專(zhuān)利名稱(chēng)：新的真菌菌株及其在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的，基因工程化的真菌菌株，及其在制備抗生素中的應(yīng)用。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的，基因工程化的曲霉菌株及其在制備洛伐他汀(lovastatin)藥物及其類(lèi)似物中的應(yīng)用。
洛伐他汀化學(xué)上是[1S-[1α(R＊)，3α，7β，8β(2S＊，4S＊)，8αβ]]-2-甲基丁酸 1，2，3，7，8，8α-六氫-3，7-二甲基-8-[2-(四氫-4-羥基-6-氧-2H-吡喃-2-基)-乙基-1-萘基酯，并具有下列化學(xué)結(jié)構(gòu)式
它可用作抗高膽固醇血癥劑，并且是膽固醇生物合成的限速酶-HMG-CoA還原酶的有效抑制劑。它是使用選擇的真菌菌株經(jīng)發(fā)酵過(guò)程而產(chǎn)生的真菌代謝產(chǎn)物。
抗生素如洛伐他汀是需要幾組酶參予其合成的代謝產(chǎn)物。為了通過(guò)分子克隆能產(chǎn)生抗生素的微生物的方法生產(chǎn)這些抗生素，需要分離、分析，并且或許還要修飾這些酶的相應(yīng)基因?；趶恼婢蟹蛛x這些基因的嘗試，迄今已得到了攜帶其中個(gè)別基因或只攜帶不完整基因的克隆(參見(jiàn)MalpartidaandHopwood，"MolecularCloningoftheWholeBiosyntheticPathwayofaStreptomycesAntibioticanditsExpressioninaHeterologousHost"，Nature(1984)，309，PP.462～464)。
加拿大專(zhuān)利1，129，794(Endo)描述了使用真菌菌種Monacusruber的菌株發(fā)酵制備洛伐他汀的方法。
加拿大專(zhuān)利1，161，380(Monaghanetal.)描述了使用土曲霉(Aspergillusterreus)的菌株發(fā)酵制備洛伐他汀的方法。
在這些現(xiàn)有方法中，洛伐他汀是與其它以大量存在的相似化合物一起產(chǎn)生的，為此必須從中分離之。在使Monacusruber生產(chǎn)洛伐他汀時(shí)，可同時(shí)產(chǎn)生有紅曲霉素J。在用土曲霉生產(chǎn)洛伐他汀時(shí)，可同時(shí)產(chǎn)生有二氫洛伐他汀和羥酸。雖然羥酸可以很容易地內(nèi)酯化為洛伐他汀，但必須從中分離出二氫洛伐他汀。
本發(fā)明的目的是提供新的、基因工程化的，能用于發(fā)酵生產(chǎn)洛伐汀的突變真菌菌株。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供使用這些菌株發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的新方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了適當(dāng)曲霉屬之菌種的一個(gè)新的突變真菌菌株，該菌株能夠表達(dá)并分泌洛伐他汀。這些菌株含有來(lái)源于能產(chǎn)生洛伐他汀的土曲霉菌株DNA的一組功能相關(guān)之洛伐他汀生產(chǎn)酶的基因。這些突變菌株的產(chǎn)生方法是，用另一選自米曲霉(A.oryzae)、煙曲霉(A.fumigatus)、黑曲霉(A.niger)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黃曲霉(A.flavus)的非洛伐他汀生產(chǎn)曲霉菌種對(duì)得自產(chǎn)生洛伐他汀的土曲霉菌株的，并含有適當(dāng)可選擇標(biāo)志的DNA，進(jìn)行原生質(zhì)轉(zhuǎn)化，基于可選擇標(biāo)志選擇如此形成的轉(zhuǎn)化體，鑒定和分離洛伐他汀生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體并再克隆之。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了制備洛伐他汀的方法，該方法包括將含有來(lái)源于土曲霉菌株的，編碼一組洛伐他汀生產(chǎn)酶的基團(tuán)的曲霉屬微生物轉(zhuǎn)化體在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵。并回收如此生成的洛伐他汀。
與使用土曲霉株的方法相比，本發(fā)明的方法可產(chǎn)生只含明顯較小量二氫洛伐他汀和羥酸衍生物的洛伐他汀。
