專利名稱：通過種子處理由過敏反應(yīng)在植物中誘導(dǎo)的抗性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過處理種子賦予植物由過敏反應(yīng)誘導(dǎo)的抗性。
背景技術(shù)：
活的有機(jī)體已演化出一系列復(fù)雜的生物化學(xué)途徑，這些途徑使其能識別來自環(huán)境的信號并作出反應(yīng)。這些途徑包括受體器官、激素、第二信使、和酶促修飾。目前，對于信號傳導(dǎo)途徑知之甚少，這些信號傳導(dǎo)途徑是在植物對病原體的入侵作出反應(yīng)時激活的，而且這方面的知識集中在對感病性和抗病性的了解上。常見形式的植物抗性是將病原體的增殖限制在感染部位周圍的小范圍內(nèi)。在很多場合下，這種限制是通過宿主組織的局部死亡(即壞死)而實現(xiàn)的。病原體的限制和局部組織壞死共同構(gòu)成了所述過敏反應(yīng)的特征。除了局部防御反應(yīng)外，很多植物對感染的反應(yīng)是通過激活植物的未受感染部分的防御。其結(jié)果是，整個植株對于二次感染有更高的抗性。這種系統(tǒng)獲得性抗性可持續(xù)幾周或更長時間(R.E.F.Matthews，植物病毒學(xué)(學(xué)術(shù)出版社，紐約，第二版，1981))并通常會對無關(guān)的病原體產(chǎn)生交叉抗性(J.Kuc，見植物病害控制的革新方法，I.Chet著(Wiley，紐約，1987)，pp.255-274，該文獻(xiàn)被收作本發(fā)明的參考文獻(xiàn))。還可以參見以下文獻(xiàn)Kessman等，“通過化合物在植物中誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗病性”，植物病理學(xué)年度綜述32439-59(1994)，Ryals等，“系統(tǒng)獲得性抗性”，植物細(xì)胞81809-19(1996年10月)，和Neuenschwander等，“系統(tǒng)獲得性抗性”，植物細(xì)菌相互作用1卷，J.stacey等著，pp.81-106(1996)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。
與系統(tǒng)獲得性抗性的表現(xiàn)相關(guān)的是正常情況下的烈性病原體不能入侵免疫過的組織(Kuc，J.，“對植物病害的誘導(dǎo)免疫性”，生物科學(xué)，32854-856(1982)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考資料)。系統(tǒng)獲得性抗性的形成是與細(xì)胞壁中羥脯氨酸含量和過氧化物酶活性的系統(tǒng)性增加相關(guān)(Smith，J.A.等，“對在黃瓜、香瓜和西瓜中誘導(dǎo)的抗性相關(guān)的酸性過氧化物酶的對比研究”，生理分子植物病理學(xué)14329-338(1988)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，并與一組由9個家族的所謂系統(tǒng)獲得性抗性基因組成的基因的表達(dá)相關(guān)(Ward，E.R.等，“對誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性的試劑的協(xié)調(diào)基因活性”，植物細(xì)胞349-59(1991)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。所述基因家族的5個編碼致病相關(guān)性蛋白，這些蛋白的生理學(xué)功能尚未確定。不過，這些蛋白中的某一些在體外具有抗真菌活性(Bol，J.F.等“由病毒感染誘導(dǎo)的植物致病相關(guān)性蛋白”，植物病理學(xué)年度綜述28113-38(1990)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，而且，豆殼多糖酶基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的組成型表達(dá)可預(yù)防真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)的感染(Droglie K.等“對真菌病原體立枯絲核菌具有增強(qiáng)的抗性的轉(zhuǎn)基因植物”，科學(xué)2541194-1197(1991)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，以上現(xiàn)象表明，所述系統(tǒng)獲得性抗性蛋白可產(chǎn)生免疫狀態(tài)(Uknes，F(xiàn).等，“擬南芥屬的獲得性抗性”，植物細(xì)胞4645-656(1992)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。
水楊酸似乎在系統(tǒng)獲得性抗性的誘導(dǎo)方面起著信號作用，因為在免疫之后其內(nèi)源含量提高(Malamy，J.等，“水楊酸煙草對病毒感染的抗性反應(yīng)的一種可能的內(nèi)源信號”，科學(xué)2501002-1004(1990)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，而且外源水楊酸能誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性基因(Yalpani，N.等，“水楊酸是病毒感染的煙草中致病相關(guān)性蛋白的系統(tǒng)信號和誘導(dǎo)劑”，植物細(xì)胞3809-818(1991)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，以及獲得性抗性(Uknes，S.等“擬南芥屬的獲得性抗性”，植物細(xì)胞4645-656(1992)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。而且，在其中的水楊酸被細(xì)菌轉(zhuǎn)基因編碼的水楊酸羥化酶作用而受到破壞的轉(zhuǎn)基因煙草植株中，不具備系統(tǒng)獲得性抗性(Gaffney，T.等，“誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性對水楊酸的需要”，科學(xué)261754-56(1993)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。不過，這種現(xiàn)象反應(yīng)的是局部抑制，而不是系統(tǒng)信號功能，對黃瓜中信號傳導(dǎo)的詳細(xì)動態(tài)分析表明，水楊酸可能不是長距離信號傳導(dǎo)所必需的(Rasmussen，J.B.等，“在用丁香假單胞菌丁香致病變種接種之后水楊酸在黃瓜中積累的系統(tǒng)誘導(dǎo)”，植物生理學(xué)971342-1347(1991)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。
業(yè)已對用生物環(huán)境因子進(jìn)行的免疫做過深入的研究，對綠色豆類進(jìn)行系統(tǒng)免疫，使其抗由豆刺盤胞(Colletotrichum lindemuthianum)的栽培種致病小種引起的疾病，其做法是預(yù)先用栽培種非致病小種進(jìn)行感染(Rahe，J.E.“在菜豆中誘導(dǎo)對豆炭疽病的抗性”，植物生理學(xué)591641-5(1969)；Elliston，J.等，“在距離誘導(dǎo)相互作用位點(diǎn)一定距離處誘導(dǎo)對炭疽病的抗性”，植物病理學(xué)611110-12(1971)；Skitt，R.等，“豆類炭疽病交叉保護(hù)的研究”，植物生理病理學(xué)3299-313(1973)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，在出現(xiàn)癥狀之前通過在宿主組織中加熱對栽培種致病小種減毒(Rahe，J.等，“加熱對豆炭疽病感染限制作用的代謝性質(zhì)”，植物病理學(xué)601005-9(1970)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))或通過豆的非病原體感染進(jìn)行。黃瓜的炭疽病病原體葫蘆科刺盤胞(Colletotrichum lagenarium)同樣是非病原體小種(它可以作為系統(tǒng)預(yù)防一切豆炭疽病小種的誘導(dǎo)物)。保護(hù)作用是由葫蘆科刺盤胞在抗豆刺盤胞的一個或幾個小種的栽培種中誘導(dǎo)的，并可以在易感所有報導(dǎo)過的真菌小種的栽培種中誘導(dǎo)，后者因此被稱為‘缺乏對所述病原體的遺傳學(xué)抗性’(Elliston，J.等，“用豆類的非病原體刺盤胞菌預(yù)防豆炭疽病”，植物病理學(xué)雜志86117-26(1976)；Elliston，J.等，“刺盤胞菌和菜豆間相容的、不相容的和誘導(dǎo)的不相容的相互作用發(fā)生的比較研究”，植物病理學(xué)雜志87289-303(1976)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。以上結(jié)果表明，在被報導(dǎo)為‘具有’或‘缺乏’抗性基因的栽培種中可以誘導(dǎo)相同的機(jī)制(Elliston，J.等，“植物抗毒素積累與豆類局部和系統(tǒng)抗炭疽病的關(guān)系”，植物病理學(xué)雜志88114-30(1977)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。同樣很明顯的是，易感豆刺盤胞所有小種的栽培種并不缺少誘導(dǎo)抗所述病原體的抗性機(jī)制的基因。
Kuc，J.等，“通過葫蘆科刺盤胞防止葫蘆科植物受葫蘆科刺盤胞的致病性”，植物生理病理學(xué)7195-9(1975)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，結(jié)果表明，通過事先用相同的真菌接種其子葉或第一真葉可以系統(tǒng)防治由葫蘆科刺盤胞引起的葫蘆科植物的發(fā)病。接著，通過預(yù)先局部感染真菌、細(xì)菌、或病毒的方法系統(tǒng)地預(yù)防黃瓜免受真菌、細(xì)菌、和病毒病害(Hammerschmidt，R.等，“預(yù)防黃瓜免受葫蘆科刺盤胞和瓜枝胞的侵害”，植物病理學(xué)66790-3(1976)；Genns，A.E.等，“通過局部感染煙草壞死病毒預(yù)防黃瓜受到葫蘆科刺盤胞的侵害”，植物生理病理學(xué)11207-12(1977)；Caruso，F(xiàn).L.等，“通過流淚假單胞菌和葫蘆科刺盤胞誘導(dǎo)黃瓜對炭疽病和葉角斑病的抗性”，植物生理病理學(xué)14191-201(1979)；Staub，T.等“預(yù)先局部感染任一種真菌系統(tǒng)地預(yù)防黃瓜植株出現(xiàn)由瓜枝胞和葫蘆科刺盤胞引起的疾病”，植物生理病理學(xué)17389-93(1980)；Bergstrom，G.C.等，“通過葫蘆科刺盤胞、流淚假單胞菌或煙草壞死病毒局部感染黃瓜對系統(tǒng)性抗黃瓜花葉病毒的影響”，植物病理學(xué)72922-6(1982)；Geffler，C.等，“通過根和葉病原體誘導(dǎo)對鐮孢菌萎蔫病的抗性”，植物病理學(xué)721439-41(1982)；Bashm，B.等，“由煙草壞死病毒在黃瓜中誘導(dǎo)的對單絲殼的系統(tǒng)性抗性”，植物生理病理學(xué)23137-44(1983)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。通過感染葫蘆科刺盤胞或煙草壞死病毒所誘導(dǎo)的非專一性預(yù)防作用能有效預(yù)防至少13種病原體，包括專性和兼性寄生真菌、局部損毀和系統(tǒng)性病毒，萎蔫真菌，和細(xì)菌。類似地，通過根部病原體誘導(dǎo)預(yù)防作用，并能有效預(yù)防根部病原體。包括西瓜和香瓜在內(nèi)的其它葫蘆科植物也能系統(tǒng)地抗葫蘆科刺盤胞(Caruso，F(xiàn).L.等，“通過葫蘆科刺盤胞保護(hù)西瓜和香瓜免受葫蘆科刺盤胞的侵害”，植物病理學(xué)671285-9(1977)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。
