度，提高草坪植物抗低溫性。強(qiáng)化耐低溫微生物菌株的獲得是將城市生活垃圾堆肥微生 物在KTC條件下培養(yǎng)。本技術(shù)旨在獲得強(qiáng)化堆肥微生物，并為強(qiáng)化城市生活垃圾堆肥微生 物菌劑的草坪草抗低溫應(yīng)用提供技術(shù)支撐。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)方案： 一種強(qiáng)化耐低溫微生物菌劑，其特征在于，它是由重量份數(shù)比為1:1:1:1的強(qiáng)化施氏 假單胞菌、強(qiáng)化枯草芽孢桿菌、強(qiáng)化和強(qiáng)化隱球菌組成；所述的強(qiáng)化施氏假 單胞菌、強(qiáng)化枯草芽孢桿菌、強(qiáng)化和強(qiáng)化隱球菌指的是：將不同濃度梯度的 復(fù)合微生物菌群涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏I號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基上，放置在 人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，溫度為KTC;所述的不同濃度梯度的復(fù)合微生物菌群指的是 I(T1、I(T2、I(T3、I(T4、I(T5 和 10?1 〇
[0012] 本發(fā)明所述所述強(qiáng)化施氏假單胞菌和枯草芽孢桿菌在30°C，180r/min培養(yǎng)， 和隱球菌在28°C，220r/min培養(yǎng)。選用600nm波長(真菌用560nm)進(jìn) 行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長曲線，選取 對數(shù)生長期的菌種配置復(fù)合微生物菌劑，復(fù)合微生物菌液按施氏假單胞菌、枯草芽孢桿菌、 和隱球菌按1: 1: 1:1的比例進(jìn)行配置。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了強(qiáng)化耐低溫微生物菌劑在提高草坪的抗寒性、提高返青率方 面的應(yīng)用；特別是在提高越冬后高羊茅返青率、高羊茅的質(zhì)地、密度與色澤方面的應(yīng)用。其 中所述的強(qiáng)化復(fù)合微生物菌群指的是施氏假單胞菌、枯草芽孢桿菌、pleosporaceae和隱球 菌按重量份數(shù)比1: 1: 1:1的比例進(jìn)行配置。
[0014] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了強(qiáng)化耐低溫微生物菌劑的制備方法，其特征在于按如下的 步驟進(jìn)行： (1) 菌種的富集： 將堆肥樣品稱取IOg置于無菌錐形瓶中，加入IOOmL無菌水振蕩均勾后，取IOmL懸浮 液于盛有IOOmL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28°C，220r/min下振蕩培養(yǎng)3d，即為混合微生 物菌群； (2) 混合微生物菌群的強(qiáng)化：將不同濃度梯度的復(fù)合微生物菌群涂布在牛肉膏蛋白胨 培養(yǎng)基、高氏I號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基上，放置在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，溫度為 l〇°C，得到強(qiáng)化的復(fù)合微生物菌群；所述的不同濃度梯度的復(fù)合微生物菌群指的是10' I(T2、I(T3、I(T4、I(T5 和 10?1 〇
[0015](3)將強(qiáng)化施氏假單胞菌和枯草芽孢桿菌在30°C，180r/min培養(yǎng)， 和隱球菌在28°C，220r/min培養(yǎng)。選用600nm波長(真菌用560nm)進(jìn)行比濁測定，以菌 懸液的OD值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長曲線，選取對數(shù)生長期的菌 種配置復(fù)合微生物菌劑，復(fù)合微生物菌液按施氏假單胞菌、枯草芽孢桿菌、 和隱球菌按1:1:1:1的比例進(jìn)行配置。
[0016] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了采用強(qiáng)化耐低溫微生物菌劑提高草坪草抗低溫能力的方 法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行： (1) 材料：選用的是我國北方比較常見的多年生高羊茅，所用基質(zhì)為配制好的校園土， 在121°C下滅菌30min，備用； (2) 每培養(yǎng)容器內(nèi)放置滅菌土壤作為基質(zhì)，建植地毯草皮基質(zhì)厚度為15mm，播種量為 160g?m2,每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，并且應(yīng)經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng) 容器位置，以保證光照一致； (3) 待植株生長到15-20d后，分別加入相應(yīng)的復(fù)合微生物菌劑各15ml，草坪植物培養(yǎng) 期間，溫度為12_20°C，相對濕度為25-45%，光照為透入室內(nèi)的自然光，持續(xù)處理20d后測 定各指標(biāo)，測定高羊茅的株高、單株生物量以及葉綠素含量。
[0017] 本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法如下： 1研制材料與方法I. 1實(shí)驗(yàn)材料 草坪草選取籽粒飽滿、均勾一致的高羊茅（aryflt/iflaceaL.)種子為試驗(yàn) 材料。供試土壤為天津師范大學(xué)校內(nèi)園土，理化性質(zhì)：pH為7. 44,含鹽量0. 29%，有機(jī)質(zhì)含量 4. 68 %，全氮量 0. 21 %，有效磷含量 22. 03mg?kg'全鉀 45. 61g?kg'容重 0. 46g?I71， 飽和含水量0. 58g?mL'
