專利名稱：：鹽穩(wěn)定化酶制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及酶溶液轉化為固體酶制劑的方法，該方法使干燥收率、及貯存和加工穩(wěn)定性均得以改善。酶的應用領域很廣，因此酶在當代科學技術中越來越重要。然而這些化合物的主要缺點之一是其容易失活，不但加工時的極端溫度、pH等條件引起失活，而且在其它條件都正常時長期貯存也導致其自發(fā)失活。本技術中已知的減輕該問題的應用方法包括在酶的溶液中加入各種添加劑使酶穩(wěn)定化，或采用冷凍干燥、噴霧干燥或適于該目的的其它技術將酶溶液轉化為干制劑。當應用要求那樣時通常需要將酶溶液轉化為干制劑(例如適當?shù)嘏c其它干組分混合)。盡管干燥法實質上對于改善酶的貯存穩(wěn)定性是有效方法，但干燥處理過程中常引起很大程度的活性損失而使終產(chǎn)品仍易于失活。在貯存或加工期間的這種活性損失強烈地依賴于制劑的含濕量，因此，需要最嚴格地控制含濕量以維持如此重要的產(chǎn)品的穩(wěn)定性。這還包括為了統(tǒng)一標準或其它目的嚴格減少適于加入最終酶產(chǎn)品的化合物的選用。在很多情況下，干的酶在應用中必須混入含濕量不能如此嚴格地控制的制品中。這些情況下酶的穩(wěn)定性急劇降低。在干燥及后續(xù)的貯存與加工期間對酶進行穩(wěn)定化以防活性損失方面已出現(xiàn)了一些發(fā)明。這些發(fā)明的大多數(shù)(如專利(申請)US3515642，EP0501375A1及WO91/14773中提出的)涉及往酶濃縮物中加入糖類(具體地說是糖或多元醇組分)。本技術中已知的方法還有往制劑中加入某些組分使得在貯存溫度下生成玻璃態(tài)產(chǎn)物，于是提高酶的穩(wěn)定性(EP0383569A2)。另一個方法是往制劑中加入一種或數(shù)種可結合水分的組分。它將降低最終制劑中水的活力或暫時防止從周圍環(huán)境滲入的水與酶相互作用。應用有機和無機鹽作加工助劑(如改善產(chǎn)品的流動性)或填充劑/標定試劑是人們熟知的方法。但是，應用無機鹽提高干的酶制劑在加工或貯存期間的穩(wěn)定性在本技術中看來還沒有報道。在某些情況下由于加入鹽而造成的酶的去穩(wěn)定作用卻被明確提及(例如參見Mikhailova等，1989，VestsiAkadNavukBSSR，SerBiyalNavuk662-65)。EP0522269A2中公開了往有待噴霧干燥的酶溶液中加入不溶性的碳酸鈣。WO92/11347中公開了往含酶的顆粒中混入水溶性無機鹽。該水溶性無機鹽必須是不影響酶顆粒的貯存穩(wěn)定性。WO92/11347提出了適合于該目的的數(shù)種鈉鹽和鉀鹽。但是應在擠出造粒之前將該水溶性無機鹽以干燥狀態(tài)加入酶中。本發(fā)明提出了生產(chǎn)具有較高的干燥收率及所得產(chǎn)物的較高的貯存和加工穩(wěn)定性的固體酶制劑的方法。該方法的實施如下配制含酶及水溶性無機鹽(優(yōu)選是二價陽離子的無機鹽，更優(yōu)選是鋅、鎂或鈣鹽，最優(yōu)選是硫酸鋅或鎂)的溶液；接著將該溶液干燥?；旌系柠}及混合的酶也可用于此目的。二價陽離子是優(yōu)選的，因為它們提供最佳貯存及加工穩(wěn)定性。作為陰離子的硫酸根是優(yōu)選的，因為它賦予最高的干燥收率。本發(fā)明還提出按下列方法制備的固體酶制劑，即制備含酶及水溶性無機鹽(優(yōu)選是二價陽離子的無機鹽，更優(yōu)選是鋅、鎂或鈣鹽，最優(yōu)選是硫酸鋅或鎂)的溶液；然后將包括該酶及該水溶性無機鹽的溶液干燥。在本發(fā)明的方法中，當酶仍處于溶液中時、即在干燥之前鹽就存在了。