一種蛹蟲草生產(chǎn)用的專用母種的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種蛹蟲草生產(chǎn)用的專用母種的制備方法，屬于食用菌生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]蛹蟲草Cordyceps militaris L.Link，又名北冬蟲夏草，北蟲草。蛹蟲草是為數(shù)不多的幾種可以在人工培養(yǎng)基、家蠶或柞蠶蛹上進(jìn)行人工批量培養(yǎng)的藥用真菌。蛹蟲草的菌絲體及子實體中含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、S0D、腺苷、鳥苷、尿苷等多種藥用成分，同時富含多種人體必需氨基酸和微量元素。蛹蟲草工業(yè)化獲得菌絲體及子實體需要大量制備液體菌種。蛹蟲草的液體菌種制備過程包括:斜面母種制備一一級搖瓶一二級搖瓶(擴(kuò)大培養(yǎng))一液體菌種(發(fā)酵罐)。菌種需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，這種生產(chǎn)方法存在生產(chǎn)周期長、易污染、生產(chǎn)成本高、菌種容易退化等缺點(diǎn)。這些問題不利于蛹蟲草菌絲體和子實體的工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種解決現(xiàn)有技術(shù)問題的一種蛹蟲草生產(chǎn)用的專用母種的制備方法。
[0004]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案有以下步驟:
[0005]專用母種制備方法:
[0006]1、一級搖瓶菌種
[0007]①培養(yǎng)基配方(g/L):馬鈴薯200g，磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、檸檬酸銨lg、葡萄糖30g、蛋白胨3g、維生素BI 50mgo
[0008]②生產(chǎn)工藝:
[0009]馬鈴薯浸汁制備:優(yōu)質(zhì)無菌的馬鈴薯削皮，用水清洗干凈，稱重200g馬鈴薯，切成3-4_片，放入鍋中，加入清水IL煮到酥而不爛，用紗布過濾殘渣，取出過濾液倒入容器中冷卻后待用。
[0010]配料:稱取磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、檸檬酸銨lg、葡萄糖30g、蛋白胨3g、維生素BI 50mg，加入馬鈴薯煮出液，攪拌均勻，定容至1000mL。
[0011]分裝:將配置好的培養(yǎng)基分裝到500mL錐形瓶中，每瓶200mL。三角瓶中放入5mm玻璃株20-30粒，8層紗布和雙層報紙封口。
[0012]滅菌:將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋，115°C，高壓滅菌20分鐘，冷卻后取出備用。
[0013]接種:接入蛹蟲草一級斜面母種，每瓶接種0.5-lcm2菌種塊，5-6塊。
[0014]培養(yǎng):將接好種的菌瓶，在23-25°C靜置培養(yǎng)2天，再放在回轉(zhuǎn)式搖床中，23-25°C，120-160轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)3-5天。
[0015]2、專用母種生產(chǎn):按重量百分比計
[0016]培養(yǎng)基配方:麩皮78%，小米20%，另外加入營養(yǎng)液，料液比1: 1.3，pH6.5。
[0017]營養(yǎng)液配方:(蔗糖20g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂5g，水100mL)。
[0018]生產(chǎn)工藝:
[0019]原料處理:將麥麩和小米分別過孔徑為Imm和2mm篩，選用兩篩之間的顆粒做為原料。
[0020]配料:按營養(yǎng)液配方稱取配料，將其溶解在水中，配制營養(yǎng)液。然后按培養(yǎng)基配方稱取上述過篩后的麥麩和小米，按料液比=I: 1.3 (重量比)加入營養(yǎng)液，與小米、麥麩等充分混勻。
[0021]裝瓶:將上述培養(yǎng)料裝入，500mL茄瓶，攤平，每瓶裝干料50-70g，裝料厚度l_2cm，塞好棉塞，扎好牛皮紙，121_126°C滅菌45分鐘，待溫度降至30°C—下備用。
[0022]接種:用滅菌好的移液管把培養(yǎng)好的一級搖瓶菌種接種到上述茄瓶中的固態(tài)培養(yǎng)基中。
[0023]培養(yǎng):在23_25°C條件下避光培養(yǎng)，菌絲長慢后即可。
[0024]保藏:將培養(yǎng)好的專用母種，加入30-50mL 30%無菌甘油，混勻，于4°C冰箱保藏。
[0025]本發(fā)明的積極效果有:
[0026](I)省去菌種逐級擴(kuò)大培養(yǎng)過程，節(jié)約生產(chǎn)周期1/3以上。
[0027](2)節(jié)省了種子逐級擴(kuò)大設(shè)備成本，降低生產(chǎn)成本1/3以上。
[0028](3)接種簡便，減少污染。
[0029](4)降低了菌株退化風(fēng)險。
