專(zhuān)利名稱(chēng)：草甘膦抗性轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能耐受草甘膦作為活性成分的除草劑處理的轉(zhuǎn)基因甜菜植株。
甜菜田間的雜草是農(nóng)場(chǎng)主的主要問(wèn)題。它們與農(nóng)作物競(jìng)爭(zhēng)因此而降低產(chǎn)量。現(xiàn)在沒(méi)有單一的除草劑能有效控制所有雜草而不損傷甜菜作物本身(Miller等，甜菜研究雜志，263-4，1989)。實(shí)際上，農(nóng)場(chǎng)主使用除草劑的混合物，而它們也降低農(nóng)作物生長(zhǎng)。同時(shí)，已發(fā)展出對(duì)所述除草劑抗性的野草種類(lèi)的數(shù)目持續(xù)增加(Schweizer等，甜菜研究雜志，281-23，1991)，由此加重了甜菜田間雜草控制問(wèn)題。
Roundup是廣譜的、環(huán)境上優(yōu)選的抑制雜草和農(nóng)作物種類(lèi)的除草劑。本發(fā)明的內(nèi)容中，1升除草劑Roundup溶液含有260g其活性成分，即被葉吸收的草甘膦(常用名為N-膦?；谆?甘氨酸)。到目前為止，在20年使用期間沒(méi)有發(fā)展出草甘膦抗性雜草(Holt等，植物生理學(xué)年鑒，1993)；另外在甜菜中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)草甘膦的耐受性。而且Roundup的預(yù)先使用在甜菜田間控制雜草方面比甜菜農(nóng)業(yè)中常用的含有苯敵草、苯嗪草酮、甜菜呋的除草劑混合物更有效(Madsen等，雜草研究，35105-111，1995)。
草甘膦通過(guò)不可逆地與5-烯醇丙酮酸莽草酸鹽-3-磷酸合成酶(epsps)結(jié)合抑制芳香族氨基酸的生物合成。在葉綠體中，此酶催化莽草酸鹽-3-磷酸和烯醇磷酸丙酮酸形成5-烯醇丙酮酸-3-磷酸和磷酸。在施用除草劑后約一周，可看到肉眼可見(jiàn)的效應(yīng)，包括萎蔫、黃化后完全變褐，植物組織的萎凋和根的腐爛。
為賦予農(nóng)作物種類(lèi)草甘膦耐受性，研究集中于向植物導(dǎo)入能增加草甘膦耐受性的epsps基因。除了植物，細(xì)胞和真菌也天然地表達(dá)epsps酶活性。發(fā)現(xiàn)來(lái)自農(nóng)桿菌屬種類(lèi)的cp4/epsps賦予對(duì)草甘膦的耐受性(Barry等，“氨基酸合成的抑制劑賦予農(nóng)作物植株對(duì)草甘膦耐受性的策略，于植物中氨基酸的生物合成和分子調(diào)控，Singh等(編輯)，美國(guó)植物生理學(xué)學(xué)會(huì)，第139-145頁(yè)，1992)。將cp4/epsps基因?qū)氪蠖购陀妥延筒嗽谔镩g條件產(chǎn)生對(duì)葉面施用除草劑的耐受性(Delannay等，農(nóng)作物科學(xué)，351461-1467，1995；Padgette等，農(nóng)作物科學(xué)，351451-1461，1995)。
從農(nóng)桿菌屬種類(lèi)LBAA分離的草甘膦氧化還原酶(gox)(Barry等，同上)將草甘膦降解成氨甲基膦酸(對(duì)植物無(wú)毒的化合物)。cp4/epsps和草甘膦氧化酶(gox)基因的結(jié)合已成功地用于得到對(duì)草甘膦有抗性的轉(zhuǎn)基因小麥(Zhou等，植物細(xì)胞報(bào)告，15159-163，1995)。
本發(fā)明的目的是提供對(duì)足以實(shí)現(xiàn)最佳除草劑活性的高劑量的草甘膦有耐受性的甜菜植株。這樣的植株可進(jìn)一步通過(guò)與優(yōu)良甜菜株系回交來(lái)改良以優(yōu)化農(nóng)業(yè)特性如產(chǎn)量、病原體抗性等。
甜菜可以用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法來(lái)轉(zhuǎn)化(Fry等，植物分子生物學(xué)第三次國(guó)際會(huì)議，Tuscon，Arizona，USA；D′Halluin等，生物/技術(shù)，10309-314，1992；Konwar，植物生化&生物技術(shù)雜志，337-41，1994)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化常常導(dǎo)致多于一個(gè)拷貝的T-DNA整合入植物基因組。優(yōu)選地將要整合的基因?qū)隩-DNA，使它位于T-DNA右邊則不是左邊界附近，它幾乎總是會(huì)轉(zhuǎn)移至植物中。
根據(jù)本發(fā)明所述的植株對(duì)每公頃大約3×6升除草劑Roundup(每公頃約18升)的處理有耐受性。獲得良好雜草控制的總標(biāo)準(zhǔn)劑量根據(jù)雜草壓力在每公頃4-6升之間變動(dòng)。在這些濃度時(shí)，除草劑處理不產(chǎn)生對(duì)植物活力和葉褪綠的任何可測(cè)到的影響。根據(jù)本發(fā)明所述的植株表現(xiàn)的耐受性由轉(zhuǎn)基因表達(dá)的cp4/epsps酶活性賦予。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案已于1997年10月24日保存于國(guó)立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(23St Macher Drive，Aberdeen AB2 1RY，ScotlandUK)，保藏號(hào)為97087006/2。
因此本發(fā)明涉及表達(dá)cp4/epsps酶活性的甜菜植株及其后代。具體地，本發(fā)明涉及對(duì)每公頃約4至約8升Roundup處理有耐受性的甜菜植株及其后代。
根據(jù)本發(fā)明所述的植株可以通過(guò)使用在T-DNA左和右邊界序列間含有如SEQ ID No5所述編碼尤其是cp4/epsps的DNA片段的轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行常規(guī)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化得到。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因的基因組內(nèi)缺失T-DNA左和右邊界序列并導(dǎo)致轉(zhuǎn)化載體DNA相當(dāng)大部分的缺失而保留了編碼cp4/epsps的DNA的轉(zhuǎn)化結(jié)果(RRMax)提供了優(yōu)良的草甘膦耐受性。特別是發(fā)現(xiàn)以SEQ ID No1為特征的DNA片段整合入基因組高度重復(fù)的區(qū)域同時(shí)取代了該基因組重復(fù)序列的部分。與所用轉(zhuǎn)化載體中與T-DNA右邊界序列相連的轉(zhuǎn)基因序列部分直接相鄰的基因組DNA具有SEQ ID No2中給出的序列。與整合的轉(zhuǎn)基因DNA的另一末端直接相鄰的基因組DNA具有SEQ ID No3中給出的序列。新形成的基因組DNA排列的完整DNA序列在SEQ ID No4中給出。
因此，本發(fā)明涉及甜菜植株及其后代，其中以SEQ ID No1的核苷酸序列為特征的DNA形成植物基因組的部分，并且介所述的核苷酸序列取代了植物基因組內(nèi)高度重復(fù)DNA序列。
此處優(yōu)選的是其中與所述核苷酸序列直接連接的那些基因組部分分別以SEQ ID No2和SEQ ID No3的核苷酸序列為特征的甜菜植株及其后代。
進(jìn)一步優(yōu)選的是其中以SEQ ID No4的核苷酸序列為特征的DNA形成植物基因組的部分的甜菜植株及其后代。