這不但導致干燥時更高的收率，而且所得干的酶制劑的貯存穩(wěn)定性及其加工穩(wěn)定性也得到了提高。此處的加工穩(wěn)定性是指酶制劑在除貯存以外的任意加工過程中的穩(wěn)定性，例如將酶制劑與其它組分混合時或酶的應用期間。含酶及鹽的溶液干燥后會形成酶及鹽分布均勻的固體組合物。含酶及鹽的溶液的干燥可用技術人員能利用的任意干燥方法來實施，例如噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥、流化床干燥，以及微波干燥。酶-鹽溶液的干燥也可結合?；椒ǎ摲椒ò?，例如流化床或多級干燥機(MSD)的應用。至于應用這些?；椒?，技術人員將明白所得組合物不必是完全均勻的。所得顆粒通常將包括均勻顆粒的聚集物或者有均勻核心和均勻包被的包被顆粒及/或其組合。任何情況下都會存在酶與鹽的相互均勻分散。本發(fā)明的具體實施例證實鹽的穩(wěn)定效果隨著鹽在酶溶液中用量的增加而增大，直至某一點后進一步增加鹽的用量不再提高酶的穩(wěn)定性?；谠撛颍瑧尤胫辽?％、優(yōu)選是至少15％、更優(yōu)選是至少30％、還要更優(yōu)選的是至少60％、最優(yōu)選是至少90％(w/w)的鹽于酶溶液中，其中鹽的用量表示成加入的鹽基于溶液中的酶的重量百分比(w/w)，不包括結晶鹽中結晶水的重量。盡管從本發(fā)明來看鹽的加入沒有上限，但鹽在酶濃縮物中的最大溶解度使之有物理限度。因此只能通過稀釋酶溶液或應用鹽的復合物來實現(xiàn)較高的鹽/酶比。另一需考慮的要點可能是酶被“鹽析”時的用量，這取決于鹽的類型及所考慮的特定的酶。本發(fā)明不排除引起“鹽析”現(xiàn)象的鹽和酶的復合物。本發(fā)明可用于任何類型的酶或酶的混合物，包括但不局限于植酸酶及其它的磷酸酶、淀物酶、蛋白酶、脂肪酶及磷脂酶、纖維素酶如β-葡聚糖酶、果膠酶、半纖維素酶如木聚糖酶及其它的植物細胞壁降解酶、酯酶、粗制凝乳酶如真菌蛋白酶或凝乳酶、以及β-半乳糖苷酶。應注意，每當談到“酶”或“一種酶”時，這些術語也包括酶的混合物，而不考慮這類混合物是從單一發(fā)酵直接得到的、還是從不同的發(fā)酵中得到的酶混合而成的；還包括重組生物體的發(fā)酵得到的酶。酶優(yōu)選選自真菌植酸酶、真菌半纖維素酶、真菌纖維素酶及細菌蛋白酶。酶更優(yōu)選地選自從屬于Raper和Fennell定義的(1965，InTheGenusAspergillus，TheWilliams&amp;WilkinsCompany，Baltimore，pp293-344)黑曲酶(Aspergillusniger)類型的真菌得到的植酸酶及內切木聚糖酶、從木霉菌屬(Trichoderma)菌種得到的β-葡聚糖酶及內切木聚糖酶、以及從芽胞桿菌屬(Bacillus)菌種得到的蛋白酶。本發(fā)明還公開了包括至少一種酶及一種無機鹽的固體組合物，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％(w/w)。無機鹽優(yōu)選是二價陽離子的鹽，更優(yōu)選是鋅、鎂或鈣鹽，最優(yōu)選是硫酸鋅或鎂。無機鹽在組合物中的用量至少是酶重量的5％(w/w)、優(yōu)選至少是15％，更優(yōu)選至少是30％，還要更優(yōu)選的是至少60％以及最優(yōu)選的是至少90％?？芍瞥杀景l(fā)明的組合物的酶包括上述的所有那些酶、尤其是那些優(yōu)選的酶。在本發(fā)明的另一個實施方案中，上述固體組合物被用于制備動物飼料。動物飼料的制備常包括造粒步驟，在此期間酶活性會大量降低。應用本發(fā)明的固體組合物會減少造粒期間酶活性的損失。