還在煙草中誘導(dǎo)了針對多種疾病的系統(tǒng)性防病作用(Kuc，J.等，“在煙草中進(jìn)行抗病免疫”，煙草科學(xué)的最新進(jìn)展9179-213(1983)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。由煙草花葉病毒引起的壞死斑可增強(qiáng)其上部葉片對由這種病毒引起的病害的抗性(Ross，A.F.等，“通過局部病毒感染在植物中誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性”，病毒學(xué)14340-58(1961)；Ross，A.F.等“局部損傷形成的系統(tǒng)作用”，見植物病毒pp.127-50(1966)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。寄生疫霉煙草變種(Phytophora parasitica var.nicotianae)、煙草疫霉(P.tabacina)和煙草假單胞菌(Pseudomonas tabaci)以及減弱的桃蚜(Myzuspersicae)的繁殖作用(McIntyre，J.L.等，“通過用煙草花葉病毒感染對該病毒過敏的煙草誘導(dǎo)對疫霉的煙草變種的局部和系統(tǒng)性抗性”，植物生理病理學(xué)15321-30(1979)；McIntyre，J.L.等，“通過使煙草局部感染煙草花葉病毒對系統(tǒng)性抗異化病原體和昆蟲的影響”，植物病理學(xué)71297-301(1981)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。將熱致死的煙草假單胞菌(Lovrekovich，L.等，“用熱致死細(xì)菌處理在煙草葉片中誘導(dǎo)對野火病的抗性”，自然205823-4(1965)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，和青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)(Sequeira，L.等，“細(xì)菌和宿主細(xì)胞壁的相互作用它與誘導(dǎo)抗性的機(jī)制的關(guān)系”，植物生理病理學(xué)1043-50(1997)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))侵入煙草葉片中，可以誘導(dǎo)對用于侵入的同一種細(xì)菌的抗性。通過穿透線蟲(pratylenchus penetrans)可誘導(dǎo)煙草植株對寄生疫霉煙草變種的抗性(McIntyre，J.L.等，“通過栽培種非病原體小種、無細(xì)胞超聲處理和穿透線蟲預(yù)防煙草的寄生疫霉煙草變種的病害“，植物病理學(xué)68235-9(1978)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。
Cruikshank，I.A.M.等首次報導(dǎo)了通過莖部注射真菌使煙草葉片產(chǎn)生對青霉(即，煙草霜霉)的抗性，這樣做還會導(dǎo)致矮化和早熟性衰老(煙草莖部感染霜霉Adam對葉片抗青霉作用的影響”，澳大利亞農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜志26369-72(1960)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。最近發(fā)現(xiàn)對木質(zhì)部進(jìn)行的外部注射不僅能減輕矮化，而且還能促進(jìn)生長和發(fā)育。不論是在溫室還是在大田試驗中，與對照植物相比，免疫過的煙草植株要增高大約40％，在干重方面增加40％，在鮮重方面增加30％，而且要多出4-6個葉片(Tuzun，S.等，“莖部注射煙草霜霉和Metalaxyl處理對大田中煙草生長和預(yù)防青霉作用的影響”，植物病理學(xué)74804(1984)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。所述植物大約比對照植物提早2-3周開花(Tuzun，S.等，“在被煙草霜霉Adam感染過的煙草中一種因子的運(yùn)動可系統(tǒng)地預(yù)防青霉”，植物生理病理學(xué)26321-30(1985)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。
系統(tǒng)性抗性不僅產(chǎn)生對感染的絕對免疫性，而且能減輕病害程度，并延緩癥狀的出現(xiàn)。病斑的數(shù)量、大小、和真菌病原體孢子形成的程度都得到下降。發(fā)病面積可以降低90％以上。
如果在首次接種后3-6周對所述瓜類進(jìn)行一次‘加強(qiáng)’接種，由葫蘆科刺盤胞所誘導(dǎo)的免疫作用可以持續(xù)到開花和結(jié)果期(Kuc，J.等，“通過葫蘆科刺盤胞預(yù)防黃瓜的葫蘆科刺盤胞病害的應(yīng)用”植物病理學(xué)67533-6(1977)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。一旦植物結(jié)實，就不再能誘導(dǎo)預(yù)防作用。通過莖部注射煙草霜霉孢子囊的方法可以使煙草植株在其生長期期間得到免疫。不過，為了防止青霉的系統(tǒng)性發(fā)生，該技術(shù)只能在植株高于20cm的高度時實施。
將誘導(dǎo)葉片從免疫過的黃瓜植株上除去，不會降低現(xiàn)存的、已展開的葉片的免疫水平。不過隨后從頂芽上長出的葉片與其前輩葉片相比免疫水平逐漸降低(Dean，R.A.等“在黃瓜中誘導(dǎo)的系統(tǒng)性保護(hù)作用‘信號’的產(chǎn)生時間和運(yùn)動”，’76966-70(1986)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。Ross，A.F.報導(dǎo)了類似的結(jié)果(“局部損傷形成的系統(tǒng)作用”，見植物病毒pp.127-50(1966)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，其做法是通過預(yù)先感染煙草花葉病毒使煙草(局部損傷宿主)對煙草花葉病毒免疫。相反，由從通過莖部注射煙草霜霉免疫的煙草植株上切除的接穗上長出的新葉片是高度免疫的(Tuzun，S.等，“通過愈傷組織轉(zhuǎn)移煙草中誘導(dǎo)的對青霉(煙草霜霉Adam)的抗性”，植物病理學(xué)751304(1985)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。與由未免疫的親本的葉片再生的植株相比，通過組織培養(yǎng)從免疫過的植株的葉片再生的植株表現(xiàn)出在青霉方面明顯降低，新生的再生體僅表現(xiàn)出降低了的孢子形成。隨著植株的老化，損傷的形成和孢子形成均得到降低。不過，其它研究者未得出相同的結(jié)論，盡管在一個實驗中報導(dǎo)了孢子形成方面的顯著降低(Lucas，J.A.等“誘導(dǎo)的對PeronosporaHyoscyami的抗性不能從免疫的煙草外植體傳遞到再生植株”植物病理學(xué)751222-5(1985)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。
對黃瓜和西瓜的保護(hù)作用是在溫室和大田中進(jìn)行的(Caruso，F(xiàn).L.等，“通過葫蘆科刺盤胞大田防治黃瓜的葫蘆科刺盤胞病”植物病理學(xué)671290-2(1977)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。在一個實驗中，免疫過的黃瓜的總的損傷面積比未免疫過的對照植株的損傷面積少2％。類似地，在66株免疫過，受到侵害的西瓜植株中僅有一株死亡，而在未免疫過的，受到侵害的西瓜植株中有47株死亡。在肯塔基和波多黎各的大量田間試驗中，對煙草莖部進(jìn)一步注射煙草霜霉的孢子囊，在控制青霉方面的作用至少與最好的殺真菌劑metalaxyl一樣有效。以上述方式對植株進(jìn)行免疫，可以使烤煙的產(chǎn)量提高10-25％。
誘導(dǎo)的對細(xì)菌和病毒的抗性似乎是以抑制病害癥狀或病原體繁殖或同時出現(xiàn)這兩種現(xiàn)象的形式表現(xiàn)(Caruso F.L.等，“通過流淚假單胞菌和葫蘆科刺盤胞誘導(dǎo)黃瓜對炭疽病和葉角斑病的抗性”，植物生理病理學(xué)54191-201(1979)；Doss，M.等，“黃瓜對流淚假單胞菌的系統(tǒng)獲得性抗性，表現(xiàn)為癥狀的抑制，而不是細(xì)菌的增殖”，ActaThytogathologia Academiae Scientiarum Hungariaael 6(3-4)，269-72(1981)；Jenns A.E.，“通過用煙草壞死病毒、葫蘆科刺盤胞或流淚假單胞菌局部感染黃瓜而系統(tǒng)誘導(dǎo)的對病原體的非專一性抗性”，地中海植物病理學(xué)18129-34(1979)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。
如上文所述，有關(guān)系統(tǒng)獲得性抗性的研究涉及用感染性病原體感染植物。盡管在這方面的研究有利于理解系統(tǒng)獲得性抗性是如何工作的，但是由感染劑引起的上述抗性不具有商業(yè)價值，因為接觸這種植物病原體可以弱化或致死植物。本發(fā)明的目的在于克服這一缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)植物種子的方法，該方法能賦予由所述種子生長出的植株對病原體的抗性。該方法包括將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以非感染形式施加于植物種子，處理條件為讓所述多肽或蛋白接觸所述植物種子的細(xì)胞。
為了賦予由所述種子生長出的植株對病原體的抗性，可以使用轉(zhuǎn)基因種子，以代替將一種過敏性反應(yīng)多肽或蛋白用于植物種子的做法，該方法包括提供一種將含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物種子播種到土壤中，并由所播種的種子繁殖植株，植株的繁殖是在能有效賦予該植株病原體抗性的條件下進(jìn)行的。
本發(fā)明的另一方面涉及了賦予病原體抗性的植物種子，對該種子施加了一種非感染性過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。
本發(fā)明具有以下潛力治療以前無法治療的植物病害；系統(tǒng)地治療病害，由于成本原因人們不愿意單獨(dú)地治療這種病害；避免使用對環(huán)境甚至是植株有不可預(yù)測的影響的制劑。本發(fā)明可以賦予抗性，而又不使用對環(huán)境有害或使被處理的植物種子致病或使位于種植被處理種子地區(qū)附近的植物致病的制劑。由于本發(fā)明涉及的是使用能完全和迅速被生物降解的天然制品，因此不會污染環(huán)境。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)植物種子的方法，該方法能賦予由所述種子生長出的植株對病原體的抗性。該方法包括將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以非感染形式施加于植物種子，處理條件為讓所述多肽或蛋白接觸所述植物種子的細(xì)胞。
為了賦予由所述種子生長出的植株對病原體的抗性，可以使用轉(zhuǎn)基因種子，以代替將一種過敏性反應(yīng)多肽或蛋白用于植物種子的做法，該方法包括提供一種將含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物種子播種到土壤中，并由所播種的種子繁殖植株，植株的繁殖是在能有效賦予該植株病原體抗性的條件下進(jìn)行的。
本發(fā)明的另一方面涉及賦予病原體抗性的植物種子，對該種子施加了一非感染性過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。
用于本發(fā)明的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白可相當(dāng)于源于多種真菌或細(xì)菌病原體的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。這種多肽或蛋白能夠在接觸到所述誘導(dǎo)物的植物組織中誘導(dǎo)局部壞死。
多肽或蛋白誘導(dǎo)物的合適的細(xì)菌來源的例子包括歐文氏菌、假單胞菌、和黃單胞菌(例如，下列細(xì)菌解淀粉歐文氏菌(Erwinia amyloaora)、菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、斯氏歐文氏菌(Erwiniastewartii)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、青枯假單胞菌(Pseudomonassolancearum)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)，或其混合物)。