在制備本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的過(guò)程中，可使用選擇的、非洛伐他汀生產(chǎn)曲霉菌株制備原生質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，以及從洛伐他汀生產(chǎn)土曲霉菌株中提取DNA的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，這里無(wú)需詳細(xì)討論。同樣，本文所用的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的技術(shù)和方法也是已知的和常規(guī)使用的。
優(yōu)選的非洛伐他汀生產(chǎn)曲霉屬菌株是米曲霉的菌株，但這對(duì)于成功地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明并不是很?chē)?yán)格的。也可使用其他曲霉菌種，如黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、煙曲霉及黃曲霉。以米曲霉作為優(yōu)選菌種是考慮到該霉菌菌種在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模發(fā)酵條件下易于操作并且安全。
為了在進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后，從非轉(zhuǎn)化體中選擇出轉(zhuǎn)化的微生物、土曲霉的DNA應(yīng)含有可選擇的標(biāo)志。有多種不同的市場(chǎng)上可購(gòu)得的可選擇標(biāo)志供熟練技術(shù)人員選擇，而選用何種標(biāo)志對(duì)于成功地完成本發(fā)明并不是關(guān)鍵的?？墒褂冒逼S青霉素抗性、利福平抗性、鏈霉素抗性等抗生素抗性標(biāo)志，并可在含有適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體的混合物，從而只使含有可選擇標(biāo)志的轉(zhuǎn)化體在該培養(yǎng)基中存活并得以分離之。
為方便起見(jiàn)，特別優(yōu)選的可選擇標(biāo)志是放線(xiàn)菌酮抗性標(biāo)志。放線(xiàn)菌酮是一種蛋白質(zhì)合成的抑制劑，從而可很容易地檢測(cè)培養(yǎng)物中放線(xiàn)菌酮放線(xiàn)菌株或轉(zhuǎn)化體的存在。
在基于可選擇標(biāo)志選擇轉(zhuǎn)化體之后，再根據(jù)它們表達(dá)和分泌洛伐他汀的能力篩選之。在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過(guò)程中所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中，只有少數(shù)具有這種能力?？稍跇?biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化體，并用例如HPLC方法分析所得培養(yǎng)基中洛伐他汀的存在來(lái)識(shí)別它們。然后再次培養(yǎng)并增殖在上述分析中呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化體，以產(chǎn)生新的、能生產(chǎn)洛伐他汀的曲霉屬，更好是米曲霉種的轉(zhuǎn)化之真菌微生物的菌落。
下列實(shí)驗(yàn)實(shí)施例在于進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明。
在附圖中


圖1圖解顯示對(duì)按下列實(shí)施例1所述方法產(chǎn)生的粗制真菌提取物進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果;
圖2顯示從雜交菌株得到并純化的洛伐他洛化合物的1H-NMR圖譜;
圖3顯示同一化合物的質(zhì)譜;
圖4顯示新的轉(zhuǎn)化體AoAt/NBJ-V的形態(tài)學(xué)特征。
實(shí)施例1材料和方法真菌培養(yǎng)物用于本研究的土曲霉和米曲霉真菌分離物是從收集自AgricultureCanada，ResearchStation，Beaverlodge，Alberta，Canada的淡紫色土壤樣品中分離的。
