一種植物源抑藻劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抑藻劑及其制備方法，特別屬于植物源抑藻劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會、經(jīng)濟的快速發(fā)展，各種污染物的排放也日益加重，這使得水體富營養(yǎng)化 日趨嚴(yán)重，水華頻繁爆發(fā)嚴(yán)重影響了生態(tài)平衡，使我國的水質(zhì)性缺水現(xiàn)象日漸加劇。銅綠微 囊藻(Microcystis aeruginosa)是形成水華的藍藻優(yōu)勢種群之一，具有極強的生態(tài)學(xué)競爭 優(yōu)勢，至今其迅速繁殖依然是全球性的問題，而且其產(chǎn)生的微囊藻毒素危害極大，所以探索 發(fā)現(xiàn)一種高效的，經(jīng)濟的，生態(tài)風(fēng)險小的抑藻方法是當(dāng)前治理的突破點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題第1個是提供一種生態(tài)安全性好，不會造成二次污染 的用于銅綠微囊藻的植物源抑藻劑。
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題第2個是上述植物源抑藻劑的制備方法。
[0005] 本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案為：一種植物源抑藻劑，所述的抑藻劑為發(fā)酵后 的銀杏葉乳酸浸提液。
[0006] 所述的發(fā)酵后的銀杏葉乳酸浸提液，通過以下方法制備：將剛從銀杏樹上摘下的 銀杏葉用厚的黑色的塑料袋密封，并于25-35度自然發(fā)酵10-15天，然后在40-50度烘干至 恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用濃度為大于99 %的乳酸浸提3-5天，干 粉與乳酸的質(zhì)量、體積比為lg: l〇_15ml，即可。
[0007] 所述的藻為銅綠微囊藻。
[0008] 所述的藻密度為1_9*106個/毫升。
[0009] 乳酸（2-羥基丙酸）是一種天然的有機酸，由于在食品（防腐劑，風(fēng)味劑等）、化妝 品、醫(yī)藥及化工產(chǎn)業(yè)有重要的應(yīng)用而得到廣泛的關(guān)注。銀杏（Ginkgo biloba L.)，又名白果 樹；落葉喬木，葉片成扇。其一身是寶，葉、皮、根、果皆能入藥，具有很高的食用價值、藥用價 值、經(jīng)濟價值、生態(tài)價值和觀賞價值。
[0010] 銀杏現(xiàn)已廣泛種植原材料易得，乳酸則可通過價格低廉且資源豐富的生物質(zhì)原料 如玉米秸桿、小麥秸桿以及稻桿等進行生物發(fā)酵獲得，不需要化工合成，能耗小，經(jīng)濟效益 高。而且其中的乳酸具有防腐的功能，可利于在較長時間保存。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，現(xiàn)在一般的抑藻劑都是化學(xué)殺藻劑，對環(huán)境有害，會造成 二次污染。本發(fā)明中的抑藻劑原料來自植物銀杏以及可作為食品添加劑的乳酸，生態(tài)安全 性好。
【具體實施方式】
[0012] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細的說明。
[0013] 本發(fā)明中所用藻種銅綠微囊藻（FACHB-942)購于中國科學(xué)院武漢水生生物研 究所，使用BG-Il培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25°C，光照強度40001x，光暗周期為12h : 12h，擴大培養(yǎng)一周，使銅綠微囊藻達到對數(shù)生長期，用BG-Il培養(yǎng)基稀釋成初始藻密度為 3. 6 X IO6個/mL，通常的試驗用基數(shù)為105個/mL的初始藻密度，由于該抑藻劑效果較好，所 以初始密度相應(yīng)的設(shè)置成IO 6個/mL。
[0014] 乳酸，食品級發(fā)酵乳酸，濃度為99%，由上海國藥集團公司生產(chǎn)。
[0015] 銀杏葉，采于安徽師范大學(xué)校園內(nèi)。
[0016] 實施例1 :
[0017] 將新鮮的銀杏葉用厚的黑色的塑料袋密封，于25-35度自然發(fā)酵15天，然后在40 度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用濃度為99 %的乳酸浸提5天， 干粉與乳酸的質(zhì)量、體積比為lg: l〇ml，即可。