過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的真菌來源的例子是疫霉。這種真菌病原體的合適的種包括寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)、樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、大雄疫霉(Phytophthoramegasperma)、和柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrothora)。
本發(fā)明的將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加于植物種子上的實施方案可以多種方式實現(xiàn)，包括1)施加一種分離的誘導(dǎo)多肽或蛋白；2)施加不會導(dǎo)致發(fā)病的細(xì)菌，該細(xì)菌用編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化過；和3)施加能導(dǎo)致某些植物種發(fā)病(但不會使施加這種細(xì)菌的植物發(fā)病)的細(xì)菌，該細(xì)菌天然含有編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因。另外，可以從用本發(fā)明的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白處理過的植物上收獲本發(fā)明的種子。
在本發(fā)明的一種實施方案中，待使用的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白可以從其相關(guān)的生物中提取，并施加到植物上。這種提取方法是眾所周知的，可以參見以下文獻(xiàn)Arlat，M.F.Van Gizsegem J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“通過青枯假單胞菌的Hrp途徑分泌的PopAl，一種能在特定的矮牽牛基因型中誘導(dǎo)過敏-樣反應(yīng)的蛋白”，EMB0雜志13543-53(1994)；He，S.Y.，H.C.Huang和A.Collmer，丁香假單胞菌丁香致病變種Harpinpss“一種通過Hrp途徑分泌的蛋白，它能誘導(dǎo)植物的過敏反應(yīng)”，細(xì)胞731255-1266(1993)和Wei，J.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“由植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過敏反應(yīng)Harpin誘導(dǎo)物”，科學(xué)25785-88(1992)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))。另外，參見待批美國專利申請流水號08/200,024和08/062,024，以上專利被收作本文的參考文獻(xiàn)。不過，優(yōu)選地本發(fā)明分離的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是通過重組方法生產(chǎn)的，并通過以下方法純化。
在本發(fā)明的其它實施方案中，可以通過施加含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因的細(xì)菌的方法將本發(fā)明的所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到植物種子上。所述細(xì)菌必須能夠分泌或輸出所述多肽或蛋白，以使所述誘導(dǎo)物能夠接觸植物種子細(xì)胞。在所述實施方案中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是在將所述細(xì)菌施加到所述種子上之后或在將所述細(xì)菌導(dǎo)入所述種子之前由所述細(xì)菌產(chǎn)生的。
在本發(fā)明施加細(xì)菌方法的一種實施方案中，待施加的細(xì)菌不會導(dǎo)致發(fā)病，而且用編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化過(例如，通過重組方法轉(zhuǎn)化)。例如，可以用編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽和其它相關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)化不會在植物中引起過敏反應(yīng)的大腸桿菌(E.coli)，所述相關(guān)蛋白是生產(chǎn)和分泌所述誘導(dǎo)物所必需的，然后將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌施加到植物種子上。然后可以引起該多肽或蛋白的表達(dá)。還可將細(xì)菌種(除大腸桿菌以外)用于本發(fā)明的該實施方案中。
在本發(fā)明細(xì)菌施加方法的另一種實施方案中，所述細(xì)菌不會導(dǎo)致發(fā)病，并且天然含有一個編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因。這些細(xì)菌的例子在上文已經(jīng)給出。不過，在該實施方案中，這些細(xì)菌被施加到這樣的植物種子上，這種植物不會感染由該細(xì)菌所攜帶的病害。例如，解淀粉歐文氏菌可導(dǎo)致蘋果或梨發(fā)病，但不會導(dǎo)致番茄發(fā)病。不過，這種細(xì)菌可在番茄中引起過敏反應(yīng)。因此，按照本發(fā)明的該實施方案，可將解淀粉歐文氏菌施加到番茄種子上，以賦予其病原體抗性，而又不會導(dǎo)致該種植物發(fā)病。
源于菊歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列1的氨基酸序列，其序列如下Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala這種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的分子量為34kDa，它是熱穩(wěn)定性的，其甘氨酸含量大于16％，而且基本上不含半胱氨酸。所述菊歐文氏菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是由具有相當(dāng)于序列2的核苷酸序列的DNA分子編碼的，該核苷酸序列如下CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列3的氨基酸序列，該序列如下Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala這種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的分子量為大約39kDa，其pI大約為4.3，而且在100℃下的熱穩(wěn)定性可維持至少10分鐘。這種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白基本上沒有半胱氨酸。源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白在以下文獻(xiàn)中有更全面的描述Wei，J.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“Harpin，由植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物”科學(xué)25783-88(1992)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。編碼該多肽或蛋白的DNA分子具有相當(dāng)于序列4的核苷酸序列，該核苷酸序列如下AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT120ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG180GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG240GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG300GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA360GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA420GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC480TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC540CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG600CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC660GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG720CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC780GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG840TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT900ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG960GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC1020CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC1080AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC1140ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC1200GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA1260CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288源于丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列5的氨基酸序列，該序列如下Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340這種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的分子量為大約34-35kDa。它富含甘氨酸(大約13.5％)并缺少半胱氨酸和酪氨酸。有關(guān)源于丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的更多的信息可參見以下文獻(xiàn)He，S.Y.，H.C.Huang和A.Collmer，丁香假單胞菌丁香致病變種Harpinpss“一種通過Hrp途徑分泌的蛋白，它能誘導(dǎo)植物的過敏反應(yīng)”，細(xì)胞731255-1266(1993)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。編碼源于丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的DNA分子具有相當(dāng)于序列6的核苷酸序列，該核苷酸序列如下ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA1020GCCTGA1026源于青枯假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列7的氨基酸序列，該序列如下Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340它是由具有相當(dāng)于序列8的核苷酸序列的DNA分子編碼，該序列如下ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC 300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT 600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC 960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA 1035有關(guān)源于青枯假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的其它信息記載在以下文獻(xiàn)中Arlat，M.F.Van Gizsegem J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“通過青枯假單胞菌的Hrp途徑分泌的PopAl，一種能在特定的矮牽?；蛐椭姓T導(dǎo)過敏-樣反應(yīng)的蛋白”，EMBO雜志13543-553(1994)；該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。