上述經(jīng)操作已導(dǎo)入除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因種子和植株通過(guò)性繁殖或營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)傳代并因此可以在后代植株中保持和繁殖。通常所述的維持和繁殖使用已知的農(nóng)業(yè)方法，這些方法發(fā)展來(lái)適應(yīng)特別目的如耕種、插種或收獲。正在生長(zhǎng)的農(nóng)作物易于受由昆蟲(chóng)或感染引起的侵襲和損傷，因此采取措施以控制植物病毒、昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)和其它對(duì)提高產(chǎn)量不利的條件。這些措施包括機(jī)械措施如耕地或除去受侵染的植物和施用農(nóng)業(yè)化學(xué)品如殺真菌劑、殺精劑、殺線蟲(chóng)劑、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、成熟劑和殺昆蟲(chóng)劑。
根據(jù)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物和種子的除草劑耐受性可進(jìn)一步在植物育種中得到應(yīng)用，以開(kāi)發(fā)具有改良特性(如蟲(chóng)害、除草劑或逆境耐受性，改良的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高的產(chǎn)量，引起更小的由于倒伏或斷裂的損失的改良結(jié)構(gòu))的植物。各種育種步驟的特征在于成熟的人類(lèi)干預(yù)如選擇要雜交的株系、引導(dǎo)親本株系的傳粉或選擇適當(dāng)?shù)暮蟠仓?。根?jù)所需的特性采取不同的育種措施。相關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知并且包括但不限于雜交、近交、回交育種、多線育種、品種摻合、種間雜交、非整倍體技術(shù)等。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因種子和植株可用于培育改良的植物株系，例如用于提高傳統(tǒng)方法如除草劑或殺蟲(chóng)劑處理的效力或由于其修飾的遺傳特性而允許用所述方法施用。選擇性地，可以得到具有改良的逆境耐受性的新農(nóng)作物，由于它們的優(yōu)化遺傳裝備，產(chǎn)生比不能耐受相對(duì)不利發(fā)育條件的產(chǎn)品更高質(zhì)量的收獲產(chǎn)品。
在種子生產(chǎn)中，發(fā)芽質(zhì)量和種子的均一性是必需的產(chǎn)品特征，而農(nóng)場(chǎng)主收獲和出售的種子的發(fā)芽質(zhì)量和種子均一性并不重要。因?yàn)槭罐r(nóng)作物與其它農(nóng)作物和雜草種子分開(kāi)、控制種生疾病和生產(chǎn)具良好發(fā)芽率的種子是困難的，所以在培養(yǎng)、控制和銷(xiāo)售純種子領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的種子生產(chǎn)者已開(kāi)發(fā)了相當(dāng)廣泛和成熟的種子生產(chǎn)技術(shù)。因此農(nóng)場(chǎng)主常用的方法是購(gòu)買(mǎi)經(jīng)鑒定符合特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種子而不是使用從他自己的農(nóng)作物收獲的種子。用作種子的繁殖材料習(xí)慣用含有殺蟲(chóng)劑、殺昆蟲(chóng)劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲(chóng)劑、殺軟體動(dòng)物劑或其混合物的保護(hù)劑涂層處理。常規(guī)使用的保護(hù)劑涂層包含諸如克菌丹、萎銹靈、福美雙(TMTD)、methalaxyl(Apron)和蟲(chóng)螨磷(Actellic)的化合物。如果需要，將這些化合物與其它載體、表面活性劑或配制領(lǐng)域常規(guī)使用的促進(jìn)施用佐劑一起配制以提供針對(duì)由細(xì)菌、真菌或動(dòng)物蟲(chóng)害引起的損傷的保護(hù)。保護(hù)劑涂層可以通過(guò)用液體制品浸漬繁殖材料或通過(guò)用混合的干或濕配方包裹來(lái)施用。也可能是其它施用方法如直接處理芽或果實(shí)。
本發(fā)明的另一方面提供新的農(nóng)業(yè)方法如上面列舉的方法，其特征在于使用根據(jù)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物材料或轉(zhuǎn)基因種子。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、組織、器官、種子或植物部分。本發(fā)明也包括轉(zhuǎn)基因植物后代及后代的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、組織、器官、種子和植物部分。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有能表達(dá)cp4/epsps的具Roundup耐受性的甜菜種子的商品包及其使用說(shuō)明。本發(fā)明內(nèi)優(yōu)選的是包含含有穩(wěn)定整合入其基因的具有SEQ ID No1所示核苷酸序列的DNA片段的轉(zhuǎn)基因植物種子的商品包。
所用的轉(zhuǎn)化方法學(xué)總結(jié)如下(a)用含有如SEQ ID No5中所示的編碼cp4/epsps的DNA片段的載體，使用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的甜菜子葉。
(b)在草甘膦存在時(shí)再生芽；(c)將芽轉(zhuǎn)移到溫室的土壤中；(d)用處理苗；(e)對(duì)植株活力和葉褪綠進(jìn)行目測(cè)評(píng)級(jí)；(g)選擇未受草甘膦處理影響的具有正?；盍腿~子的完全正常的植株；并且(h)使用傳統(tǒng)育種技術(shù)繁殖所選植株。
具體地，在選擇8-12周后，在約0.1至約10mM，優(yōu)選地1mM草甘膦存在時(shí)再生芽。每個(gè)轉(zhuǎn)基因芽進(jìn)一步繁殖成10個(gè)拷貝，在將它轉(zhuǎn)移至溫室中生根前，可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析cp4/epsps轉(zhuǎn)基因的存在。溫室中光照條件是16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗，溫度為22±2℃。在3-4葉期，用每公頃0.1-20升，優(yōu)選地1升劑量的Roundup水溶液噴灑苗。草甘膦施用后2周基于0(死亡植株)到9(完受未受影響的植制)的等級(jí)對(duì)單個(gè)植物進(jìn)行植株活力和植物褪綠的目測(cè)損傷評(píng)級(jí)。0-3的評(píng)級(jí)是易感植物的特征。3-7的評(píng)級(jí)表明耐受性的低至中間水平，8或9的評(píng)級(jí)表明耐受性的良好水平。具體地，評(píng)級(jí)有以下意義9與未處理的對(duì)照相同的未受影響的植株8只有葉尖上很小的壞死，少于5％的葉面積受到影響并黃化7葉尖上很小的壞死開(kāi)始卷曲，少于5％的葉面積受到影響并黃化6，5，4壞死和葉卷曲增強(qiáng)；葉變得比正常的更小3，2沒(méi)有或非常有限的葉生長(zhǎng)；所有的葉子卷曲并受壞死影響1無(wú)植物生長(zhǎng)，最多5％的植株保持綠色0死亡植株為收集田間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)一步繁殖或培育有正常活力并且不受草甘膦處理影響的(評(píng)分9)植株。
