專利名稱：控制植物病毒病的基因工程方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，是一種控制植物病毒病的基因工程方法。已有的技術(shù)1.D.C.Baulcombeelal，Nature321446-449(1986)所述，在宿主細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生致病病毒的衛(wèi)星RNA來抑制該病毒在植物中的增殖和擴(kuò)散。此法能延緩病毒病的發(fā)生，但僅適合于極少數(shù)帶有能抑制該病毒增殖的衛(wèi)星RNA的病毒引起的植物病害的控制，而且還可能造成難以預(yù)測的環(huán)境污染結(jié)果。一種衛(wèi)星RNA在某一種宿主有抑制致病病毒的危害程度，而在另一植物就可能增強(qiáng)該病毒對那種宿主的危害程度。且RNA容易變異，原來能控制該病毒對某宿主危害有益的衛(wèi)星RNA有可能在變異后加重該病毒對原宿主植物的危害程度。
2.A.P.Powelletal，Science232738-743(1986)所述，在宿主植物中表達(dá)病毒外殼蛋白基因來抑制該病毒在宿主中的增殖。這方法能延緩該病毒病的發(fā)生，但只能控制一年生植物中由非種傳性病毒引起的病毒病的發(fā)生和發(fā)展。為達(dá)到和增強(qiáng)控制病毒病效果，宿主植物需累積大量該病毒的外殼蛋白，這對植物不利，如用于直接食用的植物，人們心理上也難接受。
3.R.NBeachyetal，InD.EvereddS.Harnett(eds)Plantresistancetoviruses，151-158，JohnWileydSons，(1987)所述，在宿主植物中表達(dá)病毒基因組的一段反意RNA片段，以此控制該病毒在宿主中的增殖。但這種方法對病毒病控制效果很差。
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)不足之處。通過病毒誘導(dǎo)方法，使原來已導(dǎo)入植物未表達(dá)成蛋白的毒蛋白基因表達(dá)成毒蛋白，引起病毒感染細(xì)胞“自殺”，可以達(dá)到控制病毒在植株中增殖和擴(kuò)散的目的。
本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明利用抑制宿主植物蛋白質(zhì)合成的毒蛋白基因讀碼框取代病毒亞基因組cDNA的一種基因讀碼框，在此讀碼框原5′端保留可被該病毒復(fù)制酶識別的堿基序列，或換上可被其它病毒復(fù)制酶識別的堿基序列，或串聯(lián)接上幾種病毒各自復(fù)制酶識別的堿基序列，或接上幾種病毒的復(fù)制酶共同識別的同源堿基序列，插在可在植物中表達(dá)的啟動子和3′末端間，導(dǎo)入植物，表達(dá)成負(fù)鏈毒蛋白RNA。在相關(guān)病毒感染的細(xì)胞中，負(fù)鏈RNA轉(zhuǎn)變成正鏈毒蛋白RNA，翻譯產(chǎn)生控制相應(yīng)的病毒在宿主植物中的增殖和擴(kuò)散的毒蛋白，如在毒蛋白基因讀碼框5′端接的是正鏈RNA病毒包括不帶亞基因組正鏈RNA病毒5′端非轉(zhuǎn)譯區(qū)cDNA片段，按此方法組成嵌合基因，導(dǎo)入植物，這種植物也能抗不帶亞基因組的正鏈RNA病毒引起的病毒病。
本發(fā)明的根本特征是向植物導(dǎo)入平時(shí)不能表達(dá)成蛋白質(zhì)但在被病毒感染細(xì)胞中才能表達(dá)成毒蛋白的嵌合基因。一些DNA病毒中只有被該病毒另一些基因產(chǎn)物誘導(dǎo)才能表達(dá)的基因的讀碼框和植物中只在某病毒入侵后才在感染細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的基因的讀碼框用毒蛋白讀碼框取代，組成嵌合基因，導(dǎo)入植物，由于這些嵌合基因只在這些病毒感染的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生毒蛋白，這樣的植物也能獲得對這些病毒引起的病毒病的抗性。
本發(fā)明的具體技術(shù)路線是1.把一種帶亞基因組病毒cDNA的外殼蛋白基因讀碼框換上一種能強(qiáng)烈抑制宿主植物蛋白質(zhì)合成的毒蛋白基因讀碼框。
