專利名稱:掌狀葉大黃的莖尖培養(yǎng)法的制作方法
本發(fā)明是有關(guān)掌狀葉大黃(以下說明的掌狀葉大黃是日本藥典第十次修正此記載的Rheum palmatum linne′，Rheum offic-inale Baillon，Rheum tanguticum Maximowicz Rheum coreanum Nakai，以及介于這些種之間的雜種，但不包括Rheum undulatum L.Rheum rhaponticum L)的莖尖養(yǎng)法、更確切地說是關(guān)于可行的掌狀葉大黃的培養(yǎng)增殖的方法。
蓼科大黃屬(Rheum)是生長于歐亞大陸各地植物群，根據(jù)葉身形狀不同而分為圓葉大黃和掌狀葉大黃，自花不親合而多要通過種間雜交，種子的特性是具有僅通過營養(yǎng)繁殖來保持共同的性質(zhì)。而圓葉大黃是用于果醬等食品，掌狀葉大黃則廣泛地用作以瀉甙(senn-oside)A，B，C，D，蒽醌類、丹寧類等為藥效成份的生藥。
可是，大黃存在屬有1個問題，就是如上所述由于多是種間雜交等原因，所以就不可能大量地以及常年穩(wěn)定地獲得具有一定質(zhì)量的大黃。因而很早以來采用營養(yǎng)增殖法的方法以及作為這種植物的組織培養(yǎng)法而為公所周知的莖尖培養(yǎng)法等就一直在進(jìn)行研究。例如沃爾基氏等(D，G、A、Walkey ＆ K、A、MatheWs)就提出過有關(guān)圓葉大黃中的R、rhaponticum Timpertey Early的莖尖培養(yǎng)法(Plant Science Letters，14，287…290(1979)。沃爾基氏等的方法之特征是;在加有激動素及β吲哚基乙酸的培養(yǎng)基上進(jìn)行莖尖培養(yǎng)。
然而本發(fā)馀人通過對掌狀葉大黃施于同樣的方法試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生長點細(xì)胞沒有增殖而枯死。一般認(rèn)為這是由于圓葉大黃和掌狀葉大黃種類的不同而對生長激素的要求不同所致。
本發(fā)明從上述的觀點出發(fā)而旨在于提供可行的具有藥效成份的掌狀葉大黃的培養(yǎng)增殖的方法。
另外，本發(fā)明的另一目的就是通過在一定條件下的培養(yǎng)能夠通過均一而且理想的育苗，保種而獲得穩(wěn)定的含有一定質(zhì)量的有效成份的大黃。
達(dá)成上述之目的的本發(fā)明之莖尖培養(yǎng)法所具有的特征是采用含有有芐腺嘌呤或者是其的核苷(芐腺苷)和萘乙酸或者是β吲哚基乙酸的培養(yǎng)基，來進(jìn)行新芽的形成和增殖，然后在只含有萘乙酸或者β吲哚基乙酸中任何一種來作為生長激素的培養(yǎng)基上來讓其生根。
有關(guān)本發(fā)明所具有的特征是基于經(jīng)過反復(fù)多種的試驗之結(jié)果而形成的，以下對此給予詳細(xì)地說明。
當(dāng)有在以下的說明里，對于廣義的生長激素這個詞，主要是作用于形態(tài)生長的就稱態(tài)生長激素，而主要是作用于分化促進(jìn)的就稱分化促進(jìn)激素，這樣來便于使用。這些詞雖然可能說能夠符合多數(shù)研究者的意見，但是本發(fā)明人認(rèn)為在說明本發(fā)明時是有效而且是比較合理的用語。
所謂的本發(fā)明之莖尖培養(yǎng)法是指適用于無菌取出生長點，培養(yǎng)(新芽形成、增殖、生根)、及幼苗栽培。
無菌取出生長點大黃的生長點存在于根莖最上部，一般是生長期(4月下旬至10月上旬)用刀具把根莖部切斷，除去露出部、滅菌、水洗后在解剖顯微鏡下用刀具取出。
培養(yǎng)培養(yǎng)工程是按新芽(葉片，葉柄，幼芽愈合體素)形成，增殖(分化)以及生根的順序三個工程來進(jìn)行。這些各個工程都是根據(jù)適宜的培養(yǎng)方法以及適宜各個工程的培養(yǎng)基的選擇來決定適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。
培養(yǎng)基是由一般的基礎(chǔ)培養(yǎng)基也就是在無機鹽組成里含有碳(C)源，維他命類等有機物主要成份的含成培養(yǎng)基加上特定的形態(tài)生長激素及分化促進(jìn)而形成的。
本發(fā)明的特征是在上述新牙形成、增殖(分化)的前二個工程里、是使用萘乙酸或者β吲哚基乙酸的任何一種來作為形態(tài)生長激素，而作為分化促進(jìn)激素則使用芐基腺嘌呤，芐基腺嘌呤是可以以核苷即芐腺甙代替使用。