【具體實施方式】
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[0030]以下通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述:
[0031]實施例1:專用母種制備
[0032]專用母種制備方法:
[0033]1、一級搖瓶菌種
[0034]①培養(yǎng)基配方(g/L):馬鈴薯200g，磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、檸檬酸銨lg、葡萄糖30g、蛋白胨3g、維生素BI 50mgo
[0035]②生產(chǎn)工藝:
[0036]馬鈴薯浸汁制備:優(yōu)質(zhì)無菌的馬鈴薯削皮，用水清洗干凈，稱重200g馬鈴薯，切成3-4_片，放入鍋中，加入清水I升煮到酥而不爛，用紗布過濾殘渣，取出過濾液倒入容器中冷卻后待用。
[0037]配料:稱取磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、檸檬酸銨lg、葡萄糖30g、蛋白胨3g、維生素BI 50mg，加入馬鈴薯煮出液，攪拌均勻，定容至1000mL。
[0038]分裝:將配置好的培養(yǎng)基分裝到500mL錐形瓶中，每瓶200mL。三角瓶中放入5mm玻璃株20-30粒，8層紗布和雙層報紙封口后。
[0039]滅菌:將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋，115°C，高壓滅菌20分鐘，冷卻后取出備用。
[0040]接種:接入蛹蟲草一級斜面母種，每瓶0.5-lcm2菌種塊，5-6塊。
[0041]培養(yǎng):將接好種的菌瓶，在23-25°C靜置培養(yǎng)2天，再放在回轉(zhuǎn)式搖床中，23-25°C，120-160轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)3-5天。
[0042]2、專用母種生產(chǎn)
[0043]培養(yǎng)基配方:按重量百分比計。麩皮78%，小米20%，另外加入營養(yǎng)液，料液比I: 1.3, pH 6.5。
[0044]營養(yǎng)液配方:(蔗糖20g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂5g，水100mL)。
[0045]生產(chǎn)工藝:
[0046]原料處理:將麥麩和小米分別過孔徑為Imm和2mm篩，選用兩篩之間的顆粒做為原料。
[0047]配料:按營養(yǎng)液配方稱取配料，將其溶解在水中，配制營養(yǎng)液。然后按培養(yǎng)基配方稱取上述過篩后的麥麩和小米，按料液比=I: 1.3 (重量比)加入營養(yǎng)液，與小米、麥麩等充分混勻。
[0048]裝瓶:將上述培養(yǎng)料裝入，500mL茄瓶，攤平，每瓶裝干料50_70g，裝料厚度l_2cm，塞好棉塞，扎好牛皮紙，121_126°C滅菌45分鐘，待溫度降至30°C—下備用。
[0049]接種:用滅菌好的移液管把培養(yǎng)好的一級搖瓶菌種接種到上述茄瓶中的固態(tài)培養(yǎng)基中。
[0050]培養(yǎng):在23_25°C條件下避光培養(yǎng)，菌絲長慢后即可。
[0051]實施例2菌絲體大量培養(yǎng)
[0052]發(fā)酵培養(yǎng)基配方:蛋白胨20g，蔗糖20g，MgS04.7Η20 0.5g,KH2PO4 lg，植物油20mL或(泡敵 0.3mL)，水 lOOOmL，ρΗ6.5。
[0053]培養(yǎng)基配制:按配方比例稱取上述試劑，配制75L液體培養(yǎng)基。
[0054]上料:先將發(fā)酵罐pH電極和溶氧電極進(jìn)行標(biāo)定，再加入發(fā)酵培養(yǎng)基和消泡劑植物油或泡敵。
[0055]滅菌:121-126°C滅菌30分鐘，待溫度降至30°C—下備用。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速150r/min，通氣量1.5vvm，調(diào)節(jié)溶氧濃度為100%。
[0056]種子液準(zhǔn)備:在專用母種茄瓶中，加入300mL無菌水，將菌種搗碎，制成菌懸液。
[0057]接種:用火圈法無菌接入種子液。
[0058]培養(yǎng):發(fā)酵過程中控制溫度25°C，溶氧濃度10-20%，發(fā)酵周期96h。發(fā)酵過程中每8小時取樣I次，分析測定菌體干重、pH、殘?zhí)恰⑾x草素濃度、發(fā)酵液氮含量。
[0059]放料:發(fā)酵結(jié)束后，壓差法放出發(fā)酵液。
[0060]菌絲體收集:用板框過濾機(jī)，過濾收集菌絲體，洗滌、干燥。
[0061]實施例3:子實體栽培
[0062]固態(tài)栽培料配方:大米(30g) +營養(yǎng)液35mL。
[0063]營養(yǎng)液配方:(蔗糖20g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂5g，水100mL)。
[0064]培養(yǎng)基制備:按配方稱取大米和配置營養(yǎng)液。