優(yōu)選地，使用含有具有SEQ ID No5給出序列的DNA片段的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中DNA片段含有cp4/epsps和gox基因(都已被報(bào)道賦予某些植物種類(lèi)對(duì)草甘膦的耐受性)和報(bào)告基因UidA基因(編碼β-葡糖醛酸酶)。增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子(odell等，自然313810-812，1995)與UidA基因相連，玄參花葉病毒(FMV)啟動(dòng)子(Gouwda等，J.Cell.Biochem.Suppl.13D301，1989)與cp4/epsps和gox基因相連。在cp4/epsps和gox基因的上游插入轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Gasser等，生物化學(xué)雜志，2634280-4289，1988)以將兩個(gè)蛋白靶向葉綠體。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的一個(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)果不受每公頃多達(dá)約3×6升(約18升)除草劑Roundup劑量的影響。分子分析表明·有整合于單一位點(diǎn)的單拷貝轉(zhuǎn)基因DNA；·整合的DNA編碼cp4/epsps并對(duì)應(yīng)于截短的載體DNA；·整合的DNA取代了基因組DNA片段并具有SEQ ID No1所示的序列；·與整合的DNA直接相鄰的基因組DNA的特征在于SEQ ID No2和SEQ ID No3的序列，導(dǎo)致SEQ ID No4的新基因組序列排列；
·cp4/epsps和UidA基因是完整的，而gox因是截?cái)嗟?；·其它載體序列不存在于轉(zhuǎn)基因植物中。
目前可以知道這一信息，即來(lái)自根據(jù)本發(fā)明所述的特定轉(zhuǎn)化結(jié)果的植株可以容易地通過(guò)PCR方法與其它甜菜植株區(qū)分開(kāi)。適當(dāng)?shù)囊飳?duì)組合使得可以特異地鑒定僅存在于直接或間接來(lái)自相同轉(zhuǎn)化結(jié)果的植物的基因組DNA序列。這樣的事件不以任何方式限制在由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化得到的那些結(jié)果，而也可以來(lái)自biolistic轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
因此本發(fā)明涉及甜菜植株及其后代，其特征在于用其基因組DNA為模板的PCR導(dǎo)致以下片段的擴(kuò)增當(dāng)使用以SEQ ID NoB和SEQ ID Noa的序列為特征的寡核苷酸引物對(duì)時(shí)，739bp DNA片段；或者當(dāng)使用以SEQ ID NoD和SEQ ID Noe的序列為特征的寡核苷酸引物對(duì)時(shí)，834bp DNA片段；或者當(dāng)使用以SEQ ID NoA和SEQ ID Nob的序列為特征的寡核苷酸引物對(duì)時(shí)，1057bp DNA片段；或者當(dāng)使用以SEQ ID NoC和SEQ ID Nof的序列為特征的寡核苷酸引物對(duì)時(shí)，1224bp DNA片段。
實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了得到本發(fā)明和隨后的結(jié)果時(shí)所用的材料和方法。它們通過(guò)舉例說(shuō)明提供，并且它們的復(fù)述不應(yīng)認(rèn)為是要求權(quán)利的本發(fā)明的限制。實(shí)施例1甜菜轉(zhuǎn)化用含有cp4/epsps和gox因(能賦予草甘膦耐受性)、nptII基因(典型對(duì)抗生素卡那素的抗性)及報(bào)告基因uidA(編碼β-葡糖醛酸酶。GUS)的載體轉(zhuǎn)化A1012基因型甜菜。nptII和uidA基因與加強(qiáng)的35S啟動(dòng)子(odell等，自然，313810-812，1995)功能性連接，而cp4/epsps和gox基因在玄參花葉病毒(FMV)啟動(dòng)子(Gouwda等，J.Cell.Biochem.Suppl.13D301，1989)的控制下。另外，cp4/epsps和gox基因在5′與轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Gasser等，生物化學(xué)雜志，2634280-4289，1988)連接以使兩個(gè)蛋白靶向葉綠體。cp4/epsps和uidA使用E9 3′終止子序列，而gox和nptII使用相應(yīng)的NOS 3′序列。
使用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的甜菜(Beta vulgaris.L)。使用1mM濃度的草甘膦作為選擇劑，如Fry等(“使用根瘤農(nóng)桿菌的基因型依賴(lài)的甜菜轉(zhuǎn)化”，第三次植物分子生物學(xué)國(guó)際會(huì)議，Tuscon，Arizona，USA，1991)和Konwar(植物生物化學(xué)及生物技術(shù)雜志，337-41，1994)所述使植物再生。為殺滅根癌農(nóng)桿菌，將子葉在含500mg/l頭孢的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)三次(45-50rpm，60分鐘)。在1mM草甘膦和500mg/l頭孢噻肟上篩選8-12周(包括每三周轉(zhuǎn)至新鮮培養(yǎng)基上)后分析再生芽。將每一轉(zhuǎn)基因芽進(jìn)一步微量繁殖(micropropagate)成十個(gè)拷貝，分析轉(zhuǎn)基因的存在并轉(zhuǎn)移至溫室中生根。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用于確定cp4/epsps基因的存在。從再生的體外芽收集20mg植物材料至微量離心管?；旧习凑誘ai等，植物分子生物學(xué)報(bào)告，8297-303，1990抽提總DNA。次要的改進(jìn)是加入500μl含有50mM Na-EDTA，1.25％SDS(重量/體積)，0.38％Na-Bisulfite(重量/體積)和200μg/ml蛋白酶K的100mM Tris-HCl(pH8.0)并于65℃溫育2小時(shí)。挑出未溶解的葉材料并于-20℃冷凍和沉淀總DNA 2小時(shí)。用Perkin-Elmer Gene-Amp PCR試劑盒(Perkin-Elmer公司)按照所含的說(shuō)明進(jìn)行PCR，使用含有10mMTris-HCl(pH8.3)，500mM KCL，30mM MgCl2，1.0％NonidetP-40(重量/體積)，24％蔗糖(重量/體積)中的0.4μM甲酚紅和Taq Start Antibody(Clontech)的修飾的10×反應(yīng)緩沖液。為擴(kuò)增cp4/epsps序列，使用如下引物(Shah等，科學(xué)，233478-481，1986)5′-CAC CGG TCT TTT GGA AGG TGA AG-3′(SEQ ID NO6)和5′-AAC GAG ACC CAT AAC GAG GAA GC-3′(SEQ ID NO7).為擴(kuò)增基因間調(diào)控序列(surA，surB)，使用如下引物5′-AAA CAG TCC CGT GCA TCC CCA AC-3′(SEQ ID NO8)和5′-GAC GCT CTC CTT GAT TCT GTC CC-3′(SEQ ID NO9).