源于野油菜黃單胞菌大豆致病變種的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列9的氨基酸序列，該序列如下Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25該序列是僅有26個殘基的源于野油菜黃單胞菌大豆致病變種的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的氨基末端序列。該序列與在其它野油菜黃單胞菌致病變種中所確定的菌毛亞基蛋白吻合。
源于野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是熱穩(wěn)定性的，對蛋白酶敏感，而且其分子量為20kDa。它包括一個具有相當(dāng)于序列10的氨基酸序列，該序列如下Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln1 5 10 15Leu Leu Ala Met20提取胡蘿卜軟腐歐文氏菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的方法披露于以下文獻(xiàn)中Cai等“胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種菌株Ecc71的RsmA-變體，能過量表達(dá)hrpNECC并能在煙草葉片中誘發(fā)過敏反應(yīng)樣反應(yīng)”，MPMI，9(7)65-73(1996)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。源于斯氏歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白披露于以下文獻(xiàn)中Ahmad等，“斯氏歐文氏菌對玉米的致病性不需要Harpin”，第8屆國際分子植物微生物交流大會，1996年7月14-19日，和Ahmad等“斯氏歐文氏菌對玉米的致病性不需要Harpin”，美國植物病理學(xué)協(xié)會年會，1996年7月27-31日，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。
源于寄生疫霉、隱地疫霉、樟疫霉、辣椒疫霉、大雄疫霉、和柑橘褐腐疫霉的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的方法披露于以下文獻(xiàn)中Kamoun等，“源于疫霉的細(xì)胞外蛋白誘導(dǎo)物宿主專一性和對細(xì)菌和真菌植物病原體抗性的誘導(dǎo)”，分子植物-微生物交流6(1)15-25(1993)，Ricci等，“源于病原體真菌疫霉的蛋白的結(jié)構(gòu)和活性，在煙草中引起壞死和獲得性抗性”，歐洲生物化學(xué)雜志，183555-63(1989)，Ricci等，“一種壞死誘導(dǎo)物Parasiticein的示差生產(chǎn)，和通過分離寄生疫霉在煙草中產(chǎn)生的抗性”，植物病理學(xué)，41298-307(1992)，Baillieul等，“煙草中的一種新的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物一種能引起細(xì)胞死亡、防衛(wèi)基因表達(dá)、水楊酸產(chǎn)生的真菌糖蛋白，以及系統(tǒng)獲得性抗性的導(dǎo)入”，植物雜志8(4)551-60(1995)和Bonnet等，“由誘導(dǎo)蛋白(Elicitins)在煙草和其它植物中引起的獲得性抗性”，歐洲植物病理學(xué)雜志，102181-92(1996)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。
上述誘導(dǎo)物是示例性的。通過在能表達(dá)編碼一種誘導(dǎo)物的基因的條件下生長能引起過敏反應(yīng)的真菌或細(xì)菌可以鑒定其它誘導(dǎo)物。可以檢測由培養(yǎng)上清液制成的無細(xì)胞制劑的誘導(dǎo)活性(即局部壞死)，其做法是，將所述制劑用于侵入合適的植物組織。
在本發(fā)明的方法中還可以使用上述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的片段，以及源于其它病原體的全長誘導(dǎo)物。
合適的片段可以通過幾種方法產(chǎn)生。第一種方法是通過常規(guī)分子遺傳學(xué)操作，以亞克隆基因片段的方式產(chǎn)生編碼一種已知誘導(dǎo)蛋白的基因的亞克隆。然后讓所述亞克隆以體外或體內(nèi)方式在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，以產(chǎn)生較小的蛋白或肽，可以按下文所述的方法檢測所述蛋白或肽的誘導(dǎo)活性。
另一種方法是通過用諸如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌蛋白酶A或胰蛋白酶的蛋白酶消化全長誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生該誘導(dǎo)蛋白的片段。不同的蛋白酶可能裂解誘導(dǎo)蛋白的不同位點(diǎn)，這些位點(diǎn)是基于該誘導(dǎo)蛋白的氨基酸序列。由蛋白酶解所產(chǎn)生的某些片段可能是抗性的活性誘導(dǎo)物。
在另一種方法中，根據(jù)對所述蛋白的一級結(jié)構(gòu)的了解，可以使用PCR技術(shù)合成該誘導(dǎo)蛋白基因的片段，同時使用選擇的特殊引物組，以體現(xiàn)該蛋白的特定部分。然后將這些合成的基因克隆到合適的載體中，以便增量表達(dá)一種截短的肽或蛋白。
一種合適片段的例子是源于青枯假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的PopAl片段。參見Arlat，M.F.Van Gizsegem J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“通過青枯假單胞菌的Hrp途徑分泌的PopAl，一種能在特定的矮牽?；蛐椭姓T導(dǎo)過敏-樣反應(yīng)的蛋白”，EMBO雜志13543-53(1994)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。就解淀粉歐文氏菌而言，舉例來說，合適的片段可以是介于序列3的1號氨基酸和98號氨基酸之間的多肽(包括1號和98號氨基酸)和介于序列3的137號氨基酸和204號氨基酸之間的多肽(包括137號和204號氨基酸)的多肽中的任一個或兩個。
例如，可以通過缺失或增加對該多肽的性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和親水性有較小影響的氨基酸制備變體。例如，可以在一種多肽的N-末端綴合一個信號(或前導(dǎo))序列，該信號序列可以在翻譯的同時或在翻譯之后指導(dǎo)該蛋白的轉(zhuǎn)移。還可以將該多肽與一個連接序列或其它序列綴合，以方便該多肽的合成、純化或鑒定。
本發(fā)明的所述蛋白或多肽優(yōu)選通過常規(guī)技術(shù)以純化形式生產(chǎn)(其純度優(yōu)選為至少大約60％，更優(yōu)選80％)，一般，本發(fā)明的蛋白或多肽是在重組大腸桿菌生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生的，而不是分泌到該培養(yǎng)基中的?；蛘?，本發(fā)明的所述蛋白或多肽是分泌到該培養(yǎng)基中的。就非分泌性蛋白而言，為了分離該蛋白，繁殖帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌宿主細(xì)胞，勻漿，并對勻漿物進(jìn)行離心，以除去細(xì)菌碎片。然后對其上清液進(jìn)行熱處理，并通過離心分離所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白。對含有本發(fā)明多肽或蛋白的上清液部分進(jìn)行凝膠過濾，以分離所述蛋白，所述過濾是在合適尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中進(jìn)行的。如果必要，可以通過離子交換或HPLC對該蛋白部分作進(jìn)一步的純化。
另外，可以用常規(guī)技術(shù)通過化學(xué)合成方法制備所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白。
可以用常規(guī)重組DNA技術(shù)將編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子整合到細(xì)胞中。一般，該方法包括將所述DNA分子插入一種表達(dá)系統(tǒng)中，該DNA分子對該系統(tǒng)而言是異源的(即正常情況下不存在的)。所述異源DNA分子是以正確的有義取向和正確的讀框插入所述表達(dá)系統(tǒng)或載體中。該載體具有轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入的蛋白編碼序列所必需的元件。
美國專利US4,237,224(該專利被授予Cohen和Doyer，被收作本文的參考文獻(xiàn))披露了重組質(zhì)粒形式的所述表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)方法，該方法使用了限制酶裂解和用DNA連接酶進(jìn)行的連接。然后通過轉(zhuǎn)化的方法將這些重組質(zhì)粒導(dǎo)入單細(xì)胞培養(yǎng)物并進(jìn)行復(fù)制，所述單細(xì)胞培養(yǎng)物包括原核生物和生長于組織培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞。
還可將重組基因?qū)胫T如痘苗病毒的病毒中?？梢酝ㄟ^將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到感染了病毒的細(xì)胞之中以制備重組病毒。
合適的載體包括，但不限于以下病毒載體，如λ載體系統(tǒng)gtll，gtWES.tB、Charon4，和質(zhì)粒載體，如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II、SK+/-或KS+/-(參見由Stratagene提供的“Stratagene克隆系統(tǒng)”產(chǎn)品目錄(1993)，La Jolla，Calif，該資料被收作本文的參考文獻(xiàn))、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(參見F.W.Studier等，“用T7 RNA聚合酶指導(dǎo)克隆基因的表達(dá)”，基因表達(dá)技術(shù)185卷(1990)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，以及它們的一切衍生物?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化，特別是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、轉(zhuǎn)移或電穿孔將重組分子導(dǎo)入細(xì)胞。用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法將DNA序列克隆到所述載體中，如由Sambrook所披露的方法，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)，該書被收作本文的參考文獻(xiàn)。