[0065]裝瓶:14X8X 12cm高的塑料容器，加入30g大米，再加入35mL營養(yǎng)液，搖勻，用高壓聚丙烯薄膜和皮筋包扎封口。
[0066]滅菌:高壓蒸汽滅菌121°C，滅菌30min，滅菌后取出瓶子進(jìn)行冷卻，接種。
[0067]液體菌種制備:在專用母種茄瓶中，加入300mL無菌水，將菌種搗碎，制成菌懸液。
[0068]接種:用滅過菌的槍頭(槍頭口用剪刀剪大)吸取液體菌種，每盒接入液體菌種1mL,使菌種均勻覆蓋培養(yǎng)基表面，用封口膜封好，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室培養(yǎng)。
[0069]菌絲體培養(yǎng):待菌絲體布滿培養(yǎng)瓶之后(大約需要進(jìn)過五天培養(yǎng)，溫度不同時間長短會略有差異)，調(diào)節(jié)溫度20°C度(低于或者高于這個溫度，生長速度減慢)繼續(xù)栽培15天左右。遮光保持黑暗狀態(tài)，溫度保持在16?20°C，相對濕度控制在60%左右。發(fā)菌階段一般需10?14d，等菌絲布滿培養(yǎng)基表面并穿透培養(yǎng)基見底時，就可轉(zhuǎn)移出蛹蟲草發(fā)菌室進(jìn)行見光培養(yǎng)。
[0070]轉(zhuǎn)色:優(yōu)良的蛹蟲草菌絲見光后2?3d便會從白色轉(zhuǎn)為橘黃色，轉(zhuǎn)色階段光照強(qiáng)度為150?2500Lux，光照時間每天不少于12h，培養(yǎng)溫度20?22°C
[0071]催芽及出草:轉(zhuǎn)色結(jié)束后催芽，催芽階段需拉大溫差，適宜溫差在10°C左右，即溫度白天保持為20?22°C、晚上為10?12°C。如果控溫設(shè)施條件有限，晚上溫度盡可能降至16°C以下。催芽一至兩個星期恢復(fù)到常培養(yǎng)溫度20?22°C。出草初期出草室的濕度保持80%左右.待子實體生長至Icm時，用在封口膜戳4?6個小孔(孔直徑6mm左右)，加大濕度至90%左右，每天早、中、晚三次通風(fēng)，通風(fēng)時間為30min，每天12h以上光照。
[0072]采收及保存:蛹蟲草子實體躍至1cm左右時，長成上粗下細(xì)的棒狀且表面出現(xiàn)粒狀粉末時，表明子實體成熟，即可采收。用消過毒的醫(yī)用鑷子夾取子實體。采收后的子實體40°C以下烘干或晾干，密封于塑料袋中，短期保存置陰涼干燥處，長期保存可置于低溫冰柜中。
【主權(quán)項】
1.一種蛹蟲草生產(chǎn)用的專用母種的制備方法，其特征在于: I培養(yǎng)基配方:按重量百分比計，麩皮78%，小米20 %，另外加入營養(yǎng)液，料液比I: 1.3, pH 6.5 ;營養(yǎng)液配方:蔗糖20g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂5g，水100mL ； II生產(chǎn)工藝: 原料處理:將麥麩和小米分別過孔徑為Imm和2mm篩，選用兩篩之間的顆粒做為原料，配料:按營養(yǎng)液配方稱取配料，將其溶解在水中，配制營養(yǎng)液，然后按培養(yǎng)基配方稱取上述過篩后的麥麩和小米，按料液比=I: 1.3 (重量比)加入營養(yǎng)液，與小米、麥麩等充分混勻， 裝瓶:將上述培養(yǎng)料裝入，500mL茄瓶，攤平，每瓶裝干料50-70g，裝料厚度l_2cm，塞好棉塞，扎好牛皮紙，121-126°C滅菌45分鐘，待溫度降至30°C—下備用， 接種:用滅菌好的移液管把培養(yǎng)好的一級搖瓶菌種接種到上述茄瓶中的固態(tài)培養(yǎng)基中， 培養(yǎng):在23-25°C條件下避光培養(yǎng)，菌絲長慢后即可， 保藏:將培養(yǎng)好的專用母種，加入30-50mL 30%無菌甘油，混勾，于4°C冰箱保藏。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛹蟲草生產(chǎn)用的專用母種的制備方法，利用麩皮，小米為原料，加入一定比例含有蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂的營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH后作為培養(yǎng)基，裝入茄瓶后，121℃，滅菌30min，無菌操作，接種蛹蟲草菌種，18～25℃，恒溫培養(yǎng)7～14天，獲得生產(chǎn)蛹蟲草用的專用母種，將專用母種加入一定量無菌水，接種于發(fā)酵罐或固態(tài)栽培料，可以大規(guī)模獲得蛹蟲草菌絲體和子實體。本發(fā)明省去菌種逐級擴(kuò)大培養(yǎng)過程，節(jié)約生產(chǎn)周期1/3以上；節(jié)省了種子逐級擴(kuò)大設(shè)備成本，降低生產(chǎn)成本1/3以上；接種簡便，減少污染；降低了菌株退化風(fēng)險，工業(yè)化生產(chǎn)蛹蟲草菌絲體及子實體。
【IPC分類】A01G1/04
【公開號】CN104920064
【申請?zhí)枴緾N201510267036
【發(fā)明人】劉洋
【申請人】湖州師范學(xué)院
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月20日