典型的動物飼料組合物包括供給能量的植物來源原料及有助于生長的代謝物。飼料中添加礦物質及維生素，并且通常把動物脂肪及動物蛋白加入飼料中。在本發(fā)明的又一個實施方案中，公開了包括具有改善了的貯存穩(wěn)定性的植酸酶的固體組合物。固體組合物中植酸酶的貯存穩(wěn)定性是這樣的在30℃下、優(yōu)選是在密閉容器中、貯存8周期間，初始植酸酶活性的損失少于35％、優(yōu)選少于20％、更優(yōu)選少于10％且最優(yōu)選少于5％。植酸酶組合物可以包括生理上可接受的有機或無機載體(例如基于谷類的載體如粗麥粉、小麥面粉、稻殼等等，其它的有機載體如木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、蔗糖等等，無機載體如氯化鈉、硫酸鉀、二氧化硅等等)，以及植酸酶，為了官能性或方便的緣故可能混有其它酶，以及進一步改善產(chǎn)品的外觀或官能性如顏色、流動性、物理、化學或微生物穩(wěn)定性、氣味、味道、粉塵形成等等的試劑。技術人員會明白除了植酸酶外還可制備用作飼料酶的類似組合物。提出下述實施例作為對本發(fā)明的闡述。實施例實施例1將含大約11wt％的酶的真菌植酸酶濃縮物(Gistbrocades生產(chǎn)并提供)分為兩份。在其中的一份中加入240g/l的MgSO4·7H2O。待鹽溶解后得澄清溶液。將兩份溶液用Buchi試驗規(guī)模噴霧干燥機噴霧干燥，干燥機入口溫度為130℃、出口溫度為85℃。將所得粉狀物與粗麥粉以1∶10的重量比混合以抵銷兩份制劑間存在的水分活度的任何差異。平衡后通過測定水份活度即可證實這一點，測得二者在室溫下水分活度為0.45。然后將終產(chǎn)物于30℃下貯存于密閉的壇子里，貯存后同時分析產(chǎn)物的酶活性。貯存8周之后，未加鹽的制劑的活性損失達35％，而加鹽的制劑只損失5％。實施例2在兩份大約含12wt％的酶蛋白質的由芽胞桿菌得到的堿性蛋白酶濃縮物(GenencorInternationalInc.生產(chǎn)并提供)中，分別溶解0和85g/l的MgSO4·OH2O。然后用NiroSTREA-1實驗室規(guī)模流化床涂布機將這些濃縮物涂到硫酸鈉載體上。該處理過程的活性損失分別為28％和14％。將所得顆粒與過量的含漂白劑的歐洲市場上的商品化洗滌劑粉混合后，置于開口壇子內，于35℃及55％的相對濕度下保溫。貯存6周后，加鹽和未加鹽的制劑的殘余酶活性分別為42％和30％。實施例3將240g/l的MgSO4·7H2O溶于一份總的干物質含量為25wt％、含β-葡聚糖酶及內切木聚糖酶、由木霉菌屬得到的酶濃縮物(Gist-brocades生產(chǎn)并提供)中。將所得溶液及原濃縮物用GlattWSG-60流化床涂布機分別涂到硫酸鈉載體上。該處理過程中加鹽的酶濃縮物中β-葡聚糖酶和內切木聚糖酶的活性損失分別為5％和10％，而未加鹽的酶濃縮物中兩種酶的活性損失分別為10％和25％。將所得顆粒在30℃及62％的相對濕度下保溫。貯存12周之后加鹽和未加鹽的酶制劑中β-葡聚糖酶活性損失分別為10％和不能檢出的，而內切木聚糖酶活性損失分別為10％和25％。還將該顆粒與飼料混合物摻混并于70℃下進行中試規(guī)模的造粒處理。加鹽和未加鹽的顆粒中β-葡聚糖酶的活性損失分別達46％和59％、而內切木聚糖酶的活性損失分別為37％和66％。造粒處理中應用的飼料混合物組成如下成分％(w/w)玉米50.00豌豆(22.9％粗蛋白質)3.50脫脂黃豆(45.5％粗蛋白質)28.00木薯淀粉2.38動物粉(58％粗蛋白質)3.60魚粉(72.7％粗蛋白質)1.00水解羽毛粉1.00豆油1.75動物脂肪3.50維生素/礦物質預混合物3.15石灰石0.86磷酸一鈣0.96氯化鈉0.30實施例4將不同量的硫酸鎂各溶于100ml的軟化水中，然后各加入100ml的約含17wt％純酶的真菌植酸酶濃縮物(Gist-brocades生產(chǎn)并提供)?