可以利用多種宿主-載體系統(tǒng)來表達(dá)所述蛋白編碼序列。首先，該載體系統(tǒng)必需與所使用的宿主細(xì)胞相容。宿主-載體系統(tǒng)包括，但不限于以下系統(tǒng)用細(xì)菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、或粘粒DNA轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌；微生物，如含有酵母載體的酵母；感染過病毒(例如，痘苗病毒，腺病毒等)的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)；感染過病毒(例如桿狀病毒)的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；以及由細(xì)菌感染的植物細(xì)胞。這些載體的表達(dá)因子在其強(qiáng)度和專一性方面有所不同。根據(jù)所使用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用多種合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯因子中的任一種。
由不同的遺傳信號和加工過程控制著多種水平的基因表達(dá)(例如，DNA轉(zhuǎn)錄和信使RNA(mRNA)翻譯)。
DNA的轉(zhuǎn)錄取決于一個啟動子的出現(xiàn)，啟動子是一種DNA序列，由它引導(dǎo)RNA聚合酶的結(jié)合，因此能促進(jìn)mRNA的合成。真核啟動子的DNA序列有別于原核啟動子的DNA序列。另外，在原核系統(tǒng)中，真核啟動子及相關(guān)的遺傳信號不能被識別或不能起作用，而且，在真核細(xì)胞中，原核啟動子也不能被識別和不能起作用。
類似地，mRNA在原核細(xì)胞中的翻譯取決于正確原核信號的出現(xiàn)，該信號有別于真核細(xì)胞中的信號。mRNA在原核細(xì)胞中的有效翻譯需要一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)被稱作Shine-Dalgarno(“SD”)序列，該序列位于所述mRNA上。該序列是一個短的mRNA核苷酸序列，它位于起始密碼子(通常為AUG)之前，由它編碼該蛋白的氨基末端甲硫氨酸。所述SD序列互補(bǔ)于16S rRNA(核糖體RNA)的3’-末端，并有可能與所述rRNA形成雙鏈體的形式促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合，使該核糖體能正確定位。為了了解增大基因表達(dá)的方法，可以參見Roderts和Lauer的著述，酶學(xué)方法，68473(1979)，該文獻(xiàn)收作本文的參考文獻(xiàn)。
啟動子在其“強(qiáng)度”(即其促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力)方面不同。為了表達(dá)一個克隆的基因，需要使用強(qiáng)的啟動子，以便獲得高水平的轉(zhuǎn)錄，并因此獲得該基因的高水平表達(dá)。根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以使用多種合適啟動子中的任一種。例如，當(dāng)把細(xì)菌噬菌體或質(zhì)?？寺〉酱竽c桿菌中時可以使用諸如T7噬菌體啟動子、lac啟動子、trp啟動子、recA啟動子、核糖體RNA啟動子、大腸桿菌噬菌體λ的PR和PL啟動子和其它啟動子，包括，但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等用于指導(dǎo)相鄰DNA片段的高水平轉(zhuǎn)錄。另外，可以用雜合trp-lacUV5(tac)啟動子或通過重組DNA或其它合成DNA技術(shù)生產(chǎn)的其它大腸桿菌啟動子提供插入基因的轉(zhuǎn)錄。
可以選擇細(xì)菌宿主細(xì)胞菌株和表達(dá)載體，使其能抑制所述啟動子的作用，除非受到特別地誘導(dǎo)。在某些操作中，為了有效轉(zhuǎn)錄所插入的DNA，必需添加特殊的誘導(dǎo)物。例如，lac操縱子是通過添加乳糖或IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)的。諸如trp、pro等的多種其它操縱子是受不同的控制。
為了在原核細(xì)胞中進(jìn)行有效的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，也需要特殊的起始信號。該轉(zhuǎn)錄和翻譯起始信號在“強(qiáng)度”方面有所不同，這種不同分別體現(xiàn)在基因特異性mRNA和合成的蛋白的量的不同上。含有一個啟動子的DNA表達(dá)載體，還可以含有各種“強(qiáng)的”轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始信號的任一組合。例如，在大腸桿菌中進(jìn)行的有效翻譯，需要大約7-9堿基的SD序列，該序列位于起始密碼子(ATG)的5’末端，以提供一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因此，能被宿主細(xì)胞核糖體利用的一切SD-ATG組合均可以使用。所述組合包括但不限于源于大腸桿菌噬菌體λ的cro基因或N基因，或源于大腸桿菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG組合。另外，通過重組DNA或其它技術(shù)生產(chǎn)的任何SD-ATG組合均可以使用，所述技術(shù)包括整合合成的核苷酸。
一旦將分離到的編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子克隆到一種表達(dá)系統(tǒng)中，即可將其整合到宿主細(xì)胞中。這種整合可以通過上述各種形式的轉(zhuǎn)化方法實現(xiàn)，所采用的轉(zhuǎn)化方法取決于載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)。合適的宿主細(xì)胞包括，但不限于細(xì)菌、病毒、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲、植物等。
可將本發(fā)明的方法用于處理多種植物的種子，以賦予這些植物對病原體的抗性。合適的種子是雙子葉和單子葉植物的種子。更具體地講，有用的作物類植物可以包括稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥、棉、向日葵、油菜(canola)、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、甘藍(lán)、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、瓜、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。合適的觀賞植物的例子有薔薇、非洲紫苣苔屬、矮牽牛、天竺葵屬、一品紅、菊、香石竹和百日草。
本發(fā)明的賦予病原體抗性的方法可用于產(chǎn)生對多種病原體的抗性，這些病原體包括病毒、細(xì)菌和真菌。
可以用本發(fā)明方法獲得抗性，特別是對以下病毒的抗性煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯x病毒、馬鈴薯y病毒、和番茄花葉病毒。
根據(jù)本發(fā)明，可以賦予植物對細(xì)菌的抗性，特別是對以下細(xì)菌的抗性青枯假單胞菌、丁香假單胞菌煙草致病變種、和野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種。
可以用本發(fā)明方法使植物具有抗性，特別的對下列真菌的抗性尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)和致病疫霉(Phytophthora infestans)。
本發(fā)明的實施方案包括講將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到全部或部分待處理的植物種子上，這一目的可以通過多種方法實現(xiàn)。合適的施加方法包括高壓或低壓噴霧、注射、包衣、噴粉和浸泡。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以設(shè)計出其它合適的施加方法。一旦用本發(fā)明的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物作過處理，即可用常規(guī)方法種植并培養(yǎng)所述種子，以形成植株。在由本發(fā)明處理過的種子繁殖出植株之后，可以通過一次或幾次施加所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白對該植株進(jìn)行處理，以增強(qiáng)該植株中由過敏反應(yīng)誘導(dǎo)的抗性。參見美國專利申請流水號08/475,775，該專利被收作本文的參考文獻(xiàn)。這些繁殖的抗病植株，反過來又可用于生產(chǎn)種子或繁殖體(例如插穗)，由這些種子或繁殖體生產(chǎn)抗性植株。
根據(jù)本發(fā)明，可將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白單獨(dú)或以與其它材料混合的形式施加到植物種子上。
本發(fā)明的一種適于處理植物種子的組合物含有一種包含在一種載體中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。合適的載體包括水、水溶液、糊劑、或干粉。在該實施方案中，所述組合物含有高于0.5nM的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。
盡管不是必需，該組合物可以含有其它添加劑，包括肥料、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、除草劑、及其混合物。合適的肥料包括硝酸銨。合適的殺昆蟲劑的一個例子是馬拉硫磷。有用的殺真菌劑包括克菌丹。
其它合適的添加劑包括緩沖劑、濕潤劑、包衣劑、和摩擦劑。可以用這些材料協(xié)助本發(fā)明的方法。另外，可以與包括粘土和多糖在內(nèi)的其它常見種子成型和處理材料一起將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到植物種子上。
在涉及使用轉(zhuǎn)基因種子的本發(fā)明的其它實施方案中，無須將過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到種子表面上。相反，用編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物是用本領(lǐng)域眾所周知的方法生產(chǎn)的，如biolistics或農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在上文中披露了合適過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白及其編碼DNA的核酸序列的例子。正如本領(lǐng)域所公知的，所述轉(zhuǎn)基因植物含有合適的載體，該載體具有包括病原體誘導(dǎo)型啟動子的各種啟動子，以及轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄、以及可能的翻譯所需的其它元件。這些轉(zhuǎn)基因植物本身可以在能有效賦予病原體抗性的條件下生長。在任何情況下，一旦生產(chǎn)出這種類型的轉(zhuǎn)基因植物，即可回收到轉(zhuǎn)基因種子。然后可以用常規(guī)方法將這些種子播種到土壤中并進(jìn)行培育，以生成植株。所述植株是在能有效賦予該病原體抗性的條件下由所播種的轉(zhuǎn)基因種子繁殖的。