[0018] 實施例2 :
[0019] 將新鮮的銀杏葉用厚的黑色的塑料袋密封，于25-35度自然發(fā)酵15天，然后在45 度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用濃度為99%的乳酸浸提4天， 干粉與乳酸的質(zhì)量、體積比為lg: 12ml，即可。
[0020] 實施例3 :
[0021] 將新鮮的銀杏葉用厚的黑色的塑料袋密封，于25-35度自然發(fā)酵15天，然后在50 度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用濃度為99 %的乳酸浸提3天， 干粉與乳酸的質(zhì)量、體積比為lg: 15ml，即可。
[0022] 實施例4
[0023] 4. 1細胞密度
[0024] 在初始藻密度為3. 6X IO6ceIlsAiL銅綠微囊藻藻液中，分別加入實施例1所制的 浸提液及乳酸，設(shè)置3個濃度梯度，濃度分別是30ul/L，60ul/L，120ul/L，分別于24h，48h， 72h，96h用血球計數(shù)板對藻細胞進行計數(shù)。用SPSS 21. 0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行處理，分析各 實驗組的差異顯著性，P〈〇. 05表示具有顯著性差異，P〈0. 01表示具有極顯著性差異。
[0025] 表 1 :
[0026]
[0027] 表 2
[0028]
[0029] 注：*與同期對照組相比，P〈0. 05 與同期對照組相比，P〈0. 01。
[0030] 如表1所示，在24小時內(nèi)3個濃度都有很好的抑藻效果，且從隨后的幾天可以看 出不同濃度之間差異不是非常明顯，且與同期對照相比，均有極顯著差異（P〈〇. 01)，說明發(fā) 酵后的銀杏葉乳酸浸提液在較低濃度時抑藻效果已經(jīng)很明顯。
[0031] 如表2中所示：乳酸的30ul/L以及60ul/L在24小時內(nèi)，與同期對照相比，對銅 綠微囊藻的影響不大且30ul/L在隨后的幾天效果都不是很明顯；而60ul/L在48小時后效 果明顯，與同期對照相比有顯著性差異（P〈〇. 05)且在96小時后有極顯著差異（p〈0. 01); 120ul/L則在24小時內(nèi)，與同期對照相比，效果就明顯，有顯著性差異（p〈0. 05)且在72小 時后有極其顯著性差異（P〈〇. 01)說明乳酸在較高濃度時抑藻效果才比較明顯。
[0032] 4. 2抑制率
[0033] 銅綠微囊藻抑制率的計算公式為：
[0035] 其中：IR-抑制率，N-實驗組藻細胞數(shù)，NO-對照組藻細胞數(shù)。
[0040] 如表3所示：在24小時內(nèi)3個濃度抑制率都達到40%以上，且從隨后的幾天可以 看出不同濃度之間差異不是非常明顯，說明發(fā)酵后的銀杏葉乳酸浸提液在較低濃度時以及 較短時間內(nèi)抑藻效果已經(jīng)很明顯。
[0041] 如表4所示：在3〇111/1以及6〇111/1在24小時內(nèi)對銅綠微囊藻的抑制率都在20% 以下，且3111/10〇1111在隨后的幾天抑制率都在20%左右總體效果不明顯而6〇111/1在48小 時后都達到50%以上，120ul/L則在24小時就已經(jīng)達到40%以上，96h已經(jīng)接近100%，說 明乳酸在較高濃度時抑藻效果才比較明顯。
[0042] 實施例5 :
[0043] 在初始銅綠微囊藻藻密度為4. 3X Kfcells/mL，加入實施例1所制的浸提液，根據(jù) 抑藻效果，設(shè)置5個濃度梯度，浸提液的濃度分別是：0,10ul/L，20ul/L，40ul/L，80ul/L，分 別于加樣后的24h、72h、120h取10~12ml藻液離心（4000r/min, IOmin),分離上清液與沉 淀，稱量離心管與沉淀的總質(zhì)量（實驗前將離心管稱重并記錄數(shù)據(jù)），上清液用于測定電導(dǎo) 率、OD 28。，沉淀用Iml 0. 15mol/L的PBS(pH7.0)溶解后在-80°C冰箱中反復(fù)凍融三次，然后 用冷凍離心機離心（4°C，12000r/mim，15min)，留上清，用于測定膜脂過氧化物丙二醛MDA 的含量。用SPSS 21. 0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行處理，分析各實驗組的差異顯著性，P〈0. 05表 示具有顯著性差異，P〈〇. 01表示具有極顯著性差異。
[0044] 5. 1浸提液對銅綠微囊藻藻液電導(dǎo)率的影響。
[0045] 表 5 :
[0046]