2.保留這段cDNA原外殼蛋白基因讀碼框5′端可被該病毒復(fù)制酶識別從負(fù)鏈基因組RNA產(chǎn)生正鏈外殼蛋白RNA的片段和病毒3′端確保原病毒正鏈RNA穩(wěn)定性的片段，以能在植物中轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈RNA的形式，插入植物啟動子和3′末端間，組成嵌合基因。
3.將嵌合基因插入帶植物篩選標(biāo)記基因如嵌合的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因的質(zhì)粒載體T-DNA區(qū)內(nèi)，通過接合轉(zhuǎn)移，把此質(zhì)粒導(dǎo)入無T-DNA區(qū)而帶Vir區(qū)的Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中。
4.通過植物葉碟片或原生質(zhì)體和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的辦法，把帶此嵌合基因和篩選標(biāo)記基因的T-DNA區(qū)導(dǎo)入植物染色質(zhì)基因組，產(chǎn)生抗某抗菌素的帶此毒蛋白基因的工程植株。
5.從工程植株中篩選出最抗該病毒病的植株，通過有性繁殖、繼代培育，得到遺傳上穩(wěn)定的抗該病毒的種子后代。從完全抗病毒的工程植株還可得到用于生產(chǎn)的無性繁殖材料。
6.在此毒蛋白基因讀碼框前，該病毒復(fù)制酶識別片段的cDNA兩側(cè)各有一特定的限制性內(nèi)切酶切口，可用該病毒其它為復(fù)制酶識別的片段的cDNA，其它病毒復(fù)制酶特異識別片段的cDNA，甚至不帶亞基因組正鏈RNA病毒RNA的5′端非轉(zhuǎn)譯區(qū)片段的cDNA取代;也可用串聯(lián)起來的幾種病毒的復(fù)制酶各自識別片段的cDNA或共同識別的同源堿基片段的cDNA取代;組成導(dǎo)入植物能抗一種或多種病毒病的嵌合基因。
7.除了用這里使用的二元型Ti載體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法把嵌合毒蛋白基因?qū)胫参锏姆椒ㄖ?，還可用一元型Ti載體經(jīng)農(nóng)桿菌共培養(yǎng)或DNA直接轉(zhuǎn)移法，把嵌合的毒蛋白基因?qū)胫参铮玫焦こ讨仓辍?br> 8.用于抑制植物蛋白質(zhì)合成的毒蛋白基因有白喉毒素片段A基因、綠膿假單胞桿菌外毒素A基因等細(xì)菌的修飾延長因子2的酶蛋白基因;資源植物商陸抗病毒蛋白等和食用植物小麥、玉米、苦瓜等的核糖體失活蛋白基因。用于轉(zhuǎn)負(fù)鏈毒蛋白RNA為正鏈毒蛋白RNA的片段有各種帶亞基因組正鏈RNA病毒(如煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯病毒X、馬鈴薯病毒Y、苜蓿花葉病毒、雀麥花葉病毒、大麥條斑花葉病毒等)復(fù)制酶從各自病毒的負(fù)鏈RNA轉(zhuǎn)錄為正鏈亞基因組RNA所需堿基片段的cDNA和各正鏈RNA病毒包括無亞基因組正鏈RNA病毒5′端非轉(zhuǎn)譯區(qū)片段的cDNA。
本發(fā)明的作用機(jī)制是1.在病毒未感染的工程植株中都有一定數(shù)量的毒蛋白負(fù)鏈RNA，這些RNA不能變成正鏈RNA和產(chǎn)生相應(yīng)的毒蛋白。當(dāng)植物被病毒感染后，病毒利用宿主蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)來合成復(fù)制酶;這些復(fù)制酶識別和轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈毒蛋白RNA，產(chǎn)生mRNA;這些mRNA又利用植物蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)翻譯生成相應(yīng)的毒蛋白;這些毒蛋白又反饋地抑制被感染宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。這里的毒蛋白具酶的性質(zhì)，有很強(qiáng)的抑制蛋白質(zhì)合成的能力。這樣，不論宿主細(xì)胞原來蛋白質(zhì)合成的活力如何，利用這種反饋機(jī)制，在病毒感染的宿主細(xì)胞中，蛋白質(zhì)合成都會迅速地被嚴(yán)重抑制。