當(dāng)把轉(zhuǎn)基因植物種子用于本發(fā)明時，可以用相同的材料(如上文所述)對其進(jìn)行額外的處理，這些材料被用于處理上述種子，以便將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到所述種子上。可以通過高壓或低壓噴霧、注射、包衣、噴粉和浸泡方法將所述包括過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的其它材料施加到所述轉(zhuǎn)基因植物種子上。類似地，可以通過一次或幾次施加所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物對轉(zhuǎn)基因植物作進(jìn)一步的處理，以增強(qiáng)該植物中由過敏反應(yīng)誘導(dǎo)的抗性。還可以用常見的植物處理劑(例如，殺昆蟲劑、肥料等)處理所述植物。可將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物用于生產(chǎn)種子或繁殖體(例如插穗)，由種子或繁殖體生長出抗病植株。
實施例例1-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理種子的效果將Marglobe番茄種子于第0天浸泡在裝在燒杯中的源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(大約26μmg/ml)溶液或緩沖液中，在28℃下在生長箱中浸泡24小時。在源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或緩沖液中浸泡種子之后于第一天將這些種子播種到裝有人造土的發(fā)芽盆中。在第12天的2片真葉期將幼苗移植到單獨(dú)的盆中。在移植之后，由處理過的種子所長出的某些植株還要噴灑源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(大約13μmg/ml)(處理3和4)。
在第23天用青枯假單胞菌K60菌株接種在上一段文字中所提到的處理過的番茄(參見Kelman，“青枯假單胞菌的致病性與四唑氮培養(yǎng)基上的菌落外觀的關(guān)系”，植物病理學(xué)44693-95(1954))，所述接種過程是這樣進(jìn)行的通過其根部形成一個垂直的切口，并將番茄植株的培養(yǎng)基裝盆(距離其莖部切線方向2cm，2次/盆)，并將10ml(5×108cfu/ml)懸浮液放入其土壤中。
上述方法的每次處理使用10粒用源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理過的種子。
處理1.將種子浸泡在源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白中(大約26μmg/ml)。
2.將種子浸泡在緩沖液中(5mM KPO4，pH6.8)。
3.將種子浸泡在源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白中(大約26μmg/ml)，并在移植時用源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(大約13μmg/ml)噴灑幼苗。
4.將種子浸泡在緩沖液中，并在移植時用源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(大約13μmg/ml)噴灑幼苗。
以上處理的結(jié)果在表1-4中給出。
表1-感染數(shù)據(jù)-種子處理之后28天和接種之后5天
發(fā)病等級0級無癥狀1級1個葉片部分枯萎2級2-3個葉片枯萎3級除了頂部2-3個葉片外全部枯萎4級所有葉片枯萎5級植株死亡表2-感染數(shù)據(jù)-種子處理之后31天和接種之后8天
<p>表4-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理種子的發(fā)病指數(shù)
*發(fā)病指數(shù)是用下列文獻(xiàn)中所提出的方法測定的N.N.Winstead等，“用于評價對青枯假單胞菌的抗性的接種技術(shù)”，植物病理學(xué)42628-34(1952)，特別參見第629頁。
以上數(shù)據(jù)表明，作為種子處理劑，在降低發(fā)病指數(shù)方面，過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白比緩沖液更為有效，而且與用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白噴灑幼小植株的葉片同樣有效。例2-用源于pCPP2139的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白和pCPP50載體處理番茄種子對番茄南方細(xì)菌枯萎病的影響在第0天將Marglobe番茄種子浸泡在裝在燒杯中的源于pCPP2139的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或pCPP50載體溶液中(1∶50，1∶100和1∶200)，在28℃下在生長箱中浸泡24小時。在過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或載體中浸泡種子之后，于第0天將其播種到裝有人造土的發(fā)芽盆中。從以下每一種處理中隨機(jī)挑選10個外觀一致的植株處理菌株 稀釋 Harpin含量1 DH5α(pCPP2139) 1∶508μg/ml2 DH5α(pCPP50)1∶5003 DH5α(pCPP2139) 1∶100 4μg/ml4 DH5α(pCPP50)1∶100 05 DH5α(pCPP2139) 1∶200 2μg/ml6 DH5α(pCPP50)1∶200 0
通過將番茄幼苗植株的根部放在40ml(1×108cfu/ml)懸浮液中浸泡30秒的方式用青枯假單胞菌K60接種所得到的幼苗。然后于第12天將這些幼苗移植到裝有人造土的盆中。
以上處理的結(jié)果在表5-8給出。
表5-種子處理之后16天和接種之后3天
<p>表7-種子處理之后21天和接種之后8天
表8-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物和載體處理種子的發(fā)病指數(shù)
以上數(shù)據(jù)表明，在預(yù)防番茄南方細(xì)菌枯萎病方面所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白比所述載體溶液更為有效。例3-用源于pCPP2139的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白和pCPP50載體處理番茄種子對番茄南方細(xì)菌枯萎病的影響在第0天將Marglobe番茄種子浸泡在裝在燒杯中的源于pCPP2139的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或pCPP50載體溶液中(1∶50，1∶100和1∶200)，在28℃下在生長箱中浸泡24小時。在過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或載體中浸泡種子之后，于第0天將其播種到裝有人造土的發(fā)芽盆中。從以下每一種處理中隨機(jī)挑選10個外觀一致的植株處理菌株 稀釋過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物含量1 DH5α(pCPP2139) 1∶508μg/ml2 DH5α(pCPP50) 1∶5003 DH5α(pCPP2139) 1∶100 4μg/ml4 DH5α(pCPP50) 1∶100 05 DH5α(pCPP2139) 1∶200 2μg/ml6 DH5α(pCPP50) 1∶200 0通過將番茄幼苗植株的根部放在40ml(1×106cfu/ml)懸浮液中浸泡約30秒的方式用青枯假單胞菌K60接種所得到的幼苗。然后于第12天將這些幼苗移植到裝有人造土的盆中。以上處理的結(jié)果在表9-12給出。
表9-種子處理之后16天和接種之后3天
表10-種子處理之后19天和接種之后6天
表11-過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白種子處理之后21天和接種之后8天
表12-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白和載體處理種子的發(fā)病指數(shù)
以上數(shù)據(jù)表明，在預(yù)防番茄南方細(xì)菌枯萎病方面所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白更為有效。例4-用源于pCPP2139的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白和pCPP50載體處理番茄種子對番茄南方細(xì)菌枯萎病的影響在第0天將Marglobe番茄種子浸泡在裝在燒杯中的源于pCPP2139的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或pCPP50載體溶液中(1∶25，1∶50和1∶100)，在28℃下在生長箱中浸泡24小時。在過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或載體中浸泡種子之后，于第1天將其播種到裝有人造土的發(fā)芽盆中。從以下每一種處理中隨機(jī)挑選10個外觀一致的植株處理菌株 稀釋 Harpin1 DH5α(pCPP2139)1∶2516μg/ml2 DH5α(pCPP50) 1∶2503 DH5α(pCPP2139)1∶508μg/ml4 DH5α(pCPP50) 1∶5005 DH5α(pCPP2139)1∶100 2μg/ml6 DH5α(pCPP50) 1∶100 0通過將番茄幼苗植株的根部放在40ml(1×108cfu/ml)懸浮液中浸泡約30秒的方式用青枯假單胞菌K60接種所得到的幼苗。然后于第14天將這些幼苗移植到裝有人造土的盆中。以上處理的結(jié)果在表13-16給出。
表13-種子處理之后19天和接種之后4天
表14-種子處理之后21天和接種之后6天
表15-種子處理之后23天和接種之后8天
表16-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白和載體處理種子的發(fā)病指數(shù)
以上數(shù)據(jù)表明，在預(yù)防番茄南方細(xì)菌枯萎病方面所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白比載體溶液更為有效。在病害控制方面，濃度為1∶50的過敏反應(yīng)蛋白尤其有效。例5-用源于pCPP2139的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白和pCPP50載體處理番茄種子對番茄南方細(xì)菌枯萎病的影響在第0天將Marglobe番茄種子浸泡在裝在燒杯中的源于pCPP2139的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或pCPP50載體溶液中(1∶25，1∶50和1∶100)，在28℃下在生長箱中浸泡24小時。在過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或載體中浸泡種子之后，于第1天將其播種到裝有人造土的發(fā)芽盆中。從以下每一種處理中隨機(jī)挑選10個外觀一致的植株∶處理菌株 稀釋 Harpin1 DH5α(pCPP2139) 1∶2516μg/ml2 DH5α(pCPP50)1∶2503 DH5α(pCPP2139) 1∶508μg/ml4 DH5α(pCPP50)1∶5005 DH5α(pCPP2139) 1∶100 4μg/ml6 DH5α(pCPP50)1∶100 0通過將番茄幼苗植株的根部放在40ml(1×106cfu/ml)懸浮液中浸泡約30秒的方式用青枯假單胞菌K60接種所得到的幼苗。然后于第14天將這些幼苗移植到裝有人造土的盆中。以上處理的結(jié)果在表17-20給出。
表17-種子處理之后19天和接種之后4天
<p>表18-種子處理之后21天和接種之后6天
表19-種子處理之后23天和接種之后8天
表20-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白和載體處理種子的發(fā)病指數(shù)