不同雙元載體間未見(jiàn)到轉(zhuǎn)化效率的不同。
將微量繁殖的芽轉(zhuǎn)移到溫室的土壤中。溫室中的光照條件是200μmol m-2sec-1(Osram Power Star HQI-Z，400w)，16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，溫度為22±2℃。用Roundup處理來(lái)自260個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子的三至四葉期小苗。使用刻度噴霧器以每公頃1升的劑量(360g.a.i.l-1)施用除草劑的水溶液。草甘膦施用后2周，基于0(完全葉壞死)至9(無(wú)可見(jiàn)影響)的等級(jí)，對(duì)每個(gè)植株進(jìn)行植物毒性影響的目測(cè)損傷評(píng)級(jí)。對(duì)于75個(gè)不同的轉(zhuǎn)化子，檢測(cè)到的植物毒性效應(yīng)在評(píng)分0-6之間變動(dòng)。其它185個(gè)(75％)轉(zhuǎn)化子評(píng)分為7或更高，這意味著在用除草劑處理之后，它們表現(xiàn)較少或不可見(jiàn)的影響。將它們與非轉(zhuǎn)基因甜菜雜交以產(chǎn)生F1子代用于隨后的田間實(shí)驗(yàn)評(píng)估。
進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)以評(píng)估田間條件下的不同轉(zhuǎn)化結(jié)果。每一塊地包含三排，每排9米長(zhǎng)，行間距0.5米。在每一塊地插種一個(gè)不同的轉(zhuǎn)化子。在子葉期每公頃1升(360g.a.i.l-1)的初始Roundup施用去除非轉(zhuǎn)基因植物后，人工挑選各行至最終標(biāo)準(zhǔn)每20厘米1個(gè)植株。每一小塊地分成獨(dú)立處理的三部分。一部分用傳統(tǒng)的除草劑苯嗪草酮(0.1kg a.i.ha-1)、苯敵草(0.2kg a.i.ha-1)和甜菜呋(0.1kg a.i.ha-1)處理。另一部分用每公頃2升Roundup處理2次(1400g a.i.ha-1)，第三部分用4升Roundup處理2次(2880ga.i.l-1)，在二葉期和四葉期處理植物。最后施用后二周，評(píng)估植物由于施用除草劑的植物毒性效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)癥狀從完全易感變化至完全耐受。觀察到溫室中評(píng)分和田間實(shí)驗(yàn)中評(píng)分的不同。這可能是由于溫室和田間實(shí)驗(yàn)的環(huán)境不同，包括在玻璃下缺少紫外光。與用傳統(tǒng)除草劑混合物處理相比，用不同劑量的Roundup處理的地區(qū)的植物間沒(méi)有形態(tài)學(xué)或生理學(xué)上的變化。兩個(gè)轉(zhuǎn)化子在用每公頃2升2次和4升2次處理后，表現(xiàn)對(duì)Roundup的高度耐受性。
用Roundup噴酒后，通過(guò)植株活力(Tr.vig)和葉褪綠(Tr.ch1)評(píng)級(jí)測(cè)定耐受性。不同的評(píng)級(jí)有如下意義9與未處理的對(duì)照相同的未受影響的植株8只有葉尖上很小的壞死，少于5％的葉面積受到影響并黃化7葉尖上很小的壞死開(kāi)始卷曲，少于5％的葉面積受到影響并黃化6，5，4壞死和葉卷曲增強(qiáng)；葉變得比正常的更小3，2沒(méi)有或非常有限的葉生長(zhǎng)；所有的葉子卷曲并受壞死影響1無(wú)植物生長(zhǎng)，最多5％的植株保持綠色0死亡植株用1+4+4升Roundup/公頃(共9升/公頃)噴灑22個(gè)不同的轉(zhuǎn)化結(jié)果(1-22項(xiàng))和一個(gè)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?23項(xiàng))。目測(cè)損傷評(píng)級(jí)的結(jié)果在下表中給出。
RRMax)(非轉(zhuǎn)基因植物)實(shí)施例2 整合的轉(zhuǎn)基因DNA的拷貝數(shù)通過(guò)對(duì)在所用轉(zhuǎn)化載體的左和右邊界序列之外延伸的限制性片段的Southern印跡分析測(cè)定具有最高草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)化子(RRMax)的基因組內(nèi)整合的轉(zhuǎn)基因DNA的拷貝數(shù)。
按照Saghai-Maroof等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，818014-8018，1984，從250mg冷凍干燥的甜菜材料分離來(lái)自RRMax和具有相同遺傳學(xué)的非轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA。所用轉(zhuǎn)化載體的DNA作用為陽(yáng)性對(duì)照。用120單位的限制性酶在400μl總體積中于37℃消化15μgDNA 4小時(shí)。使消化的DNA沉淀并重新溶解于50μl總體積中。消化的DNA、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)的分子大小標(biāo)記(用EcoRI和HindIII消化的λDNA)在0.8％瓊脂糖凝膠上分離。用溴化乙錠觀察DNA，并包括尺子進(jìn)行攝影。然后將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond N+膜上并如Ausubel等(編輯)，于“現(xiàn)代分子生物學(xué)常用方法”，Green PublishingAssociates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.，New York，1987所述與探針雜交。
通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，其中所用的轉(zhuǎn)化載體作用為反應(yīng)的模板DNA)制備與cp4/epsps基因序列(SEQ ID No5)的975-1766堿基對(duì)和gox基因序列(SEQ ID No5)的7108-7535堿基對(duì)互補(bǔ)的探針。cp4/epsps探針用于測(cè)定鄰近右邊界區(qū)域的插入數(shù)。gox探針用于測(cè)定鄰近左邊界區(qū)域的插入數(shù)。使用BIO 101(La Jolla，CA)的Geneclean II試劑盒純化PCR產(chǎn)物。使用AmershamInternational(Little Chalfont，UK)的MegaprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行探針的32P標(biāo)記。
拷貝數(shù)測(cè)定可以通過(guò)對(duì)鄰近右邊界區(qū)域的基因組DNA的分析進(jìn)行。用限制性酶NcoI消化基因組DNA，NcoI切割35s啟動(dòng)子和uidA基因間的和甜菜基因組內(nèi)的質(zhì)粒來(lái)源的序列。用cp4/epsps基因的內(nèi)部PCR片段探測(cè)膜。用NcoI消化并用cp4/epsps探針雜交后，在RRMax中檢測(cè)到4.7kb的單一條帶。這證明了轉(zhuǎn)移DNA在單一位點(diǎn)的單拷貝。
拷貝數(shù)測(cè)定可以通過(guò)對(duì)鄰近左邊界區(qū)域的基因組DNA的分析進(jìn)行。用限制性酶HindIII消化基因組DNA，HindIII切割gox的FMV啟動(dòng)子和uidA基因的E93′終止子間的和甜菜基因組內(nèi)的質(zhì)粒來(lái)源的序列。在用HindIII消化并用gox探針雜交后，檢測(cè)到轉(zhuǎn)化子在RRMax中的2.0kb的單一條帶。因?yàn)轭A(yù)期的最小片段大小是≥4.4kb，所以結(jié)果表面在轉(zhuǎn)移入植物基因組DNA的過(guò)程中質(zhì)粒DNA的截?cái)?。而且結(jié)果證明了轉(zhuǎn)移DNA單拷貝整合在單一位點(diǎn)。實(shí)施例3 RRMax整合位點(diǎn)的序列分析按照Saghai-Maroof等，同上，從250mg冷凍干燥的甜菜葉材料分離RRMax基因組DNA。制備在XhoI克隆位點(diǎn)中帶有9-23kb大小插入的λFIXII噬菌體文庫(kù)。并用cp4/epsps和gox探針探測(cè)以篩選覆蓋整合結(jié)果的推測(cè)克隆。檢測(cè)到與cp4/epsps或gox探針雜交的總共25個(gè)噬菌體。發(fā)現(xiàn)分別與cp4/epsps探針和gox探針雜交的2個(gè)克隆。純化其中之一(Fritsch等，1987)并通過(guò)Southern印跡分析和PCR進(jìn)一步評(píng)估。它含有15-16kb的基因組DNA插入，包括轉(zhuǎn)基因DNA和側(cè)翼的甜菜序列。所述側(cè)翼序列通過(guò)PCR、使用與FMV啟動(dòng)子或gox基因序列匹配的引物結(jié)合與λFIXII克隆元件中的序列匹配的引物(詳細(xì)的序列在下面1中給出)來(lái)擴(kuò)增。整合的DNA/甜菜接合區(qū)域通過(guò)Sanger雙脫氧介導(dǎo)的鏈終止法使用Applied Biosystem，373A型，2.1.1版測(cè)序。所用的測(cè)序引物在表2中給出。