[0018] 1.2垃圾堆肥中耐低溫微生物的強(qiáng)化、分離、純化和鑒定。
[0019] 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml，pH7.4-7.6，加15§瓊脂成固 體培養(yǎng)基； 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml，pH7. 0-7. 2,加15g瓊脂成固體培養(yǎng)基； 高氏I號培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20g，KNO3 20g，K2HPO3 0? 5g，MgSO4 0? 5g，F(xiàn)eSO4 0?OlgdK 1000ml，pH7. 2-7. 4,加瓊脂20g成固體培養(yǎng)基(配置時(shí)，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀， 導(dǎo)入煮沸的水中，在火中加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)水至1000ml); 馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖l〇g，蛋白胨5g，KHPO3lg，MgSO(7H20) 0. 5g，l%孟加拉紅水溶 液，3. 3ml，水1000ml，pH自然，加瓊脂15g成固體培養(yǎng)基(臨用前加入0. 03%鏈霉素稀釋液 100ml，使每ml培養(yǎng)基含鏈霉素30呢）。
[0020] 菌種的富集 將堆肥樣品稱取IOg置于無菌錐形瓶中，加入IOOmL無菌水振蕩均勾后，取IOmL懸浮 液于盛有IOOmL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28°C，220r/min下振蕩培養(yǎng)3d，即為混合微生 物菌群。
[0021] 微生物的強(qiáng)化 將不同濃度梯度的復(fù)合微生物菌群涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏I號培養(yǎng)基和馬 丁氏培養(yǎng)基上，放置在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，溫度為KTC;所述的不同濃度梯度的復(fù) 合微生物菌群指的是瓜1、^2、^ 3、^4、^^…-6^/!^。
[0022] 強(qiáng)化微生物的分離及純化 稀釋涂布平板法 1)倒平板：將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏（PDA)瓊脂培 養(yǎng)基高溫滅菌，冷卻至55~60°C時(shí)，在馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液(終質(zhì)量濃度為 30l^g/ml)，混均勻后分別倒平板。
[0023] 2)制備混合微生物稀釋液：用移液槍吸取Iml強(qiáng)化后的混合微生物菌懸液加入盛 有9ml無菌水的大試管中充分混勾，此為KT1稀釋液，以此類推制成10'10'10'KT5和 1〇_6幾種濃度的稀釋液。
[0024] 3)涂布：用移液槍分別吸取0. 2ml不同濃度的稀釋菌懸液準(zhǔn)確放入相應(yīng)培養(yǎng)基平 板中央，每個(gè)不同濃度梯度處理重復(fù)3次。用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。
[0025] 4)培養(yǎng)：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將含高氏I號培養(yǎng)基和馬 丁氏培養(yǎng)基（PDA)的平板倒置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0026] 平板劃線分離法 挑菌落：將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落分別挑取少許菌苔在新的上述3種培養(yǎng)基上進(jìn)行劃 線純化。直到培養(yǎng)基上長出來的是純培養(yǎng)，如不純，仍需重復(fù)該步驟。
[0027] 強(qiáng)化微生物的鑒定 按照Ezup柱式試劑盒的操作手冊提取優(yōu)勢菌種的DNA。優(yōu)勢細(xì)菌的PCR體系： 10XBufTer(withMgCl2)2ML，dNTP(10mmol/L)0. 4ML，341f(10Mmol/L)lML，534r(IOMmol/ L) 1ML，Taq酶（5u/ML) 0. 4ML，模板DNA1ML，加超純水定容至終體積20ML。PCR反應(yīng)條件： 94°C5min預(yù)變性，94°C變性lmin，55°C復(fù)性 45s，72°C延伸 45s，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。 引物為 34If(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTAC GGGAGGCAGCAG-3')和 534r(5'-AITACCGCGGCTGCTGG-3')。優(yōu)勢真菌的PCR 反應(yīng)體系：l〇XBuffer(withoutMgCl2) 2ML，MgCl2 (25mmol/L)1.6ML，dNTP(lOmmol/L) 0? 4ML，Geoll(10Mmol/L)0. 4ML，GeoA2 (10Mmol/L)0. 4ML，Taq酶（5u/ML)0. 2ML，模板DNA 1ML，加超純水定容至終體積20ML。PCR反應(yīng)條件：94°C4min預(yù)變性，94°C變性lmin，54°C復(fù) 性lmin，72°C延伸