選擇放線(xiàn)菌酮抗性突變體于28±2℃，使兩種曲霉菌種分離物在含有放線(xiàn)菌酮(濃度0.1-5mM)的Czapek′s dox培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天后，將所得土曲霉和米曲霉分離物的孢子(108)分散于含10mM放線(xiàn)菌酮的Czapek′s dox培養(yǎng)液(50ml)上并保溫30分鐘，于10，000g離心10分鐘，然后重新懸浮于無(wú)菌蒸餾水中。經(jīng)攪拌并重新離心沉淀將孢子洗3次。然后將孢子懸浮于無(wú)菌的1%(v/v)Triton X-100溶液中，并以一等份加于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上檢測(cè)其數(shù)目。將適當(dāng)?shù)南♂屢悍稚⒂诤?0mM放線(xiàn)菌酮選擇培養(yǎng)基上，并于28±2℃下保溫，10天后分離抗性突變體。檢測(cè)分離物的洛伐他汀產(chǎn)生能力。分離能產(chǎn)生洛伐他汀的放線(xiàn)菌酮抗性土曲霉分離物，用以作進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化研究。
原生質(zhì)體和DNA制備在50mlCzapek′sdox培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)米曲霉和產(chǎn)生洛伐他汀的放線(xiàn)菌酮抗性土曲霉(本文中稱(chēng)為JAG-4703)分離物。于28±2℃，在旋轉(zhuǎn)振蕩器(NewBrunswickScientificInc.)上，以200rpm將培養(yǎng)物保溫58小時(shí)，然后收獲并借助反復(fù)離心用無(wú)菌蒸餾水洗這些培養(yǎng)物。
基本上按Dickinson和Isenberg[J.GenMicrobiol，128，pp.651-654(1982)]所述的方法。在10-12小時(shí)消化期間使用Novozym234(NovoNordisk，NOVOAlle，DK2880，BagsvaerdDenmark)除去細(xì)胞壁，以制得兩種曲霉培養(yǎng)物的原生質(zhì)體。各曲霉菌種的原生質(zhì)體等分樣品在含有0.1g瓊脂(Difco)、5g山梨糖和0.35gEDTA(在50ml蒸餾水中)的再生培養(yǎng)基(R)中于28℃保溫24小時(shí)后，再生出活的、單細(xì)胞帶壁的孢子。萌發(fā)后，這些孢子均出現(xiàn)其親代的所有培養(yǎng)特征。
按照Schlief和Wensink[“PracticalMethodsinMolecularBiology”，33，21-29(1981)]所述的方法從土曲霉原生質(zhì)體中分離總DNA。將原生質(zhì)體懸浮在由10mg/mlSDS、0.1MNaCl和0.1MTris-HCl(PH9.0)組成的溶液中。加入等體積用Tris-HCl緩沖液飽和的苯酚。在Eppendorf離心管(BrinkmannInstruments，CanadaLtd.，Rexdale，Ontario)中將混合物以12，000g離心10分鐘。除去含DNA的上面水相，與95%乙醇混合，于-20℃下放置60分鐘，然后按前述條件離心10分鐘。將沉淀物重新懸浮在緩沖液(PH7.0)中，與核糖核酸酶(SigmaSt.Louis，MO，USA)一起保溫，用苯酚處理并從水相中沉淀出DNA。將所得DNA吸附于在10mMTris-HCl緩沖液(PH7.5)和0.3MNaCl中預(yù)浸漬并含在吸管內(nèi)的DEAE-纖維素(DE-52，Whatman)上，然后洗出以純化分離的DNA。其中用含有1.5MNaCl的10mMTris-HCl緩沖液(PH7.5)洗脫DNA。將該溶液稀釋到0.2MNaCl并用2倍體積的乙醇沉淀DNA。經(jīng)測(cè)定A260/A280吸光率比值，從200-320nm譜段估測(cè)DNA的純度。只將這一比值在1.50至2.00之間的DNA用于轉(zhuǎn)化。在再生培養(yǎng)基中保溫各0.1mg分離之DNA的6份樣品，以確保沒(méi)有活的原生質(zhì)體，且均沒(méi)有發(fā)育成集落。