表1用于擴(kuò)增邊界區(qū)域的引物
序列分析表明整合在RRMax基因組中的轉(zhuǎn)基因DNA具有SEQ IDNo1中給出的核苷酸序列。整合起始點(diǎn)位于右邊界序列和FMV啟動(dòng)子之間并終止于gox起始密碼子下游的897堿基對(duì)。截短的gox基因的翻譯終止密碼子可在接合點(diǎn)下游的130和235堿基對(duì)找到。在gox起始密碼子下游210堿基對(duì)識(shí)別了一個(gè)HindIII位點(diǎn)，而在下游650堿基對(duì)識(shí)別了一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(AATAAA)。SEQ ID No2表示了與轉(zhuǎn)基因DNA的右邊界區(qū)域直接相連的基因組DNA序列，而SEQ ID No3表示與轉(zhuǎn)基因DNA的左邊界區(qū)域直接相連的基因組DNA序列。實(shí)施例4 RRMax整合的轉(zhuǎn)基因DNA的特征鑒定為進(jìn)一步鑒定右邊界區(qū)域，用限制性酶BamHI、HindIII、BcII或EcoRI消化基因組DNA和轉(zhuǎn)化載體DNA。在Southern印跡分析中，用實(shí)施例2中所述的cp4/epsps PCR片段探測(cè)切開(kāi)的DNA。與所用的限制性酶無(wú)關(guān)，用不同的限制性酶消化在Southern印跡分析中產(chǎn)生單一片段。檢測(cè)到的片段大小在表3中表示。數(shù)據(jù)表明單一拷貝的DNA已轉(zhuǎn)移至植物中，并且DNA向甜菜植株的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致cp4/epsps基因的完整轉(zhuǎn)移。結(jié)果與實(shí)施例2中的拷貝數(shù)測(cè)定和實(shí)施例3的核苷酸序列一致。
表3 Southern印跡片段大小
為進(jìn)一步鑒定整合的轉(zhuǎn)基因片段，用限制性酶NcoI、BamHI或HindIII消化來(lái)自RRMax的基因組DNA。作為對(duì)照，用相同的限制性酶消化轉(zhuǎn)化載體DNA。用橫跨SEQ ID No5中uidA基因的3796-4837堿基對(duì)的PCR擴(kuò)增的DNA片段探測(cè)印跡。檢測(cè)到的片段大小在表4中表示。與所用的限制性酶無(wú)關(guān)，用不同的限制性酶消化在放射自顯影膠片上產(chǎn)生單一信號(hào)，這表明DNA插入具有與所用轉(zhuǎn)化載體的內(nèi)部DNA相同的特征。
表4 Southern印跡片段大小
為進(jìn)一步鑒定左邊界區(qū)域，用限制性酶NcoI、BamHI、HindIII或EcoRI消化轉(zhuǎn)化載體DNA。在Southern分析中用實(shí)施2中所述的goxPCR片段探測(cè)切開(kāi)的DNA。檢測(cè)到的片段大小在表5中表示。與所用的限制性酶無(wú)關(guān)，用不同的限制性酶消化在放射自顯影膠片上產(chǎn)生單一片段。用限制性酶NcoI、BamHI、HindIII或EcoRI消化預(yù)期識(shí)別已知大小的內(nèi)部片段。但是，這些限制性酶沒(méi)有產(chǎn)生這樣的預(yù)期大小的內(nèi)部片段。這表明NcoI、BamHI、HindIII或EcoRI的限制性位點(diǎn)在轉(zhuǎn)基因植物中缺乏。這些結(jié)果與通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)的gox基因僅部分整合入植物的結(jié)果一致。用限制性酶HindIII消化產(chǎn)生的2kb片段，進(jìn)一步確定了測(cè)序數(shù)據(jù)，即HindIII位點(diǎn)位于基因組中g(shù)ox基因的下游。結(jié)果也表明轉(zhuǎn)基因DNA的單拷貝已轉(zhuǎn)移到植物中。它們與實(shí)施例2中的拷貝數(shù)測(cè)定和實(shí)施例3中的核苷酸序列分析的最初結(jié)果很好地相關(guān)。單一拷貝已整合入植物基因組，而gox基因部分缺失。
表5Southern印跡片段大小
實(shí)施例5其它載體DNA序列的缺失為確定轉(zhuǎn)化結(jié)果RRMax中oriV，ori-322，aad和nptII序列的缺失，Southern印跡分析可以使用覆蓋oriV，ori-322，add和nptII的限制性酶/探針組合進(jìn)行。
用限制性酶NspI消化轉(zhuǎn)化載體DNA，NspI在17處位點(diǎn)切割質(zhì)粒。為了分析，純化覆蓋oriV的NspI片段和覆蓋ori-322和aad的片段并用于Southern印跡分析。具有SEQ ID No26中給出的核苷酸序列的PCR擴(kuò)增的片段用于探針nptII列。用BIO 101(La Jolla，CA)的Geneclean II試劑盒純化。用Amersham International(Littlechalfont，UK)的MegaprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行P32的標(biāo)記。
用限制性酶BamHI消化RRMax的基因組DNA，BamHI在分別位于SEQID No5的堿基對(duì)2321、5544和8413的三處位點(diǎn)切割轉(zhuǎn)化載體DNA。相應(yīng)Southern轉(zhuǎn)移膜與覆蓋oriV探針的雜交沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，必然得出結(jié)論oriV不存在于RRMax中。
相應(yīng)Southern轉(zhuǎn)移膜與覆蓋ori-322和aad的探針的雜交沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。必然得出結(jié)論ori-322和aad序列不存在于RRMax中。
相應(yīng)Southern轉(zhuǎn)移膜與nptII探針的雜交也未檢測(cè)到信號(hào)，這證明nptII基因不存在于RRMax株系中。實(shí)施例6 RRMax株系的穩(wěn)定性如實(shí)施例2中所述的用限制性酶BcII消化基因組DNA并使用cp4/epsps基因作為探針進(jìn)行Southern印跡分析。來(lái)自2和3代的四株植物和來(lái)自4代的5株植物用于此分析。另外，3株非轉(zhuǎn)基因植物用作負(fù)對(duì)照。最初轉(zhuǎn)化結(jié)果的分析得到3.2kb的單一片段。如果導(dǎo)入的DNA在代與代之間穩(wěn)定遺傳，那么預(yù)期在所有植株中有相同的3.2kb片段。
如實(shí)施例2中所述的用HindIII消化基因組DNA并用gox基因的內(nèi)部片段作為探針進(jìn)行Southern印跡分析。最初轉(zhuǎn)化結(jié)果的分析得到2.0kb的單一片段。子代的Southern印跡分析也得到2.0kb的單一片段，表明特征的穩(wěn)定遺傳。實(shí)施例7 RRMax的PCR測(cè)定。
如實(shí)施例2中所述制備RRMax株系的基因組DNA。在PCR反應(yīng)中，約0.5μg DNA用作模板DNA，且使用以表6中給出的序列為特征的特定引物組合，所述的特定組合和擴(kuò)增片段的大小在表7中給出。在每個(gè)30-35擴(kuò)增循環(huán)中，根據(jù)引物對(duì)組合，使用55℃和65℃之間的退火溫度。
表6引物序列