2.帶亞基因組的正鏈RNA病毒從感染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相鄰細(xì)胞或較遠(yuǎn)的組織，需要合成一定數(shù)量的病毒的和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白。這些蛋白往往是從亞基因組RNA翻譯而來。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞生成復(fù)制酶后，先要轉(zhuǎn)錄生成負(fù)鏈的基因組RNA，再由它們轉(zhuǎn)變?yōu)楦髡渷喕蚪MRNA。在工程植株中預(yù)存有一定數(shù)量帶有能被病毒復(fù)制酶識別和轉(zhuǎn)錄所需片段的毒蛋白負(fù)鏈RNA的條件下，病毒感染宿主細(xì)胞后將優(yōu)先地生成毒蛋白mRNA，翻譯成毒蛋白。在還未能積累病毒轉(zhuǎn)移所需各轉(zhuǎn)移蛋白之前，該蛋白迅速反饋地抑制感染細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成。這樣，病毒既不能增殖也不能擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞中去。如工程植物中預(yù)存一定數(shù)量帶有病毒復(fù)制酶能識別的該病毒負(fù)鏈基因組RNA的3′端(即原來正鏈基因組RNA的5′端)的毒蛋白負(fù)鏈RNA，在該病毒入侵后，病毒感染細(xì)胞中也會以類似機(jī)制優(yōu)先生成毒白和把病毒限制于原初感染的細(xì)胞中。
3.在病毒感染的宿主細(xì)胞生成少數(shù)毒蛋白從而使細(xì)胞蛋白質(zhì)合成基本被抑制和病毒復(fù)制被抑制后，該細(xì)胞還有RNA和蛋白質(zhì)降解活性。如它的RNA酶能把病毒RNA完全降解，則毒蛋白和病毒蛋白也將隨之被清除，該細(xì)胞有可能恢復(fù)到未被病毒感染前的狀態(tài)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果由于本法通過病毒自身誘導(dǎo)，反饋地抑制它自己繁殖和擴(kuò)散所依賴的宿主蛋白質(zhì)合成而達(dá)到控制病毒病的作用，所以，與過去的方法相比，1.本法可完全控制病毒病的發(fā)展。例如，可以用本法得到的一種工程植株能抵制煙草花葉病毒在工程植株中的擴(kuò)散，2.本法適于控制一年生和多年生、有性繁殖和無性繁殖等多種植物抗病毒。3.農(nóng)業(yè)上最主要的病毒病害大部份由帶亞基因組的正鏈RNA病毒引起，本發(fā)明適于控制這些病毒引起的植物病害，也適于控制不帶亞基因組的正鏈RNA病毒引起的病毒病害，經(jīng)延伸使用本法，還可控制絕大多數(shù)病毒引起的致植物病毒病害的目的。4.使用本發(fā)明得到的工程植株，平時(shí)不含毒蛋白，病毒感染后只在被感染細(xì)胞中暫時(shí)累積幾個(gè)毒蛋白分子，它們也不會侵入人畜細(xì)胞。這樣的工程植株對植物本身、對人、畜和對環(huán)境都不會帶來不良影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以煙草抗煙草花葉病毒(TMV)引起的花葉病為例。使用的毒蛋白是白喉毒素片段A，它不能進(jìn)入人畜細(xì)胞，只要幾個(gè)分子就足以迅速地嚴(yán)重抑制一個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。這里使用的可被TMV復(fù)制酶識別的片段是外殼蛋白基因讀碼框前的片段。在進(jìn)行重組時(shí)，為確保嵌合基因有高轉(zhuǎn)錄能力和得到正鏈RNA后有高轉(zhuǎn)譯能力，選用了花椰菜花葉病毒強(qiáng)啟動子(CaMV355啟動子)和它的3′末端，保留了原TMV外殼蛋白mRNA5′端完整的非轉(zhuǎn)譯區(qū)堿基。