上述萘乙酸的濃度一般可在1.1×10-5-4.2×10-5mol/l范圍內(nèi)使用，較好的范圍是2.1×10-5-4.2×10-5mol/l，最適宜的使用約為2.1×10-5mol/l。而在1.1×10-5mol/l以下分蘗度就不允分，在4.2×10-5mol/l以上，特別在5.3×10-5mol/l就有出現(xiàn)藥害的傾向。
β吲哚基乙酸一般可在1.7×10-5-6.7×10-4mol的范圍使用，但是新牙的形態(tài)生長的程度，比采用萘乙酸的場合低。
芐基腺嘌呤(或者是核苷)的濃度一般在8.8×106-5.6×105mol/l的范圍內(nèi)是有效的，而最適合的使用濃度為3.4×105mol/l。如果在5.6×105mol/l以上就會有1/100以上的比例出現(xiàn)抽苔(形成花芽，并可看到植物衰退)。
當(dāng)有與本發(fā)明相對比，作為形態(tài)生長激素所選擇的有β吲哚丁酸，赤霉素、2，4-二硝基苯氧基乙酸，還有作為分化促進(jìn)激素則選擇動力精，包括這些與上述的萘乙酸，β吲哚基乙酸以及芐嘌呤把組合進(jìn)行了試驗，而在本發(fā)明所特定的生長激素的組合以外的則如后面表1所示未發(fā)現(xiàn)有新牙形成。
培養(yǎng)一般是在適于植物細(xì)胞內(nèi)的PH5.6進(jìn)行。培養(yǎng)法有采用培養(yǎng)瓶的靜止培養(yǎng)，轉(zhuǎn)換培養(yǎng)以及讓氧氣不斷地流入液體培養(yǎng)基里而進(jìn)行的容器培養(yǎng)等均可適宜地進(jìn)行選擇。特別是有關(guān)新牙形成多要求采用濾紙交聯(lián)上的培養(yǎng)，而關(guān)于增殖(分化)則多要采用瓊脂培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)換培養(yǎng)。
以下就生根工程加予敘述。本工程是在只含植物生長激素中的形態(tài)生長激素的上述基礎(chǔ)養(yǎng)基，也就是在只加有萘乙酸或者是β吲哚基乙酸中的任何一種培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。通常的是，增殖用的培養(yǎng)基是采用萘乙酸作為生根的培養(yǎng)基時就添加萘乙酸，如是采用β吲哚基乙酸的話則添加β吲哚基乙酸，在缺減芐腺嘌呤的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
在生根工程里，培養(yǎng)基不含有分化促進(jìn)激素，在新牙形成及增殖工程所用的形態(tài)生長激素和在本工程所用的形態(tài)生長激素之間所特定的一定的關(guān)系是本工程的特征，也就是說在生根工程所用的培養(yǎng)基(稱作生根培養(yǎng)基)，在增殖工程中所用的將養(yǎng)基(稱作增殖培養(yǎng)基)是含有β吲哚基乙酸的場合就可以采用萘乙酸或者是β吲哚基乙酸的任何一種，而增殖培養(yǎng)基是含有萘乙酸的場合。生根培養(yǎng)基就只適合采用萘乙酸，在這種場合下如果使用β吲哚基乙酸其結(jié)果就不能生根而最終枯死。
另外，生根工程的培養(yǎng)不適于在濾紙交聯(lián)上，通常如采用瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行可以獲得很高的良好的生根效率。
幼苗栽培通過上述培養(yǎng)生根后的幼小植物在土盆內(nèi)經(jīng)過中至在石中溫室栽培使植物體充實之后(約1個月)，在土盆內(nèi)移植到培養(yǎng)土中進(jìn)行幼苗調(diào)節(jié)(約1-3個月)。
從農(nóng)學(xué)的觀點來看，如上述在發(fā)牙所用的培養(yǎng)即在土盆內(nèi)采用，蛭不爭取讓根得到充實之后再移到培養(yǎng)土里的方法在其方法適當(dāng)，培育成之后的幼苗照舊在上述土盆里于栽培園圃進(jìn)行適宜育苗之后后就分給栽培農(nóng)廠。
以下就本發(fā)明的實施例對照比較進(jìn)行說明。
(1)無菌取出生長點從掌狀葉大黃Rheum Palmatum系的北海大黃(在北海道大學(xué)藥學(xué)付屬藥用植物園通過營增殖法多化繁衍)的生長期根莖部頭部，遵照沃爾基氏等的方法取出生長點。滅菌是通過70%的乙醇3分鐘，1%的次氯酸8分鐘，水洗3分鐘來進(jìn)行。
(2)新芽形成在下述表1所示的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(在認(rèn)無機鹽組成的Murachige-Skoog培養(yǎng)基加上有機物)加上生長激素(實施例1.2)來進(jìn)行新芽形成。還有作為比較例1-8是在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上其它的生激素所進(jìn)行的試驗。