序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人NOVARTIS AG(A)街道Schwarzwaldallee 215(B)城市Basel(C)國(guó)家瑞士(D)郵政編號(hào)4058(E)電話+41 61 324 11 11(F)傳真+41 61 322 75 32(ii)發(fā)明名稱(chēng)轉(zhuǎn)基因植物(iii)序列數(shù)27(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8012個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO1AACGACAATC TGATCCCCAT CAAGCTTGAG CTCAGGATTT AGCAGCATTC CAGATTGGGT 60TCAATCAACA AGGTACGAGC CATATCACTT TATTCAAATT GGTATCGCCA AAACCAAGAA 120GGAACTCCCA TCCTCAAAGG TTTGTAAGGA AGAATTCTCA GTCCAAAGCC TCAACAAGGT 180CAGGGTACAG AGTCTCCAAA CCATTAGCCA AAAGCTACAG GAGATCAATG AAGAATCTTC 240AATCAAAGTA AACTACTGTT CCAGCACATG CATCATGGTC AGTAAGTTTC AGAAAAAGAC 300ATCCACCGAA GACTTAAAGA TAGTGGGCAT CTTTGAAAGT AATCTTGTCA ACATCGAGCA 360GCTGGCTTGT GGGGACCAGA CAAAAAAGGA ATGGTGCAGA ATTGTTAGGC GCACCTACCA 420AAAGCATCTT TGCCTTTATT GCAAAGATAA AGCAGATTCC TCTAGTACAA GTGGGGAACA 480AAATAACGTG GAAAAGAGCT GTCCTGACAG CCCACTCACT AATGCGTATG ACGAACGCAG 540TGACGACCAC AAAAGAATTC CCTCTATATA AGAAGGCATT CATTCCCATT TGAAGGATCA 600TCAGATACTG AACCAATCCT TCTAGAAGAT CTAAGCTTAT CGATAAGCTT GATGTAATTG 660GAGGAAGATC AAAATTTTCA ATCCCCATTC TTCGATTGCT TCAATTGAAG TTTCTCCGAT 720GGCGCAAGTT AGCAGAATCT GCAATGGTGT GCAGAACCCA TCTCTTATCT CCAATCTCTC 780GAAATCCAGT CAACGCAAAT CTCCCTTATC GGTTTCTCTG AAGACGCAGC AGCATCCACG 840AGCTTATCCG ATTTCGTCGT CGTGGGGATT GAAGAAGAGT GGGATGACGT TAATTGGCTC 900TGAGCTTCGT CCTCTTAAGG TCATGTCTTC TGTTTCCACG GCGTGCATGC TTCACGGTGC 960AAGCAGCCGT CCAGCAACTG CTCGTAAGTC CTCTGGTCTT TCTGGAACCG TCCGTATTCC 1020AGGTGACAAG TCTATCTCCC ACAGGTCCTT CATGTTTGGA GGTCTCGCTA GCGGTGAAAC 1080TCGTATCACC GGTCTTTTGG AAGGTGAAGA TGTTATCAAC ACTGGTAAGG CTATGCAAGC 1140TATGGGTGCC AGAATCCGTA AGGAAGGTGA TACTTGGATC ATTGATGGTG TTGGTAACGG 1200TGGACTCCTT GCTCCTGAGG CTCCTCTCGA TTTCGGTAAC GCTGCAACTG GTTGCCGTTT 1260GACTATGGGT CTTGTTGGTG TTTACGATTT CGATAGCACT TTCATTGGTG ACGCTTCTCT 1320CACTAAGCGT CCAATGGGTC GTGTGTTGAA CCCACTTCGC GAAATGGGTG TGCAGGTGAA 1380GTCTGAAGAC GGTGATCGTC TTCCAGTTAC CTTGCGTGGA CCAAAGACTC CAACGCCAAT 1440CACCTACAGG GTACCTATGG CTTCCGCTCA AGTGAAGTCC GCTGTTCTGC TTGCTGGTCT 1500CAACACCCCA GGTATCACCA CTGTTATCGA GCCAATCATG ACTCGTGACC ACACTGAAAA 1560GATGCTTCAA GGTTTTGGTG CTAACCTTAC CGTTGAGACT GATGCTGACG GTGTGCGTAC 1620CATCCGTCTT GAAGGTCGTG GTAAGCTCAC CGGTCAAGTG ATTGATGTTC CAGGTGATCC 1680ATCCTCTACT GCTTTCCCAT TGGTTGCTGC CTTGCTTGTT CCAGGTTCCG ACGTCACCAT 1740CCTTAACGTT TTGATGAACC CAACCCGTAC TGGTCTCATC TTGACTCTGC AGGAAATGGG 1800TGCCGACATC GAAGTGATCA ACCCACGTCT TGCTGGTGGA GAAGACGTGG CTGACTTGCG 1860TGTTCGTTCT TCTACTTTGA AGGGTGTTAC TGTTCCAGAA GACCGTGCTC CTTCTATGAT 1920CGACGAGTAT CCAATTCTCG CTGTTGCAGC TGCATTCGCT GAAGGTGCTA CCGTTATGAA 1980CGGTTTGGAA GAACTCCGTG TTAAGGAAAG CGACCGTCTT TCTGCTGTCG CAAACGGTCT 2040CAAGCTCAAC GGTGTTGATT GCGATGAAGG TGAGACTTCT CTCGTCGTGC GTGGTCGTCC 2100TGACGGTAAG GGTCTCGGTA ACGCTTCTGG AGCAGCTGTC GCTACCCACC TCGATCACCG 2160TATCGCTATG AGCTTCCTCG TTATGGGTCT CGTTTCTGAA AACCCTGTTA CTGTTGATGA 2220TGCTACTATG ATCGCTACTA GCTTCCCAGA GTTCATGGAT TTGATGGCTG GTCTTGGAGC 2280TAAGATCGAA CTCTCCGACA CTAAGGCTGC TTGATGAGCT CAAGAATTCG AGCTCGGTAC 2340CGGATCCTCT AGCTAGAGCT TTCGTTCGTA TCATCGGTTT CGACAACGTT CGTCAAGTTC 2400AATGCATCAG TTTCATTGCG CACACACCAG AATCCTACTG AGTTCGAGTA TTATGGCATT 2460GGGAAAACTG TTTTTCTTGT ACCATTTGTT GTGCTTGTAA TTTACTGTGT TTTTTATTCG 2520GTTTTCGCTA TCGAACTGTG AAATGGAAAT GGATGGAGAA GAGTTAATGA ATGATATGGT 2580CCTTTTGTTC ATTCTCAAAT TAATATTATT TGTTTTTTCT CTTATTTGTT GTGTGTTGAA 2640TTTGAAATTA TAAGAGATAT GCAAACATTT TGTTTTGAGT AAAAATGTGT CAAATCGTGG 2700CCTCTAATGA CCGAAGTTAA TATGAGGAGT AAAACACTTG TAGTTGTACC ATTATGCTTA 2760TTCACTAGGC AACAAATATA TTTTCAGACC TAGAAAAGCT GCAAATGTTA CTGAATACAA 2820GTATGTCCTC TTGTGTTTTA GACATTTATG AACTTTCCTT TATGTAATTT TCCAGAATCC 2880TTGTCAGATT CTAATCATTG CTTTATAATT ATAGTTATAC TCATGGATTT GTAGTTGAGT 2940ATGAAAATAT TTTTTAATGC ATTTTATGAC TTGCCAATTG ATTGACAACA TGCATCAATC 