為了保持負(fù)鏈RNA和由它轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈RNA有相當(dāng)好的穩(wěn)定性，我們用原外殼蛋白讀碼框前0.6Kb長的堿基片段放在3′端，而5′端保留了原TMV3′端生成正鏈RNA高級結(jié)構(gòu)所要的堿基序列。這里嵌合基因是通過二元型Ti載體經(jīng)農(nóng)桿菌導(dǎo)入植株的。整個(gè)操作流程如下面所示1.嵌合基因重組流程(1)帶TMV3′末端包括外殼蛋白基因cDNA的pOM5Ⅱ2經(jīng)HindⅢ酶切，用Klenow酶填平，ApaⅠ部份酶切，取所需HindⅢ-ApaⅠ-ApaⅠ片段，導(dǎo)入載體pRT100花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子和它的3′末端間的ApaⅠ、SmaⅠ切口中，得pKC503。
(2)pKC503用SacⅠ及ClaⅠ酶切，去除原外殼蛋白基因片段，與合成的SacⅠ-NcoⅠ-SalⅠ-DraⅠ多聚接頭及pKC503上原來的DraⅠ-ClaⅠ的61個(gè)堿基對的片段相連，得pKC505。
(3)pTH-1的帶白喉毒素(DT)片段A基因的NcoⅠ到EcoRI片段，先導(dǎo)入pRAJ275的NcoⅠ、EcoRI切口中，使NcoⅠ前接上SacⅠ切口，得pRAJ275DT。將pRAJ275DT用SalⅠ和HpaⅠ酶切并把帶DT片段A基因的SalⅠ-HpaⅠ片段導(dǎo)入pKC505的SalⅠ和SacⅠ切口間，SacⅠ已預(yù)先用T4DNA聚合酶填平，得pKC525。
這里和后面的重組操作均按T.Maniatis等人所著“MolecularCloningALaboratoryManual”(ColdSpringHarborLaboratory1982)一書所敘方法進(jìn)行。
2.嵌合基因?qū)朕r(nóng)桿菌和導(dǎo)入煙草產(chǎn)生抗煙草花葉病毒工程植株的方法(1)將pKC525中的嵌合基因，用HindⅢ切出，導(dǎo)入Bin19載體的HindⅢ切口，得pKC545。這樣，嵌合的毒蛋白基因就被置于能使植物抗卡那霉素的嵌合的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因邊上;二者均在Bin19載體的T-DNA區(qū)內(nèi)。
(2)pKC545通過pRK2013的協(xié)助，經(jīng)常規(guī)接合轉(zhuǎn)移操作，導(dǎo)入帶LBA4404的農(nóng)桿菌中，用混有卡那霉素、鏈霉素和利福霉素的LB培養(yǎng)基篩選，抑制對卡那霉素敏感的僅帶LBA4404的農(nóng)桿菌和對鏈霉素、利福霉素敏感的帶pKC545或pPK2013的大腸桿菌，就篩出所需的帶LBA4404和pKC545的農(nóng)桿菌pAKC545。LBA4404為含Vir區(qū)而不含T-DNA區(qū)的Ti質(zhì)粒，農(nóng)桿菌與受傷的植物組織、細(xì)胞接觸時(shí)，它的Vir基因表達(dá)產(chǎn)物將使pKC545的T-DNA區(qū)進(jìn)入植物細(xì)胞。
(3)農(nóng)桿菌pAKC545接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)12小時(shí)，以LB液體培養(yǎng)基稀釋一至三倍，與不抗卡那霉素的無菌煙草葉新切的碟片接觸5至10分鐘，經(jīng)無菌濾紙吸去菌液后，葉碟片轉(zhuǎn)到MS0固體培養(yǎng)基，在每天連續(xù)照光12小時(shí)的25℃培養(yǎng)箱中放置三天，轉(zhuǎn)于帶6-卞基嘌呤(1μg/ml)、頭孢
