本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及熒光假單胞菌pf27在抗煙粉虱和防治馬鈴薯病害中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

馬鈴薯是目前種植量較大的農(nóng)作物，由于其生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)、味道好和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，種植范圍較大，逐步被認(rèn)定為繼玉米、小麥、水稻之后的第四大主糧，人們對(duì)馬鈴薯的需求量也越來越大。馬鈴薯生長(zhǎng)過程中容易出現(xiàn)一些病害，如晚疫病、早疫病、瘡痂病和病毒病等多種病害，已經(jīng)嚴(yán)重影響到馬鈴薯的生長(zhǎng)情況，甚至?xí)?dǎo)致馬鈴薯塊莖腐爛等。而農(nóng)業(yè)害蟲煙粉虱俗稱小白蛾，是近年來新發(fā)生的一種蟲害，嚴(yán)重危害番茄、黃瓜、辣椒等蔬菜及棉花等眾多作物。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)病蟲害的防治多從農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治出發(fā)，防治效果不明顯，而且造成了一定程度的環(huán)境污染。

生物防治由于其自身的優(yōu)點(diǎn)開始受到越來越多的重視。假單胞菌通常具有植物促生作用，同時(shí)能夠增強(qiáng)植物對(duì)于病原物和非生物脅迫的抗性，被稱作植物促生細(xì)菌(plantgrowth-promotingbacteria，pgpb)或植物根圍促生細(xì)菌，熒光假單胞菌(psedomonasfluorescens)作為一種重要的生防細(xì)菌，可通過抑制病原菌的發(fā)生、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、產(chǎn)生植物激素和提高植物生長(zhǎng)量來促進(jìn)植株的生長(zhǎng)發(fā)育，是微生物肥料和生防制劑生產(chǎn)中最常見也是最重要的菌種之一。石晶盈等(2011)研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)mgp3發(fā)酵液對(duì)采后番木瓜炭疽病和疫霉病的防治效果分別達(dá)到50％和71％，并且mgp3菌液可以顯著降低除苗期外果實(shí)炭疽菌的潛伏侵染率和炭疽病的病情指數(shù)。韋巧婕等(2013)研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌bacillussp.b與有機(jī)肥發(fā)酵混配使用對(duì)黃瓜枯萎病有顯著的防治作用，發(fā)病率降低了66.7％，病情指數(shù)下降了67％，防治效果達(dá)到80.7％；而單純使用有機(jī)肥發(fā)病率不僅不能降低，而且還有所上升。

因此，開發(fā)新的、更為高效和安全的微生物殺菌劑來控制病害的發(fā)生是提高社會(huì)生產(chǎn)總量的需要，同時(shí)更是農(nóng)業(yè)安全可持續(xù)發(fā)展的需要，符合社會(huì)發(fā)展需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液的新用途。

本發(fā)明提供了熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液在防治馬鈴薯病害中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液在制備防治馬鈴薯病害的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液在抗菌和/或抑菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液在制備抗菌和/或抑菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液在防治農(nóng)業(yè)害蟲中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液在制備防治農(nóng)業(yè)害蟲的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述農(nóng)業(yè)害蟲為煙粉虱bemisiatabaci。

本發(fā)明還提供了熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液在提高植物對(duì)煙粉虱的抵抗能力中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液在制備提高植物對(duì)煙粉虱的抵抗能力的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品；所述產(chǎn)品具有如下1)-4)中任一種功能：

1)防治馬鈴薯病害；

2)抗菌和/或抑菌。

3)防治農(nóng)業(yè)害蟲；所述農(nóng)業(yè)害蟲具體為煙粉虱；

4)提高植物對(duì)煙粉虱的抵抗能力；

本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液；

上述應(yīng)用或產(chǎn)品中，所述熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens為熒光假單胞菌pseudomonasfluorescenspf27。

上述應(yīng)用或產(chǎn)品中，所述馬鈴薯病害為馬鈴薯真菌病害、馬鈴薯卵菌病害和馬鈴薯細(xì)菌病害；

所述馬鈴薯真菌病害具體為馬鈴薯黑痣??；

所述馬鈴薯卵菌病害具體為馬鈴薯晚疫??；

所述馬鈴薯細(xì)菌病害具體為馬鈴薯瘡痂病。

上述應(yīng)用或產(chǎn)品中，所述菌為馬鈴薯黑痣病菌和/或馬鈴薯晚疫病菌和/或馬鈴薯瘡痂病菌。所述馬鈴薯黑痣病菌具體為馬鈴薯黑痣病菌gs-3；所述馬鈴薯晚疫病菌具體為馬鈴薯晚疫病菌88069和t30-4；所述馬鈴薯瘡痂病菌具體為馬鈴薯瘡痂病菌4.1789、4.0076和4.1756。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種防治馬鈴薯病害的方法。

本發(fā)明提供的防治馬鈴薯病害的方法包括用熒光假單胞菌pseudomonasfluorescenspf27或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液處理馬鈴薯幼苗的步驟。