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TCGCCGATGC AGATATTCGT AATTATGCGG GCAACGTCTG GTATCAGCGC 3900GAAGTCTTTA TACCGAAAGG TTGGGCAGGC CAGCGTATCG TGCTGCGTTT CGATGCGGTC 3960ACTCATTACG GCAAAGTGTG GGTCAATAAT CAGGAAGTGA TGGAGCATCA GGGCGGCTAT 4020ACGCCATTTG AAGCCGATGT CACGCCGTAT GTTATTGCCG GGAAAAGTGT ACGTATCACC 4080GTTTGTGTGA ACAACGAACT GAACTGGCAG ACTATCCCGC CGGGAATGGT GATTACCGAC 4140GAAAACGGCA AGAAAAAGCA GTCTTACTTC CATGATTTCT TTAACTATGC CGGAATCCAT 4200CGCAGCGTAA TGCTCTACAC CACGCCGAAC ACCTGGGTGG ACGATATCAC CGTGGTGACG 4260CATGTCGCGC AAGACTGTAA CCACGCGTCT GTTGACTGGC AGGTGGTGGC CAATGGTGAT 4320GTCAGCGTTG AACTGCGTGA TGCGGATCAA CAGGTGGTTG CAACTGGACA AGGCACTAGC 4380GGGACTTTGC AAGTGGTGAA TCCGCACCTC TGGCAACCGG GTGAAGGTTA TCTCTATGAA 4440CTGTGCGTCA CAGCCAAAAG CCAGACAGAG TGTGATATCT ACCCGCTTCG CGTCGGCATC 4500CGGTCAGTGG CAGTGAAGGG CGAACAGTTC CTGATTAACC ACAAACCGTT CTACTTTACT 4560GGCTTTGGTC GTCATGAAGA TGCGGACTTA CGTGGCAAAG GATTCGATAA CGTGCTGATG 4620GTGCACGACC ACGCATTAAT GGACTGGATT GGGGCCAACT CCTACCGTAC CTCGCATTAC 4680CCTTACGCTG AAGAGATGCT 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(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO6CACCGGTCTT TTGGAAGGTG AAG 23(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO7AACGAGACCC ATAACGAGGA AGC 23(2)關(guān)于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO8AAACAGTCCC GTGCATCCCC AAC 23(2)關(guān)于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO9GACGCTCTCC TTGATTCTGT CCC 23(2)關(guān)于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)
(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO10CAAGAAGGTT GGTATCGCTG 20(2)關(guān)于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO11TCTTTTGTGG TCGTCACTGC GTT 23(2)關(guān)于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO12GCGAGCTCTA ATACGACTCA CTAT 24(2)關(guān)于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO13CGCGAGCTCA ATTAACCCTC ACT 23(2)關(guān)于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO14TCTGTACCCT GACCTTGTTG 20(2)關(guān)于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO15CGTGGATACC ACATCGTGAT 20(2)關(guān)于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO16ACCTTGGCTT GAAGTACTC 19(2)關(guān)于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形
(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO17TCAACCTACA GCTGATTTGG ACC 23(2)關(guān)于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO18GGACCGGAAC GACAATCTGA TC 22(2)關(guān)于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO19CTAGGGAAGT CCAAATCAGC CG 22(2)關(guān)于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO20TTTGGACCGG AACTTTCAG AAG 23(2)關(guān)于SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO21CTAACTTGCG CCATCGGAGA AAC 23(2)關(guān)于SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO22GACTTGTCAC CTGGAATACG GAC 23(2)關(guān)于SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO23ATTCTTGAGC TCATCAAGCC 23(2)關(guān)于SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型 DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO24AAGGTTGGTA TCGCTGGAGC TG 22(2)關(guān)于SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO25TCTCCACAAT GGCTTCCTCT ATG 23(2)關(guān)于SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度671個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形