肟鈉(300μg/ml)和卡那霉素(100μg/ml)的MS固體培養(yǎng)基上，再在相同培養(yǎng)條件下放置約20天，得很多轉(zhuǎn)化煙草的幼芽;切取這些幼芽，轉(zhuǎn)到帶上述抗菌素但無6-芐基嘌呤的MS固體培養(yǎng)基上生根，約20天后得抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化煙草苗，把這些煙草苗從培養(yǎng)基中移栽到溫室，待成活后，用TMV感染，即可篩出完全抗TMV的工程煙株。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，是一種控制植物病毒病的基因工程方法，其特征在于向植物導(dǎo)入平常不能表達(dá)成蛋白質(zhì)，但在被病毒感染的細(xì)胞中能表達(dá)成毒蛋白的嵌合基因，使被感染細(xì)胞“自殺”，從而控制病毒病。具體方法是(1)毒蛋白基因讀碼框5′端接上一段或串聯(lián)接上幾段被一或幾種病毒的復(fù)制酶利用來從負(fù)鏈RNA產(chǎn)生正鏈亞基因組RNA所要的堿基序列，重組成在宿主植物中能表達(dá)為負(fù)鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(2)毒蛋白基因讀碼框5′端接上被幾種病毒的復(fù)制酶共同識別和利用來從負(fù)鏈RNA產(chǎn)生正鏈亞基因組RNA所要的同源堿基序列，重組成在宿主植物中能表達(dá)為負(fù)鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(3)毒蛋白基因讀碼框5′端接上病毒RNA完整的5′端非轉(zhuǎn)譯區(qū)，重組成在宿主植物中能表達(dá)為負(fù)鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(4)用DNA病毒的一個(gè)必需在該病毒產(chǎn)物誘導(dǎo)下才表達(dá)的基因的被該病毒產(chǎn)物識別順序和毒蛋白基因讀碼框組成在植物中能表達(dá)為正鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(5)用植物中只在病毒入侵后才特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因的啟動子或增強(qiáng)子加啟動子與毒蛋白讀碼框組成在植物中能表達(dá)為正鏈毒蛋白RNA的嵌合基因；(6)嵌合基因有強(qiáng)啟動子，使正鏈毒蛋白RNA高效轉(zhuǎn)譯的堿基順序和使負(fù)鏈和正鏈RNA穩(wěn)定的順序，嵌合基因通過農(nóng)桿菌Ti載體或DNA直接轉(zhuǎn)移法導(dǎo)入植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種控制植物病毒病的基因工程方法，其特征在于所述的毒蛋白基因是白喉毒素片段A基因，綠膿假單胞桿菌外毒素A基因等細(xì)菌的修飾延長因子2的酶蛋白基因;資源植物商陸抗病毒蛋白等和小麥、玉米、苦瓜等的核糖體失活蛋白基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種控制植物病毒病的基因工程方法，其特征在于所述的病毒是煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯病毒X、馬鈴薯病毒Y、苜蓿花葉病毒、雀麥花葉病毒、大麥條斑花葉病毒等帶亞基組的正鏈RNA病毒和不帶亞基因組的正鏈RNA病毒和DNA病毒。
全文摘要
本發(fā)明是一種控制植物病毒病的基因工程方法。通過向植物導(dǎo)入平常不表達(dá)或只表達(dá)成負(fù)鏈RNA的能強(qiáng)烈抑制宿主蛋白質(zhì)合成的毒蛋白嵌合基因，在病毒感染的細(xì)胞中經(jīng)病毒誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯生成毒蛋白，反饋地抑制該病毒的復(fù)制和在植物中的擴(kuò)散。適于控制含亞基因組正鏈RNA病毒或不含亞基因組正鏈RNA病毒、以及DNA病毒引起的一年生、多年生、無性繁殖、有性繁殖的植物的病毒病。此法對植物本身、人畜和環(huán)境無不良影響。
文檔編號A01H1/00GK1033645SQ8810559
公開日1989年7月5日 申請日期1988年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1988年10月22日
發(fā)明者王鈞 申請人:中國科學(xué)院上海植物生理研究所