；靹蚝笥脤嶒炇乙?guī)模Buchi900MiniSprayDryer將所得溶液噴霧干燥，干燥機的入口/出口溫度各為140和80℃。將所得顆粒與粗麥粉以1∶9的比率混合。平衡后測定對照樣及最高鹽用量的試樣35℃下的水分活度值、以除去水分活度效應。接著將混合物置于密封瓶中于35℃下保溫8周，隨后測定活性損失值。將測得的結果列于下表</tables>實施例5按實施例4中所述方案，每100ml植酸酶濃縮物中各加入80mmol用量的不同的鹽而制備穩(wěn)定化酶顆粒。與粗麥粉的混合及穩(wěn)定性測試均類似于實施例4。將結果列于下表</tables>權利要求1.通過干燥含酶和水溶性無機鹽的溶液來改善固體酶制劑的加工穩(wěn)定性或貯存穩(wěn)定性的方法，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％(w/w)。2.制備貯存穩(wěn)定且加工穩(wěn)定的含酶固體組合物的方法，該方法包括下列步驟a)制備包括酶和水溶性無機鹽的溶液，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％，以及b)將該溶液干燥。3.按權利要求1或2的方法，其中的無機鹽包括二價陽離子。4.按權利要求3的方法，其中的二價陽離子選自鋅、鎂和鈣。5.按權利要求1-4任一項的方法，其中的無機鹽包括硫酸根陰離子。6.按權利要求1-5任一項的方法，其中的酶選自下列酶優(yōu)選得自曲霉屬的植酸酶、優(yōu)選得自芽胞桿屬的蛋白酶、優(yōu)選得自曲霉屬的半纖維素酶、優(yōu)選得自木霉屬的半纖維素酶及纖維素酶。7.按權利要求1-6任一項的方法，其中含酶和無機鹽的溶液的干燥包括采用選自噴霧干燥機、流化床干燥機及冷凍干燥機的干燥機。8.包括至少一種酶和水溶性無機鹽的固體組合物，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％(w/w)且其中的無機鹽包括二價陽離子。9.通過下列步驟得到的固體組合物a)制備含酶和水溶性無機鹽的溶液，其中無機鹽的用量至少是酶重量的5％，以及b)將該溶液干燥。10.按權利要求8或9的固體組合物，其中的鹽是權利要求3-5中任一項所定義的鹽。11.按權利要求8-10中任一項的固體組合物，其中的酶是權利要求6中定義的酶。12.按權利要求8-11中任一項的固體組合物，其中的組合物中無機鹽與酶是均勻分布的。13.按權利要求8-11的固體組合物，其特征在于該組合物包括其中的無機鹽和酶是均勻分布的顆粒。14.按權利要求8-11的固體組合物，其特征在于該組合物包括其中的無機鹽和酶是均勻分布的涂層。15.含植酸酶、具有貯存穩(wěn)定性的固體組合物，其特征在于該固體組合物在30℃下貯存8周后，活性損失低于初始植酸酶活性的35％。16.包括如權利要求8-15中任一項定義的固體組合物的動物飼料。全文摘要本發(fā)明公開干的酶制劑的加工和貯存穩(wěn)定性的改善方法。也就是說，將某無機鹽例如MgSO文檔編號A23K1/165GK1159208SQ96190833公開日1997年9月10日申請日期1996年7月24日優(yōu)先權日1995年7月28日發(fā)明者R·C·M·巴蘭德斯,H-P·哈勒茨,R·J·貝茨申請人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司