原生質(zhì)體-DNA保溫在5ml再生培養(yǎng)基(其組成如上所述)中將大約5.2×104個(gè)米曲霉原生質(zhì)體(根據(jù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)結(jié)果估測(cè)之)，與10-100ng土曲霉DNA一起保溫，并按上述方法使之再生。為了研究DNA對(duì)洛伐他汀表達(dá)的可能的化學(xué)影響，將10-100μg小牛胸腺DNA(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)、DNA(Bethesda Research Laboratories，Gaitherberg，MD，USA)和同源米曲霉DNA與相似量的米曲霉原生質(zhì)體一起保溫。當(dāng)在保溫混合物中包括DNA時(shí)，原生質(zhì)體再生降低到10%以下，并有差不多數(shù)目如此處理的原生質(zhì)體(105)沒(méi)有產(chǎn)生任何放線(xiàn)菌酮抗性。
洛伐他汀產(chǎn)生及檢測(cè)在含有10mM放線(xiàn)菌酮的Czapek′sdox瓊脂培養(yǎng)基上保溫從已與土曲霉DNA保溫的米曲霉原生質(zhì)體發(fā)育而成之孢子的懸浮液。于28±2℃保溫48小時(shí)后，培養(yǎng)物達(dá)到直徑6-8mm。在這些條件下，它們各自都是從單一孢子發(fā)育而成的。有Czapek′s培養(yǎng)基(在500mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中含50ml)上分別保溫這些在放線(xiàn)菌酮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)過(guò)的孢子，并于28±2℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器(200rpm)上保溫12天。按下述程序和HPLC分析法檢測(cè)各生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)洛伐他汀的產(chǎn)生情況。
提取用17NHCl將發(fā)酵的培養(yǎng)液(50ml)酸化到PH4.0，然后對(duì)乙酸乙酯(100ml，3×)分級(jí)分離。于30℃下真空干燥合并的乙酸乙酯部分，將殘留物收集到乙腈(5ml)中，然后進(jìn)行HPLC分析。
HPLC分析HPLC裝置(BeckmanModel420)由BeckmanInstruments，Toronto，Canada提供，并由一個(gè)Altex泵(110A型)和注射閥組成。LC-UV檢測(cè)儀定在237nm。使用hypersilC-180DS硅膠柱(25×0.46cm，i.d.)和流速為1.0ml/分鐘的乙腈和水(55∶45，v/v)溶劑系統(tǒng)。根據(jù)所作的標(biāo)準(zhǔn)洛伐他汀曲線(xiàn)比較所產(chǎn)生的洛伐他汀并定量分析之。
實(shí)施例1-結(jié)果5.2×105個(gè)米曲霉原生質(zhì)體與得自放線(xiàn)菌酮抗性土曲霉的洛伐他汀生產(chǎn)突變體的DNA共保溫后，得到79個(gè)放線(xiàn)菌酮抗性分離物，且其中包括4個(gè)洛伐他汀生產(chǎn)分離物。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了六次。
結(jié)果在下列表1中給出。
表1與得自放線(xiàn)菌酮抗性并產(chǎn)生洛伐他汀的土曲霉突變體的DNA一起保溫過(guò)的放線(xiàn)菌酮抗性并表達(dá)洛伐他汀的米曲霉原生質(zhì)體實(shí)驗(yàn)#原生質(zhì)體(ml)原生質(zhì)體融合后再生DNA洛伐他汀再生的原生質(zhì)體率(ng)生產(chǎn)分離數(shù)(#/ml)(%)物的數(shù)目i) 7.4×1054.1×10556 100 0ii) 5.2×1053.1×10560 75 2iii) 5.2×1053.7×10572 50 2iv) 4.0×1052.7×10570 25 0v) 2.6×1051.5×10565 10 0vi) 1.6×1051.1×10570 0 0一個(gè)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物AO-Ⅱ，其原始轉(zhuǎn)化的特性保持了6個(gè)月。
圖1顯示對(duì)得自米曲霉受體和供體的培養(yǎng)物，以及用土曲霉DNA處理之米曲霉培養(yǎng)物的提取物進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果。下列表2中顯示被轉(zhuǎn)化的分離體產(chǎn)生洛伐他汀的量。