[0047] 由于離子的導(dǎo)電性，故以電導(dǎo)率表示藻液中離子濃度大小。如表5所示：處理后的 實驗組的銅綠微囊藻藻液中電導(dǎo)率相比對照組都有不同程度的增加，20ul/L在72小時與 同期對照相比有顯著性差異（P〈〇.05)，在40ul/L和80ul/L兩個高濃度的實驗組在24小時 內(nèi)已經(jīng)有顯著性差異（p〈〇.05)，這表明浸提液使藻細胞膜的通透性增加，致使藻細胞內(nèi)的 離子外滲。
[0048] 5. 2浸提液對銅綠微囊藻藻液蛋白質(zhì)含量的影響。
[0049] 表 6 :
[0050]
[0051] *與同期對照組相比，P〈0. 05 與同期對照組相比，P〈0. 01。
[0052] 由于蛋白質(zhì)在OD28。具有最大光吸收，故以O(shè)D28。表示藻液中可溶性蛋白質(zhì)含量。 如表6所示：處理后的實驗組的銅綠微囊藻藻液中蛋白質(zhì)的含量相比對照組都有不同程 度的增加，20ul/L在120h時有顯著性差異（p〈0. 05)，40ul/L在24h時就有顯著性差異 (p〈0. 05)，80ul/L則有極顯著差異（p〈0. 01)。這同樣說明，由于受到浸提液的脅迫作用，藻 細胞膜通透性改變，導(dǎo)致細胞內(nèi)的蛋白外滲，且脅迫作用時間延長，蛋白的外滲量增加。
[0053] 5. 3浸提液對銅綠微囊藻膜脂過氧化物MDA含量的影響。
[0054] 表 7 :
[0055]
[0056] *與同期對照組相比，P〈0. 05 與同期對照組相比，P〈0. 01。
[0057] MDA(丙二醛）是藻細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，通過測定MDA含量的積累量可以反 映藻細胞在受到外界不利條件作用下細胞受損傷的程度。如表7所示：實驗組藻細胞中 的MDA含量相比對照組而呈現(xiàn)不同程度的上升，且浸提液作用時間越長，細胞內(nèi)的MDA積 累量也隨著增加，40ul/L在24h時就有極顯著性差異（p〈0. 01)，80ul/L則有顯著性差異 (p〈0. 05)，這表明浸提液使銅綠微囊藻的膜脂過氧化程度提高，加劇了對細胞膜的損傷。
[0058] 終上所述，這些指標(biāo)均可反映細胞膜受到損傷，從而導(dǎo)致細胞最終的破裂死亡，達 到抑藻的效果。
【主權(quán)項】
1. 一種植物源抑藻劑，其特征在于：所述的抑藻劑為發(fā)酵后的銀杏葉乳酸浸提液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物源抑藻劑，其特征在于：所述的藻為銅綠微囊藻。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種植物源抑藻劑，其特征在于：所述的藻密度為1-9*106個 / _升°4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物源抑藻劑，其特征在于：所述的發(fā)酵后的銀杏葉乳 酸浸提液，通過以下方法制備：將剛從銀杏樹上摘下的銀杏葉用厚的黑色的塑料袋密封， 并于25-35度自然發(fā)酵10-15天，然后在40-50度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干 粉，取研磨好的干粉用濃度為大于99%的乳酸浸提3-5天，干粉與乳酸的質(zhì)量、體積比為 lg: 10_15ml，即可。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物源抑藻劑及其制備方法，所述的抑藻劑為發(fā)酵后的銀杏葉乳酸浸提液。其制備方法：將剛從銀杏樹上摘下的銀杏葉用厚的黑色的塑料袋密封，并于25-35度自然發(fā)酵10-15天，然后在40-50度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用濃度為大于99％的乳酸浸提3-5天，干粉與乳酸的質(zhì)量、體積比為1g:10-15ml，即可。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，對環(huán)境無害，不會造成二次污染。本發(fā)明中的抑藻劑原料來自植物銀杏以及可作為食品添加劑的乳酸，生態(tài)安全性好。
【IPC分類】A01P13/00, A01N65/00
【公開號】CN105191993
【申請?zhí)枴緾N201510609321
【發(fā)明人】張庭廷, 韓玉珍, 彭桂瑩, 陳永玲
【申請人】安徽師范大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月22日