒疫病均有一定的防控效果，但防 效不高，而將兩者復配后使用，則顯著提高病害防控效果，從移栽后15天到30天，復配使用 的發(fā)病率僅為10%，而單獨使用木霉或者生物炭的發(fā)病率分別為40%和20%，可見，施用含有 木霉的生物炭可以顯著提高防效。
[0030]實施例5含有木霉的生物炭不同施用時間對辣椒疫病發(fā)病率的影響 試驗在江蘇省農科院資環(huán)所大棚內利用盆缽栽培的方式進行，自然光照，溫度25-35 0C。
[0031 ]將辣椒疫霉游動孢子液(制備同實施例4)均勻加入土壤中，使得土壤辣椒疫霉數(shù) 量為80個游動孢子/克干土;將實施例1獲得的綠色木霉菌劑與生物炭混合，獲得含有木霉 的生物炭，其中綠色木霉含菌量為2X10 7cfu/g。
[0032] 試驗設5個處理，依次為： ⑴CKO，對照，土壤不做任何處理； ⑵T0,含有木霉的生物炭施用量為土壤質量的1.0%;施用后立即移栽辣椒； (3)T10,含有木霉的生物炭施用量為土壤質量的1.0%;辣椒移栽前10天施用； ⑷Τ20，含有木霉的生物炭施用量為土壤質量的1.0%;辣椒移栽前20天施用； (5)Τ30，含有木霉的生物炭施用量為土壤質量的1.0%;辣椒移栽前30天施用。
[0033]含有木霉的生物炭按上述質量比加入土壤并混合均勻，放置10-30天期間，使得土 壤含水量保持在18-20%，處理結束，各處理土壤分裝到15盆圓口盆缽中，每盆500 g鮮土，每 盆種植一棵六葉期辣椒苗。每個處理三個重復，即每處理共45盆。在移栽后的15天、30天和 45天定期統(tǒng)計發(fā)病率，試驗結果如表2和圖2所示： 表2不同處理下辣椒疫病的發(fā)病率(％)
圖2為辣椒移栽后45天，不同處理對辣椒疫病的防控效果示意圖，從表2和圖2可以看 出，與對照相比，施用含有木霉的生物炭的處理，辣椒疫病發(fā)病率顯著降低，與施用后即移 栽辣椒相比，而提前10-30天施用含有木霉的生物炭，防控效果得到顯著提升，且三種使用 時間的防控效果之間較為平穩(wěn)，所以考慮農業(yè)生產上的實用性，建議含有木霉的生物炭提 前施用10天以上即可。
[0034] 實施例6大田條件下施用含有木霉的生物炭對辣椒疫病的防控效果 試驗在淮安市清浦區(qū)辣椒連作大棚進行，土壤處理時間為8月份，大棚面積為1畝，該大 棚連續(xù)種植辣椒多年，辣椒疫病發(fā)生嚴重，將前茬蔬菜殘體清除干凈，將大棚中間開溝，一 分為二，設為常規(guī)對照和處理兩組，整個大棚（即對照組和實驗組)先正常均勻施入1噸普通 商品有機肥和40公斤復合肥（15-15-15)，然后在處理組再均勻撒施150-200公斤含有木霉 的生物炭，常規(guī)組不做處理，再將整個大棚翻耕20-25厘米深，再澆水至含水量為18-20%，維 持水分含量放置20天后移栽辣椒，分別在移栽后的30，60，90天調查田間發(fā)病率，結果如表3 所示： 表3大田不同處理下辣椒疫病的發(fā)病率(％)
表3為辣椒移栽后不同時間，不同處理對辣椒疫病的防控效果，從表3可以看出，與常 規(guī)對照相比，施用木霉TV41+生物炭的處理，辣椒疫病發(fā)病率顯著降低，移栽后30天，對照已 經8%的發(fā)病率，而處理發(fā)病率為0，移栽后60天和90天，常規(guī)對照發(fā)病率由15%增加到37%，而 處理的發(fā)病率僅從8%提高到12%，不僅降低發(fā)病率，而且降低了病害發(fā)展速度，到90天時，防 控效果達67%。
[0035] 以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非對本發(fā)明的限制。在具體的實施過程中，本領 域技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干改進，如以小麥或水稻秸 桿代替玉米秸桿燒制生物炭，以實現(xiàn)本發(fā)明之目的，這些改進都屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種辣椒疫病的防控方法，其特征在于，具體步驟如下： 首先清除大田中前茬作物殘體，按常規(guī)方法施化肥和有機肥，然后將綠色木霉菌與生 物炭混合，混合物以300-400公斤/畝的施用量均勻撒施，再將土壤旋耕20-25cm，澆水灌溉 至土壤水分含量為18-20%，保持10-30d后，再栽植辣椒； 所述綠色木霉菌是指保藏號為CGMCCNo. 9293的綠色木霉TV41菌。2. 根據(jù)權利要求1所述一種辣椒疫病的防控方法，其特征在于，所述將綠色木霉菌與生 物炭混合是指:將生物炭粉碎后過2毫米篩，加入綠色木霉TV41菌劑混合，混合物中綠色木 霉TV41菌的含菌量為2X107cfu/克。3. 根據(jù)權利要求2所述一種辣椒疫病的防控方法，其特征在于，所述綠色木霉TV41菌劑 是這樣獲得的： (1) 將如權1所述的綠色木霉菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基roA中，28 ± 2°C培養(yǎng)3天;再將 綠色木霉菌株轉接到PDB液體培養(yǎng)基中，裝液量為80ml/250ml，然后于28±2°C溫度下?lián)u床 培養(yǎng)3-4天，搖床的轉速160rpm; (2) 培養(yǎng)結束后，按5%的體積質量比將綠色木霉菌接入固體培養(yǎng)基中，于28±2°C培養(yǎng) 6_妖； (3) 將綠色木霉菌連同固體培養(yǎng)基自然風干或30°C烘干，粉碎過10-20目篩，即獲得綠 色木霉固體菌劑，其含菌量為l〇1(W1cfu/g; 所述固體培養(yǎng)基的配制方法為：將麩皮與不長于5mm的稻草按照質量比7: 3的均勻混 合，再加入去離子水使混合物中的水分含量為65%，然后121°C滅菌40min。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種防控辣椒疫病的方法，具體為，首先清除大田中前茬作物殘體，按常規(guī)方法施化肥和有機肥，然后將綠色木霉菌與生物炭混合，混合物以300-400公斤/畝的施用量均勻撒施，再將土壤旋耕20-25cm，澆水灌溉至土壤水分含量為18-20%，保持10-30d后，再栽植辣椒；本發(fā)明打破現(xiàn)有技術中在辣椒定植時、或定植后再使用菌劑的常規(guī)防治方法，通過提前10-30天在土壤中施用含有綠色木霉的生物炭，使得土壤有充裕的時間形成以功能微生物為優(yōu)勢種群的穩(wěn)定的微生物區(qū)系，營造不利于病原菌生存的環(huán)境，繼以防控辣椒疫病，施用過程簡單，易于操作，防效高達90-100%，適于大面積推廣使用。
【IPC分類】A01P3/00, A01N63/04, A01B79/02, A01G13/00
【公開號】CN105432381
【申請?zhí)枴緾N201510886509
【發(fā)明人】馬艷, 王光飛, 郭德杰
【申請人】江蘇省農業(yè)科學院
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月7日