表2在Czapek′sdox培養(yǎng)液(PH6.8)中被轉(zhuǎn)化的米曲霉分離物的洛伐他汀產(chǎn)生量分離物洛伐他汀產(chǎn)率(mg/l)AO-I15.36±1.78AO-II26.89±3.76AO-III13.46±4.56AO-IV9.67±0.75分離物No.AO-Ⅰ再培養(yǎng)5次，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體AoAt-NBJ/5，該轉(zhuǎn)化體已于1992年2月25日作為活的、永久培養(yǎng)物保藏在AmericanTypeCultureCollection，保藏登記號(hào)為ATCC74135。
洛伐他汀是以與其羥酸類(lèi)似物結(jié)合的形式產(chǎn)生的，后者可借助例如在甲苯中回流，以完成內(nèi)酯化等方法很容易地轉(zhuǎn)化成洛伐他汀，從而提高洛伐他汀的產(chǎn)率。這些實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有進(jìn)行內(nèi)酯化轉(zhuǎn)化。
土曲霉親代培養(yǎng)物在Czapek′sdox培養(yǎng)液中產(chǎn)生的洛伐他汀為166.72±5.92mg/L，而親代米曲霉沒(méi)產(chǎn)生任何洛伐他汀。
附圖2顯示用HPLC方法純化的雜交菌株產(chǎn)生之洛伐他汀化合物的1H-NMR譜。經(jīng)與已知的洛伐他汀的標(biāo)準(zhǔn)譜線(xiàn)比較，證明所得產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品完全相同。
附圖3是同一產(chǎn)物的質(zhì)譜，并表明所得洛伐他汀的純度為99%。
培養(yǎng)基中DNA的濃度范圍為每毫升5-20ng時(shí)，即不影響米曲霉原生質(zhì)的再生能力，也不影響與土曲霉DNA保溫后放射菌酮抗性和產(chǎn)生洛伐他汀之分離物的回收率。數(shù)據(jù)表明，這些濃度并不是洛伐他汀生產(chǎn)中的限制因素。與未處理的對(duì)照組比較培養(yǎng)基中濃度在每毫升5ng至5μg的小牛胸腺DNA，DNA和同源米曲霉DNA同樣不影響米曲霉原生質(zhì)體的再生。然而，培養(yǎng)基中DNA濃度為10-100μg/ml時(shí)，可分別使再生能力降低至最大26%和1%。這些DNA處理沒(méi)有引發(fā)洛伐他汀表達(dá)。
使用更復(fù)雜的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，該再生培養(yǎng)基產(chǎn)生了大量與Acha等人(J.Gen.Microbiol.，45，515-523(1966))得到者差不多的原生質(zhì)體。分生孢子和新鮮發(fā)芽的分生孢子可比菌絲體產(chǎn)生更高得率的存活原生質(zhì)體及DNA。在本系統(tǒng)中沒(méi)有觀察到Acha等人(1966)所描述的原生質(zhì)體再生期間出現(xiàn)的細(xì)胞集聚。負(fù)責(zé)放線(xiàn)菌酮抗性表達(dá)和洛伐他汀表達(dá)的因子從土曲霉向米曲霉的表觀轉(zhuǎn)移，表明發(fā)生了種間DNA的轉(zhuǎn)化。放線(xiàn)菌酮抗性和洛伐他汀生產(chǎn)能力的共轉(zhuǎn)化作用是出人預(yù)料的，并提示參預(yù)這些特征之表達(dá)的基因在物理上很接近并可能是叢聚在一起的。
新的轉(zhuǎn)化體AoAt-NBJ/5的形態(tài)學(xué)如圖4所示，并可鑒定出如下特征AoAt-NBJ/5的形態(tài)學(xué)分生孢子頭呈柱狀，淡褐色。分生孢子梗平滑，無(wú)色。囊泡半園形，被呈雙層排布的瓶梗包至1/2或2/3。分生孢子在Czapek瓊脂上迅速長(zhǎng)成球園或髓園體的平滑集落，由于分生孢子的生長(zhǎng)而呈現(xiàn)被叢卷毛或被茸毛的桂皮褐色。桔黃色滲出物使之由黃色變?yōu)楹稚?br> 這些實(shí)驗(yàn)證明，原則上一種真菌的遺傳確定的抗生素生產(chǎn)特性可在另一種真菌中得以表達(dá)。
實(shí)施例2-生產(chǎn)方法真菌培養(yǎng)物使用轉(zhuǎn)化的米曲霉(ATCC＃74135)AoAt/NBJ-V培養(yǎng)物生產(chǎn)洛伐他汀。
發(fā)酵種子制備將真菌培養(yǎng)物(凍干的瓶裝樣品)無(wú)菌轉(zhuǎn)移到馬鈴薯-右旋糖瓊脂斜面上，并于25℃下培養(yǎng)4-5天。保溫結(jié)束時(shí)，加入10mlTritonX-100(0.01%)溶液，用力攪拌以制備分生孢子懸液，然后將此分生孢子懸液轉(zhuǎn)移到裝在培養(yǎng)瓶(容積250ml)內(nèi)的無(wú)菌稻米(50g)上。向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)另外添加10ml無(wú)菌水，強(qiáng)烈攪拌并于28℃下保溫5-7天。保溫結(jié)束時(shí)，加入無(wú)菌水(50ml)。