以上數(shù)據(jù)表明，在預(yù)防番茄南方細(xì)菌枯萎病方面所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白比載體溶液更為有效。在病害控制方面，濃度為1∶50的過敏反應(yīng)蛋白尤其有效。例6-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理水稻種子，以減輕稻桿腐爛病在室溫下，將水稻種子(品種M-202)浸泡在2加侖濃度為20μg的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白溶液中，浸泡24小時。將浸泡在不含過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白的相同溶液中的水稻種子用作對照。浸泡以后，通過飛機(jī)播撒的方法將所述種子播種到稻田中。過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理和對照處理各有4次重復(fù)。每一個重復(fù)的試驗地大小為150Ft2。每塊試驗地的設(shè)計是完全隨機(jī)的，并且以顯著水平感染了稻腐小核菌(Sclerotium oryzae)。播種后3個月，按照以下評級標(biāo)準(zhǔn)評價莖桿的腐爛程度1級＝無病害，2＝在葉鞘的外部存在病害，3＝病害已完全滲透葉鞘，但未出現(xiàn)在稈上，4＝病害出現(xiàn)在稈的外部，但未滲透稈的內(nèi)部，和5＝病害已滲透稈的內(nèi)部。對來自每一個重復(fù)的40個植株進(jìn)行取樣，病評價其發(fā)病率和發(fā)病程度。從表21中可以看出，用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理種子可以減輕發(fā)病率和病害程度。更具體地講，就發(fā)病率而言，對照處理中有67％的植株感染了莖腐病，而過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理組僅有40％的植株感染病害。就病害程度而言，過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理的發(fā)病指數(shù)*為34％，而對照的發(fā)病指數(shù)*為60％。因此，用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理水稻種子可明顯減輕稻桿腐爛病。由過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白在水稻中誘導(dǎo)的抗性能持續(xù)一個季節(jié)的長度。除了抗病性以外，還觀察到用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理過的水稻少有或沒有受到粘蟲(Spoboptera praefica)的破壞。另外，與對照植物相比，處理過的植株較大而且有更深的綠色。
表21-莖腐病(稻腐小核菌)在水稻M-202上的發(fā)病率和發(fā)病程度
例7-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理洋蔥種子對洋蔥條黑粉病(Urocystiscepulae)發(fā)生和對幼苗現(xiàn)出的影響將用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或?qū)φ瘴锾幚磉^的洋蔥種子播種到天然有機(jī)土或“腐殖質(zhì)”土中，所述洋蔥種子的品種為Tennant(種子批號64387)，獲自Crookham公司(Caldwell，ID83606)。由所播種的種子生長出的某些幼苗是健康的，某些具有洋蔥條黑粉病的壞死癥狀，而某些播種下去的種子不能產(chǎn)生能從土壤中長出的幼苗。因此，測定了用各種濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理洋蔥種子的效果。
天然感染的腐殖質(zhì)土獲自紐約州的Oswego縣，在這里已種植過數(shù)年的洋蔥，而且在這里洋蔥條黑粉病已普遍較嚴(yán)重。將桶裝腐殖質(zhì)土(5加侖的塑料桶)放在4℃下保存待用。將所述土壤混合、過篩、并放入10英寸寬、20英寸長和2英寸深的塑料盤中，以用于上述實驗。根據(jù)初步實驗，該土壤中含有洋蔥條黑粉病(Urocystis cepulae)的很多繁殖體，因此，當(dāng)洋蔥種子播種到該土壤中時，在從該土壤中長出的很多幼苗上會出現(xiàn)條黑粉病病斑。另外，該土壤還具有其它微生物，包括會導(dǎo)致“立枯病”的微生物。能導(dǎo)致立枯病的幾種真菌為腐霉菌、鐮孢菌，和絲核菌。
將由解淀粉歐文氏菌的hrpN基因編碼的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白用于處理種子。所述蛋白是通過用高表達(dá)載體在大腸桿菌中發(fā)酵克隆的基因而生產(chǎn)的。通過高壓液相層析對無細(xì)胞誘導(dǎo)物制劑所作的分析探明其過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白的含量，并根據(jù)所探明的含量用水制備合適的稀釋液。將種子浸泡到分別裝有濃度為0、5、25和50μgm/ml的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白的燒杯中，浸泡24小時。將種子取出，用吸水紙簡單地干燥，并播種到腐殖質(zhì)土中。將處理過的種子成行種植，每一個處理的每一行種15粒種子，每一個盤中包括2個重復(fù)，一共有6個重復(fù)。因此，用每一種濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白一共處理了90粒種子。將含有所述種子的所述盤保持在受控制的環(huán)境室中，在60°F(15.6℃)下工作，晝長14小時/夜長10小時。對幼苗的現(xiàn)出癥狀(條黑粉病斑)進(jìn)行觀察。在播種23天后記錄數(shù)據(jù)。
在表22中示出了用不同濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白浸泡洋蔥種子對洋蔥幼苗現(xiàn)出和對洋蔥條黑粉病發(fā)病率的影響。在現(xiàn)出率方面僅觀察出小的差別，這表明用所使用的濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理沒有明顯的效果。在所現(xiàn)出的幼苗中，由未受到過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理的種子長出的幼苗表現(xiàn)出的洋蔥條黑粉病癥狀明顯多于由用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理的種子長出的幼苗的發(fā)病癥狀。在減輕洋蔥條黑粉病實驗中表明用25μgm/ml的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理種子是最有效的濃度。因此，該實施例表明，用洋蔥過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理洋蔥種子可減輕洋蔥條黑粉病的病害程度。
表22-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(即Harpin)處理洋蔥種子對洋蔥條黑粉病(Urocystis cepulae)發(fā)生的影響。
一個幼苗現(xiàn)出然后死亡例8-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理番茄種子對番茄細(xì)菌斑(丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv.tomato)發(fā)生的影響用四種濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(包括非誘導(dǎo)蛋白，水處理對照)處理番茄種子，并將其播種到泥炭蛭石混合土中，所述番茄種子的品種為New Yorker(種子批號2273-2B)，該種子獲自Harris種子公司，(Rochester，紐約)。12天以后，當(dāng)幼苗達(dá)到第二真葉期時，用細(xì)菌斑病原體進(jìn)行接種。10天以后，評價處理過的植株和接種過的植株的感染程度。這樣測定了用各種濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理番茄種子對抗丁香假單胞菌番茄致病變種的抗性的影響。
將由解淀粉歐文氏菌的hrpN基因編碼的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白用于處理種子。所述蛋白是通過用高表達(dá)載體在大腸桿菌中發(fā)酵克隆的基因而生產(chǎn)的。通過高壓液相層析對無細(xì)胞誘導(dǎo)物制劑所作的分析探明其過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白的含量，并根據(jù)所探明的含量用水制備合適的稀釋液。將種子浸泡到分別裝有濃度為0、5、10和20μgm/ml的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白的燒杯中，浸泡24小時。將種子取出，用吸水紙簡單地干燥，并播種。所用土壤是裝在10英寸寬、20英寸長和2英寸深的塑料盤中的泥炭和PearliteTM的混合物。將處理過的種子成行種植，每一個處理的每一行種6粒種子，每一個盤中包括2個重復(fù)，一共有4個重復(fù)，因此，用每一種濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白一共處理了24粒種子。將含有所述種子的所述盤保持在受控制的環(huán)境室中，在75°F(25℃)下工作，晝長14小時/夜長10小時。
當(dāng)生長到12日齡時，用108集落形成單位/ml的病原體接種番茄幼苗，以葉面噴灑劑的形式使用。在接種后用一個塑料蓋覆蓋裝有所述幼苗的盤，保持48小時，以維持高濕度，對癥狀的嚴(yán)重程度進(jìn)行觀察，使用0-5的等級。評級是基于在小葉和子葉上形成的病斑數(shù)量，并根據(jù)由與所述病斑相伴的壞死所造成的對植株部分的相對損傷進(jìn)行的。在接種11天后，分別對子葉和(真)小葉發(fā)病程度進(jìn)行評級。
在表23中示出了不同濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(即harpin)浸泡番茄種子對細(xì)菌斑在番茄小葉和子葉上形成的影響。與處理相比，由實驗中用最高含量的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(20μgm/ml)處理過的種子所長出的幼苗具有較少的染病小葉和子葉。用水處理的對照幼苗與用兩種較低濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理過的植株相比沒有顯著差異?？紤]到發(fā)病等級，這些結(jié)果是相似的。只有用最高濃度的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理過的植株的發(fā)病等級低于其它處理的發(fā)病等級。該實施例表明，用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白處理番茄種子，可減輕番茄細(xì)菌斑的發(fā)病率和嚴(yán)重程度。
表23-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(即Harpin)處理番茄種子對隨后在番茄子葉和番茄小葉上發(fā)生的細(xì)菌斑點(diǎn)病(丁香假單胞菌番茄致病變種)的影響
盡管出于說明的目的已對本發(fā)明作過詳細(xì)說明，對應(yīng)當(dāng)理解的是這些細(xì)節(jié)僅僅是用于說明目的的，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不違背本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下可對這些細(xì)節(jié)加以改變，本發(fā)明的范圍是由以下權(quán)利要求限定的。
序列表(1)一般資料(i)申請人Cornell Research Foundation，Inc.(ii)發(fā)明名稱通過種子處理由過敏反應(yīng)在植物中誘導(dǎo)的抗性(iii)序列數(shù)10(iv)聯(lián)系地址(A)收件人Nixon，Hargrave，Devans &amp; Doyle LLP(B)街道P.O.Box 1051，Clinton Square(C)城市Rochester(D)州紐約(E)國家美國(F)郵編14603(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S60/033,230(B)申請日1996年12月5日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Goldman，Michael L.