培養(yǎng)是把表1.2的培養(yǎng)基的PH調(diào)整到5.6，加入插入有濾紙交聯(lián)的三角燒瓶，在120℃加壓滅菌20分鐘，再把由上述方法無菌取出的生長點于22℃栽置在濾紙交聯(lián)上，進(jìn)行16個小時的照明(光度4000Lux)。還有萘乙酸由于在水溶液或者瓊脂培養(yǎng)基中很容易通過光來分解，所以在調(diào)整PH后添加，進(jìn)行加壓滅菌。
表2的結(jié)果表明在實施例1里新芽形成良好而且粗壯，而在實施例2里實施例，相比只有1/10左右的新芽形成，在比較例2里新芽沒有形成而多數(shù)形成花芽開花，在其它的比較例里則沒有發(fā)現(xiàn)新芽的形成。
以上的試驗是在4月上旬-5月上旬重復(fù)3次所獲得同一結(jié)果，還有從4月中旬到10上旬就實施例1的培養(yǎng)基上的新牙做了8次試驗、新牙的形成獲得成功，也就是說歷經(jīng)整個大黃的繁殖期的莖尖培是可能的。
(3)增殖(分化)以在表2的實施例1所得的新牙作為對象，采用如表3.4所示在表1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上芐腺嘌呤、萘乙酸、β吲哚基乙酸的增殖培養(yǎng)未進(jìn)行培養(yǎng)(實施例1-1-1-8、2-1-2-3)以及(比較例1-1-1-5)。培養(yǎng)法除了在0.8%瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行外，其它與實施例1相同。結(jié)果于表3.4表示，此外，采用動力精作為分化促進(jìn)激素時、以及用β吲哚基乙酸、萘乙酸、β吲哚基丁酸、赤霉素2-4-二亞硝基苯氧基乙酸作為形態(tài)生長激素時都未發(fā)現(xiàn)有新牙的形成，而且17日之后全部枯死。
(4)生根分別于表示了的實施例1-1-1-8增殖的新牙，一部分是作為增殖用而繼續(xù)培養(yǎng)，其它一部分是從表3的實施例1-1及1-7的培養(yǎng)基移到采用去除芐腺吟的生根培養(yǎng)基A、B進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)法除了是在0.8%瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行之外，其它與實施例1相同。
各實施例的新牙除了實施例1-1的以外均在3-4星期之間生了根。實施例1-1的新牙有1/10的比例抽苔，同時在上述生根培養(yǎng)基B上三周之內(nèi)沒有生根，3周后移植到新調(diào)整之后的新鮮的生根培養(yǎng)B，2周之后發(fā)現(xiàn)生根。
還有在濾紙交聯(lián)上進(jìn)行生根時已確認(rèn)根毛發(fā)育不好，而且根毛很快就會枯死。
此外，在實施例2-1及2-2培養(yǎng)基上把增殖的新牙群分成一個一個細(xì)小的新牙，添加β吲哚基乙酸4.6×10-5M，在除去芐腺嘌呤的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，3至4周之后生根并顯示出把上部的生長。
發(fā)明效果本發(fā)明如上所述是通過采用含有芐腺哚呤或者是其的核苷和萘乙酸或者是β吲哚基乙酸的培養(yǎng)基，第一次可以進(jìn)行掌狀葉大黃的增殖培養(yǎng)，通過在一定條件下的培養(yǎng)可以進(jìn)行均一而且理想的育苗、種的保存，并能穩(wěn)定地獲得有用的藥效物質(zhì)，因而具有很大的實用意義。
權(quán)利要求
本發(fā)明之掌狀葉大黃的莖尖培養(yǎng)法所具有的特征是采用含有芐腺腺嘌呤或者是其的核苷和萘乙酸或者是β吲哚基乙酸的培養(yǎng)基來進(jìn)行新牙形成及增殖培養(yǎng)，然后在只含萘乙酸或者是β吲哚基乙酸中的任何一種來作為生長激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
專利摘要
本發(fā)明之莖尖培養(yǎng)法所具有的特征是采用含有 芐腺嘌呤或者是其的核苷(芐腺苷)和萘乙酸或者 是β吲哚基乙酸的培養(yǎng)基來進(jìn)行新芽的形成和增 殖，然后在只含有萘乙酸或者β吲哚基乙酸中的任 何一種來作為生長激素培養(yǎng)基上讓其生根。
文檔編號C12N5/00GK85106601SQ85106601
公開日1986年9月3日 申請日期1985年8月31日
發(fā)明者金子光 申請人:和喜伊藤公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan