專利名稱：中國(guó)棉鈴蟲病毒基因工程株1號(hào)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是中國(guó)棉鈴蟲病毒基因工程株1號(hào)，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。可用于害蟲的生物防治及病毒流行病學(xué)研究以桿狀病毒為代表的昆蟲病毒由于其高度專一性，極強(qiáng)的致病性以及對(duì)環(huán)境的安全性已廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治。到目前為止國(guó)際上登記注冊(cè)的病毒殺蟲劑已超過20種，我國(guó)也有中國(guó)棉鈴蟲病毒殺蟲劑，斜紋夜蛾病毒殺蟲劑和小菜蛾顆粒體病毒等3種病毒殺蟲劑登記注冊(cè)進(jìn)入商品化生產(chǎn)。在生產(chǎn)上發(fā)揮了重要作用。但野生型病毒存在殺蟲速度慢(一般需要5-7天)，殺蟲譜窄等缺陷而限制了其更大規(guī)模的應(yīng)用。隨著桿狀病毒分子生物學(xué)研究和生物技術(shù)的發(fā)展，通過基因工程的方法改良病毒的殺蟲性能成為現(xiàn)實(shí)。
目前改良病毒殺蟲速度的方法有刪除或失活病毒自身的特定基因如egt，pp32等、表達(dá)昆蟲的激素基因和酶以及表達(dá)毒素基因如Bt毒素基因、昆蟲特異性的神經(jīng)毒素基因如AaIT等。其中以缺失病毒egt基因和表達(dá)昆蟲神經(jīng)毒素基因AaIT的改良效果最為理想。
國(guó)際上已經(jīng)和正在進(jìn)行遺傳改良以提高病毒殺蟲速度的昆蟲桿狀病毒有苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)(美國(guó)，英國(guó)等)，舞毒蛾核型多角體病毒(LdMNPV，美國(guó))，黃杉毒蛾核型多角體病毒(OpMPNV，美國(guó))，云杉卷葉蛾核型多角體病毒(CfMNPV，加拿大)，甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeMNPV，荷蘭)，?；页嵋苟旰诵投嘟求w病毒(SINPV，以色列)，美洲棉鈴蟲(HeSNPV)(美國(guó))等。我國(guó)也有多家實(shí)驗(yàn)室正在從事相關(guān)研究，其中中山大學(xué)的主要研究對(duì)象為AcMNPV和斜紋夜蛾核型多角體病毒(S1MNPV)，武漢大學(xué)的研究對(duì)象為AcMNPV。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未見通過基因工程方法改良中國(guó)棉鈴蟲病(Heliothis armigeranucleopolyhedrovirus,HearNPV或HaNPV)殺蟲性能研究的報(bào)道(見查新報(bào)告)。
中國(guó)科學(xué)院武漢病毒于1973年在湖北分離獲得中國(guó)棉鈴蟲病毒，成功的研制了HaSNPV殺蟲，并已于1995年登記注冊(cè)成為我國(guó)第一個(gè)商品化生產(chǎn)的病毒殺蟲劑，每年的防治面積達(dá)200萬(wàn)畝次。但這僅占我國(guó)控制大面積棉鈴蟲危害所使用的農(nóng)藥的極少部分(主要農(nóng)藥仍為化學(xué)農(nóng)藥)主要原因是棉鈴蟲病毒和所有其它桿狀病毒一樣殺蟲速度慢。因此，如何提高棉鈴蟲病毒殺蟲劑的殺蟲速度成為該殺蟲劑推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。
本發(fā)明專利的目的是通過基因工程的方法對(duì)中國(guó)棉鈴蟲病毒株進(jìn)行遺傳改造，提高其殺蟲速度，為病毒殺蟲劑的生產(chǎn)提供一株高效的工程病毒株。
為了獲得高效的棉鈴蟲病毒基因工程株，本發(fā)明采用了缺失HaSNPV自身egt(蛻皮激素UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)基因的技術(shù)路線。昆蟲病毒遺傳工程株構(gòu)建方法是構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體，轉(zhuǎn)移載體與野生型病毒共轉(zhuǎn)染敏感的昆蟲細(xì)胞，通過同源重組產(chǎn)生重組病毒，然后空斑純化重組病毒；最后對(duì)重組病毒的性能進(jìn)行分析。
和野生型棉鈴蟲核型多角體病毒相比較，經(jīng)過遺傳改良所獲得的中國(guó)棉鈴蟲病毒基因工程株1號(hào)的殺蟲速度比野生型病毒有了明顯的提高，其LT50縮短20％，該重組株用于棉鈴蟲的防治將明顯優(yōu)于野生型病毒。
另外本工程株含有GFP(綠色熒光蛋白)標(biāo)記基因，因而還特別適用于病毒田間流行病學(xué)的研究。
2．pHaGFPegt-質(zhì)粒DNA與HaSNPV(野生型)DNA共轉(zhuǎn)染敏感昆蟲細(xì)胞Hz-AM1，來(lái)源于HaSNPV的序列和野生型病毒DNA發(fā)生同源等位交換產(chǎn)生重組病毒。該重組病毒的egt基因大部分編碼區(qū)被GFP標(biāo)記基因取代。由于GFP的表達(dá)，感染了重組病毒的細(xì)胞在紫外燈下產(chǎn)生綠色的熒光。
3．空斑挑選產(chǎn)熒光的重組病毒，經(jīng)3-5輪空斑可獲得純化的重組病毒。
4．重組病毒的檢測(cè)1)．限制性內(nèi)切酶消化分析2)．PCR分析3)．EGT酶活性分析確認(rèn)基因已被刪除。
5．生物活性測(cè)定以3齡中國(guó)棉鈴蟲為供試幼蟲，以1x106PIB/ml的病毒為供試濃度，測(cè)定比較野生型和重組型的LT50。
權(quán)利要求
本發(fā)明專利是中國(guó)棉鈴蟲病毒基因工程株1號(hào)，其特征是病毒的egt(蛻皮激素UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)基因被刪除或失活，從而改良病毒的殺蟲性能，提高其殺蟲速度，可作為新一代病毒殺蟲劑生產(chǎn)用毒株；插入了報(bào)道基因GfP(綠色熒光蛋白)，可作為環(huán)境釋放和流行病學(xué)研究的標(biāo)記。
全文摘要
桿狀病毒廣泛用于農(nóng)林害蟲的生物防治。到目前為止國(guó)際上登記注冊(cè)的病毒殺蟲劑已超過20種,我國(guó)也有中國(guó)棉鈴蟲病毒等3種病毒殺蟲劑登記注冊(cè)進(jìn)入商品化生產(chǎn)。但野生型病毒存在殺蟲速度慢(一般需要5—7天)等缺陷限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。本發(fā)明通過分子生物技術(shù)刪除(或失活)中國(guó)棉鈴蟲病毒(Helio－this armigera nucleopolyhedrovirus)的蛻皮激素UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(egt),構(gòu)建了殺蟲性能明顯改良的中國(guó)棉鈴蟲病毒基因工程株一號(hào)。該基因工程株感染棉鈴蟲的LT
文檔編號(hào)A01N63/00GK1297043SQ9911668
公開日2001年5月30日 申請(qǐng)日期1999年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月29日
發(fā)明者陳新文, 胡志紅, J·M·Vlak(休斯特·福拉克), 張友清, 孫修練 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所