(B)注冊號30，727(C)資料/文件號19603/1202(ix)通信資料(A)電話(716)263-1304(B)傳真(716)263-1600(2)序列1資料(i)序列特征(A)長度338氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列1Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala(2)序列2資料(i)序列特征(A)長度2141個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列2CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T2141(2)序列3資料(i)序列特征(A)長度403氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列3Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala(2)序列4資料(i)序列特征(A)長度1288個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列4AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT120ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG180GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG240GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG300GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA360GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA420GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC480TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC540CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG600CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC660GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG720CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC780GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG840TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT900ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG960GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC 1020CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC 1080AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC 1140ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC 1200GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA 1260CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288(2)序列5資料(i)序列特征(A)長度341氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列5Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340(2)序列6資料(i)序列特征(A)長度1026個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列6ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG840GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020GCCTGA 1026(2)序列7資料(i)序列特征(A)長度344氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列7Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340(2)序列8資料(i)序列特征(A)長度1035個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列8ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA1035(2)序列9資料(i)序列特征(A)長度26氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列9Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25(2)序列10資料(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列10Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln1 5 10 15Leu Leu Ala Met20
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)植物種子的方法，該方法能賦予由所述種子生長出的植物對病原體的抗性，該方法包括將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以非感染形式施加于植物種子，處理條件為能有效賦予由該種子所生長出的植物對病原體的抗性。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是分離形式的。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于選自下列一組的病原體的多肽或蛋白歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、疫霉屬、及其混合物。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的多肽或蛋白。
5.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于解淀粉歐文氏菌(Erwinia amyloaora)的多肽或蛋白。
6.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的多肽或蛋白。
7.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于青枯假單胞菌(Pseudomonas solancearum)的多肽或蛋白。
8.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)的多肽或蛋白。
9.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于一種疫霉菌的多肽或蛋白。
10.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述植物選自雙子葉和單子葉植物。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中，所述植物選自下列一組稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥、棉、向日葵、油菜、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、甘藍(lán)、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、瓜、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
12.如權(quán)利要求10的方法，其中，所述植物選自下列一組薔薇、非洲紫苣苔屬、矮牽牛、天竺葵屬、一品紅、菊、香石竹和百日草。
13.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述植物對其有抗性的病原體選自下列一組病毒、細(xì)菌、真菌、及其組合。
14.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述施加是通過噴霧、注射、包衣、噴粉或浸泡實現(xiàn)的。
15.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是以還含有一種載體的組合物形式施加到植物種子上。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述載體選自下列一組水、水溶液、糊劑和粉末。
17.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述組合物含有大于0.5nM的所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。
18.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述組合物還含有選自下列一組的添加劑肥料、殺昆蟲劑、殺線蟲劑、殺真菌劑、除草劑、及其混合物。
19.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是以細(xì)菌形式使用的，該細(xì)菌不會導(dǎo)致發(fā)病，而且是用編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化過的。
20.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是以細(xì)菌形式使用的，該細(xì)菌會導(dǎo)致某些植物種發(fā)病，但不會使以下植物發(fā)病這些植物的種子用所述施加的方法作過處理，并含有編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因。
21.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述施加會導(dǎo)致所述多肽或蛋白浸入所述植物種子。
22.如權(quán)利要求2的方法，還包括將施加了所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的種子播種到土壤中，和由播種的種子繁殖植株。
23.如權(quán)利要求22的方法，還包括將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到所述繁殖的植株上，以增強(qiáng)該植株對病原體的抗性。
24.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是真菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物。
25.一種賦予了病原體抗性的植物種子，對該種子施加了一種非感染型的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。
26.如權(quán)利要求25的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是分離形式的。
27.如權(quán)利要求26的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于選自下列一組的病原體的多肽或蛋白歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、疫霉屬、及其混合物。
28.如權(quán)利要求27的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于菊歐文氏菌的多肽或蛋白。
29.如權(quán)利要求27的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于解淀粉歐文氏菌的多肽或蛋白。
30.如權(quán)利要求27的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于丁香假單胞菌的多肽或蛋白。
31.如權(quán)利要求27的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于青枯假單胞菌的多肽或蛋白。
32.如權(quán)利要求27的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于野油菜黃單胞菌的多肽或蛋白。
33.如權(quán)利要求27的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于疫霉菌的多肽或蛋白。
34.如權(quán)利要求26的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述植物種子是選自下列一組植物的種子雙子葉和單子葉植物。
35.如權(quán)利要求34的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述植物選自下列一組稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥、棉、向日葵、油菜、花生、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、甘藍(lán)、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、瓜、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
36.如權(quán)利要求34的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述植物選自下列一組薔薇、非洲紫苣苔屬、矮牽牛、天竺葵屬、一品紅、菊、香石竹和百日草。
37.如權(quán)利要求27的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述植物對其有抗性的病原體選自下列一組病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲、及其組合。
38.如權(quán)利要求25的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述植物種子細(xì)胞是與細(xì)菌接觸，該細(xì)菌不會導(dǎo)致發(fā)病，而且是用編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化過的。
39.如權(quán)利要求25的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述植物種子細(xì)胞是與細(xì)菌接觸，該細(xì)菌不會導(dǎo)致所述植物發(fā)病，但會導(dǎo)致其它植物種發(fā)病，而且該細(xì)菌含有編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因。
40.如權(quán)利要求26的賦予了病原體抗性的植物種子，其中，所述植物種子浸入了所述多肽或蛋白。
41.一種賦予植物對病原體抗性的方法，該方法包括提供一種編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物種子；將該轉(zhuǎn)基因植物種子播種到土壤中；和由所播種的種子繁殖植株，植株的繁殖是在能有效賦予該植株病原體抗性的條件下進(jìn)行的。
42.如權(quán)利要求39的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于選自下列一組的病原體的多肽或蛋白歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、疫霉屬、及其混合物。
43.如權(quán)利要求42的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于菊歐文氏菌的多肽和蛋白。
44.如權(quán)利要求42的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于解淀粉歐文氏菌的多肽或蛋白。
45.如權(quán)利要求42的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于丁香假單胞菌的多肽或蛋白。
46.如權(quán)利要求42的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于青枯假單胞菌的多肽或蛋白。
47.如權(quán)利要求42的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于野油菜黃單胞菌的多肽或蛋白。
48.如權(quán)利要求42的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于疫霉菌的多肽或蛋白。
49.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述植物選自雙子葉和單子葉植物。
50.如權(quán)利要求49的方法，其中，所述植物選自下列一組稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥、棉、向日葵、油菜、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、甘藍(lán)、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、瓜、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
51.如權(quán)利要求49的方法，其中，所述植物選自下列一組薔薇、非洲紫苣苔屬、矮牽牛、天竺葵屬、一品紅、菊、香石竹和百日草。
52.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述植物對其有抗性的病原體選自下列一組病毒、細(xì)菌、真菌、及其組合。
53.如權(quán)利要求41的方法，該方法還包括將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到所述繁殖的植物上，以增強(qiáng)該植物對病原體的抗性。
54.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是真菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物。
55.一種用權(quán)利要求22的方法產(chǎn)生的植物。
56.一種由用權(quán)利要求22的方法產(chǎn)生的植物所產(chǎn)生的植物種子。
57.一種源于由權(quán)利要求22的方法所產(chǎn)生的植物的植物繁殖體。
58.一種用權(quán)利要求41的方法產(chǎn)生的植物。
59.一種源于由權(quán)利要求41的方法產(chǎn)生的植物的植物種子。
60.一種源于由權(quán)利要求41的方法產(chǎn)生的植物的植物繁殖體。
全文摘要
本發(fā)明涉及賦予植物對病原體抗性的方法。該方法包括將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以非感染形式施加于植物種子,處理條件為讓所述多肽或蛋白接觸所述植物種子的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種賦予了病原體抗性的植物種子。另外,可以將含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物種子播種到土壤中,并由所播種的種子繁殖植株,植株的繁殖是在能有效賦予該植株病原體抗性的條件下進(jìn)行的。
文檔編號A01N63/04GK1245393SQ97181669
公開日2000年2月23日 申請日期1997年12月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月5日
發(fā)明者D·丘, 韋忠民, S·V·比爾 申請人:康乃爾研究基金會有限公司