使分生孢子懸液通過(guò)無(wú)菌紗布并將含分生孢子的濾液(1×106個(gè)分生孢子/ml)轉(zhuǎn)移到含30L種子培養(yǎng)基的種子發(fā)酵器(容積50L)內(nèi)。種子培養(yǎng)基的組成如下D-葡萄糖20g/L麥芽提取物20g/L新胨(neo-peptone)3g/L自來(lái)水1L用10%NaOH調(diào)至PH6.8。培養(yǎng)基于121℃下高壓滅菌(15psi)15分鐘。于28℃，在含80-100%溶解氧的條件下(通氣速度0.3-0.5vvm)將種子培養(yǎng)(200rpm)17-20小時(shí)。
洛伐他汀的生產(chǎn)將種子(30L)轉(zhuǎn)移到含生產(chǎn)培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵器(工作體積1，000L)內(nèi)。生產(chǎn)培養(yǎng)基組成如下乳糖60g/LArdaminePH10g/L大豆蛋白2g/LKCL2g/LKH2PO40.8g/LMnSO4·4H2O 0.03g/L甜菜堿0.6g/LP20002ml自來(lái)水1L在滅菌之前用105 NaCl/H2SO4調(diào)到PH6.8，然后于121℃(15-20psi)高壓滅菌1小時(shí)。
接種后，在控制PH6.0-6.2(用10%H2SO4)的條件下，使培養(yǎng)于28℃生長(zhǎng)7-8天。通氣速度保持在0.7-1.0vvm(溶解氧為80-100%)。
第2生產(chǎn)階段將7天的發(fā)酵液(50L)無(wú)菌轉(zhuǎn)移到含有1，500L種子培養(yǎng)基(成分如上所示)的種子發(fā)酵器(工作體積2，000L)內(nèi)。使種子于28℃(200rpm;D.0.80-100%)生長(zhǎng)24小時(shí)。將發(fā)酵液(200L)無(wú)菌轉(zhuǎn)移到含有18，000L生產(chǎn)培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵器(容積30，000L，工作體積20，000L)內(nèi)。在控制PH6.0-6.2的條件下使培養(yǎng)物于28℃繼續(xù)生長(zhǎng)7-9天，發(fā)酵60小時(shí)后，不再控制PH。在發(fā)酵5天期間內(nèi)用種子培養(yǎng)基補(bǔ)充發(fā)酵液(速率10L/小時(shí))。種子培養(yǎng)基的組成如下D-葡萄糖285.7g/LArdaminePH71.4g/L大豆蛋白14.3g/L自來(lái)水1L滅菌前調(diào)PH至6.8，然后于121℃高壓滅菌30-45分鐘。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，用10NHCl將發(fā)酵液酸化至PH4.0并離心之。于55℃下干燥真菌沉淀餅并提取之。
提取和純化加冷乙酸乙酯(10-15分鐘)將干燥的真菌餅(20Kg)制成勻漿，并于80-85℃將此勻漿材料回流4-6小時(shí)，然后冷卻并過(guò)濾，真空下將濾液干燥成黑色柏油狀材料(2.5-3Kg)。將此黑色柏油狀材料與硅膠(2.5Kg)和CH2Cl2(5升)混合。真空蒸發(fā)掉CH2Cl2，并將硅膠混合的粗柏油狀材料倒在硅膠玻璃柱(長(zhǎng)100cm×直徑22.5cm)上，并用乙酸乙酯∶己烷(1∶2，v/v)展層。收集樣品(2，000jl，12×)24小時(shí)后將洗脫溶劑混合物變成乙酸乙酯∶己烷(1∶1，v/v)，并繼續(xù)層析24小時(shí)。收集含產(chǎn)物的樣品，干燥(280g)并用甲醇結(jié)晶之。
結(jié)晶將干燥的黃色產(chǎn)物(280g)溶解在2.8L甲醇中并于60-65℃煮沸40-60分鐘。過(guò)濾熱甲醇混合物并于4℃下將濾液保溫4-6小時(shí)從母液中分離出白色針狀結(jié)晶并以冷甲醇淋洗。真空干燥結(jié)晶物，稱(chēng)重(190g)并保存在4℃干燥器內(nèi)。
使用本發(fā)明的方法可使洛伐他汀產(chǎn)率高到足可破壞米曲霉轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞壁，從而以這種方法即可免去在回收洛伐他汀前溶解細(xì)胞的步驟。這樣即可大大簡(jiǎn)化后續(xù)回收和純化工藝。如上所述，可用溶劑提取方法回收按本工藝生產(chǎn)的洛伐他汀，而無(wú)須在回收過(guò)程中形成其酯、鹽等。為進(jìn)行回收和純化，溶劑提取是比層析法更為簡(jiǎn)單、更為經(jīng)濟(jì)的方法。