(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO26CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC 60TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG 120CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC TGAATGAACT CCAGGACGAG 180GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT 240GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG 300TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG 360CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA 420GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG 480GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC GCATGCCCGA CGGCGAGGAT 540CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT 600TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG 660GCTACCCGTG A 671(2)關(guān)于SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度739個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類(lèi)型 DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iii)反義無(wú)(xi)序列描述 SEQ ID NO27GGACCGGAAC GACAATCTGA TCCCCATCAA GCTTGAGCTC AGGATTTAGC AGCATTCCAG 60ATTGGGTTCA ATCAACAAGG TACGAGCCAT ATCACTTTAT TCAAATTGGT ATCGCCAAAA 120CCAAGAAGGA ACTCCCATCC TCAAAGGTTT GTAAGGAAGA ATTCTCAGTC CAAAGCCTCA 180ACAAGGTCAG GGTACAGAGT CTCCAAACCA TTAGCCAAAA GCTACAGGAG ATCAATGAAG 240AATCTTCAAT CAAAGTAAAC TACTGTTCCA GCACATGCAT CATGGTCAGT AAGTTTCAGA 300AAAAGACATC CACCGAAGAC TTAAAGTTAG TGGGCATCTT TGAAAGTAAT CTTGTCAACA 360TCGAGCAGCT GGCTTGTGGG GACCAGACAA AAAAGGAATG GTGCAGAATT GTTAGGCGCA 420CCTACCAAAA GCATCTTTGC CTTTATTGCA AAGATAAAGC AGATTCCTCT AGTACAAGTG 480GGGAACAAAA TAACGTGGAA AAGAGCTGTC CTGACAGCCC ACTCACTAAT GCGTATGACG 540AACGCAGTGA CGACCACAAA AGAATTCCCT CTATATAAGA AGGCATTCAT TCCCATTTGA 600AGGATCATCA GATACTGAAC CAATCCTTCT AGAAGATCTA AGCTTATCGA TAAGCTTGAT 660GTAATTGGAG GAAGATCAAA ATTTTCAATC CCCATTCTTC GATTGCTTCA ATTGAAGTTT 720CTCCGATGGC GCAAGTTAG 739
權(quán)利要求
1.表達(dá)cp4/epsps酶活性的甜菜植株及其后代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植株，對(duì)每公頃約4升至約18升Roundup的處理有耐受性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植株，其特征在于當(dāng)使用以SEQ IDNo18和SEQ ID No2的序列為特征的寡核苷酸引物對(duì)時(shí)，以其基因組DNA為模板的PGR擴(kuò)增產(chǎn)生739bp的DNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植株，其中以SEQ ID No27的核苷酸序列為特征的DNA形成植物基因組的部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植株，其特征在于當(dāng)使用以SEQ IDNo20和SEQ ID No24的序列為特征的寡核苷酸引物對(duì)時(shí)，以其基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生834bp的DNA片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植株，其特征在于當(dāng)使用以SEQ IDNo17和SEQ ID No22的序列為特征的寡核苷酸引物對(duì)時(shí)，以其基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生1057bp的DNA片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植株，其特征在于當(dāng)使用以SEQ IDNo19和SEQ ID No25的序列為特征的寡核苷酸引物對(duì)時(shí)，以其基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生1224bp的DNA片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植株，其中以SEQ ID No1的核苷酸序列為特征的DNA形成植物基因組的部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植株，其中所述的核苷酸序列取代了高度重復(fù)的DNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植株，其中基因組的部分與以SEQ IDNo2和SEQ ID No3的核苷酸序列為特征的所述的核苷酸序列直接相連。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植株，其中DNA的特征在于SEQ IDNo4的核苷酸序列形成植物基因組的部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中的任意一項(xiàng)所述的植株的種子。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植株的種子，以登記號(hào)NCIMB97087006/2保藏。
14.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜菜植株的方法，包括(a)用攜帶含有編碼cp4/epsps的DNA片段的載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的甜菜子葉；(b)在草甘膦存在時(shí)再生芽；(c)將芽轉(zhuǎn)移到溫室的土壤中；(d)用草甘膦處理苗；(e)以0-9的等級(jí)對(duì)植株活力和葉褪綠進(jìn)行目測(cè)評(píng)級(jí)；(g)選擇植株活力和葉褪綠評(píng)級(jí)為9的植株；并且(h)通過(guò)傳統(tǒng)育種技術(shù)繁殖所選植株。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中編碼cp4/epsps蛋白的載體是含有具有SEQ ID No5中給出的核苷酸序列的DNA片段的載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中通過(guò)PCR分析再生芽中編碼cp4/epsps的DNA的存在。
17.草甘膦耐受性甜菜植株及其后代，可通過(guò)用使cp4/epsps在植物中表達(dá)的基因進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化得到，其中所述的植株缺失左和右T-DNA邊界序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因甜菜植株,該植株由于cp4/epsps酶活性的表達(dá)而對(duì)每公頃約4至約18升Roundup的處理有耐受性。植物可以其特異整合位點(diǎn)為特征。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可從所述植株得到的種子和產(chǎn)生所述植株的方法。
文檔編號(hào)A01H1/04GK1242803SQ98801636
公開(kāi)日2000年1月26日 申請(qǐng)日期1998年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月31日
發(fā)明者M·曼納洛弗, P·P·坦寧, P·斯狄恩 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司