雖然已借助特定實(shí)驗(yàn)更詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但應(yīng)明確的是，這些實(shí)施例并不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍是由待批權(quán)利要求限定的。
權(quán)利要求
1.制備洛伐他汀的方法，該方法包括發(fā)酵含有曲霉屬菌株之已轉(zhuǎn)化真菌微生物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并從此營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收洛伐他汀，其中所說(shuō)的曲霉屬菌株選自米曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、煙曲霉及黃曲霉，所說(shuō)的菌株不能表達(dá)洛伐他汀，但已被轉(zhuǎn)化而含有編碼一組能夠合成洛伐他汀的酶的和可選擇標(biāo)志的外來(lái)DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中被轉(zhuǎn)化的微生物含有衍生自洛伐他汀生產(chǎn)土曲霉菌種的外來(lái)DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，所說(shuō)的曲霉菌株是米曲霉種的菌株。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中引入轉(zhuǎn)化體中的外來(lái)DNA含有作為可選擇標(biāo)志的放線(xiàn)菌酮抗性基因。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)化體是本文中描述并限定的AoAi-NBJ/5。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，該方法包括使發(fā)酵過(guò)程中形成的羥酸類(lèi)似物內(nèi)酯化以形成洛伐他汀的附加步驟。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中用溶劑提取法回收洛伐他汀。
8.帶有一組能合成洛伐他汀之酶的新的真菌轉(zhuǎn)化體，所說(shuō)的轉(zhuǎn)化體是選自米曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、煙曲霉和黃曲霉之曲霉種的菌株，該菌株天然不能表達(dá)洛伐他汀，但含有包括編碼一組能合成洛伐他汀之酶的基因的外來(lái)DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的真菌轉(zhuǎn)化體，其中曲霉菌種選自米曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、和煙曲霉。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的真菌轉(zhuǎn)化體，其中曲霉菌種是米曲霉。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的真菌轉(zhuǎn)化體，其中外來(lái)DNA衍生于表達(dá)洛伐他汀的土曲霉種的菌株。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的真菌轉(zhuǎn)化體，還包括從所說(shuō)土曲霉菌株轉(zhuǎn)化到所說(shuō)米曲霉菌株內(nèi)的總DNA原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
13.如本文所描述并限定的真菌轉(zhuǎn)化體AoAt-NBJ/5。
全文摘要
使用將表達(dá)洛伐他汀的土曲霉菌株的DNA引入不表達(dá)洛伐他汀的曲霉屬菌株如米曲霉菌株內(nèi)所產(chǎn)生的真菌轉(zhuǎn)化體，以發(fā)酵方法生產(chǎn)洛伐他汀。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1076965SQ9310268
公開(kāi)日1993年10月6日 申請(qǐng)日期1993年2月10日 優(yōu)先權(quán)日1992年2月10日
發(fā)明者J·S·達(dá)希亞 申請(qǐng)人:諾沃制藥有限公司