本發(fā)明最后一個(gè)目的是提供一種防治農(nóng)業(yè)害蟲煙粉虱的方法。

本發(fā)明提供的防治農(nóng)業(yè)害蟲煙粉虱的方法包括用熒光假單胞菌pseudomonasfluorescenspf27或其菌劑或其發(fā)酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養(yǎng)液處理植物幼苗的步驟。

上述方法中，所述植物可為十字花科、葫蘆科、豆科、茄科和錦葵科等植物；所述葫蘆科植物具體可為黃瓜，所述茄科植物具體可為番茄、馬鈴薯和煙草；所述錦葵科植物具體可為棉花。

上述應(yīng)用或產(chǎn)品或方法中，

所述pf27菌劑的制備方法如下：將熒光假單胞菌pf27接種于kb培養(yǎng)基中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12-16h，然后4000rpm離心20min，棄上清液，收集菌體沉淀，再用滅菌水將所述菌體沉淀進(jìn)行稀釋，即得到pf27菌劑。

所述pf27發(fā)酵液的制備方法如下：將熒光假單胞菌pf27接種于kb培養(yǎng)液中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12-16h，然后4000rpm離心20min，收集上清液，即得到pf27發(fā)酵液。

所述pf27代謝液的制備方法如下：將pf27發(fā)酵液經(jīng)過0.22μm濾膜過濾(該步驟的目的是除菌)，收集濾液，即得到pf27代謝液。

本發(fā)明的熒光假單胞菌pseudomonasfluorescenspf27的分類命名為熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens，該菌株已于2017年5月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為cgmccno.14105。

本發(fā)明通過對(duì)已有菌株的再次開發(fā)，篩選到對(duì)多寄主危害煙粉虱和馬鈴薯主要病害有防治效果的熒光假單胞菌pf27。通過實(shí)驗(yàn)證明：pf27菌劑處理番茄幼苗后能夠誘導(dǎo)番茄植株對(duì)害蟲煙粉虱的抗性，其抑制效果在產(chǎn)卵和幼蟲發(fā)育方面均達(dá)到約50％，雙向選擇實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示pf27對(duì)煙粉虱具有明顯的驅(qū)蟲效果。在對(duì)馬鈴薯的主要病害的抑菌效果中，pf27發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯黑痣病gs-3的抑菌效果為82.56％，馬鈴薯晚疫病88069抑菌效果為47.33％，同時(shí)pf27代謝液對(duì)馬鈴薯瘡痂病4.0076、4.1576和4.1789平均抑菌效果分別為49.74％、39.39％和45.47％，而大腸桿菌e.coli對(duì)這三個(gè)株系的細(xì)菌病害的平均抑菌率分別只有5.73％、17.37％和11.89％。上述結(jié)果充分說明pf27發(fā)酵液或代謝液對(duì)馬鈴薯主要病害具有廣譜的抑菌效果。本發(fā)明的pf27菌劑或pf27發(fā)酵液或pf27代謝液作為一種生物源農(nóng)藥，具有廣譜、高效和安全的優(yōu)點(diǎn)，不僅避免了化學(xué)農(nóng)藥大量使用帶來的殘留和環(huán)境污染等問題，而且有利于促進(jìn)環(huán)境保護(hù)及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，具有較好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為基于16srdna序列構(gòu)建的pf27系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2為微生物菌劑pf27對(duì)煙粉虱的抵抗能力。a為煙粉虱在番茄幼苗植株上產(chǎn)卵和發(fā)育到四齡幼蟲的示意圖；b為煙粉虱在對(duì)照番茄植株(control)和pf27菌劑處理的番茄植株的雙向選擇示意圖；c為煙粉虱在pf27菌劑處理和對(duì)照(control)的番茄植株上產(chǎn)卵的數(shù)目統(tǒng)計(jì)。d為煙粉虱成蟲對(duì)pf27菌劑處理和對(duì)照(control)的番茄植株上雙向選擇的比率的統(tǒng)計(jì)。e為煙粉虱在pf27菌劑處理和對(duì)照(control)的番茄植株單個(gè)葉片上發(fā)育到四齡幼蟲的數(shù)目統(tǒng)計(jì)。f為自然條件下煙粉虱成蟲在pf27菌劑處理和對(duì)照(control)的馬鈴薯幼苗上的生長(zhǎng)狀態(tài)。注：*表示在0.05水平上差異顯著，**表示在0.01水平上差異顯著(同下)。

圖3為馬鈴薯第4，5莖葉接種馬鈴薯黑痣病gs-3的發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)，照片拍攝接種6天后。a為pf27菌劑處理組和對(duì)照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯黑痣病gs-3孢子懸浮液后的發(fā)病情況，其中，上圖為對(duì)照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯黑痣病gs-3孢子懸浮液的發(fā)病情況；下圖為pf27菌劑處理組馬鈴薯葉片接種gs-3孢子懸浮液發(fā)病情況。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。b為pf27菌劑處理組和對(duì)照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯黑痣病gs-3發(fā)病的病斑面積統(tǒng)計(jì)，n＝12。

圖4為馬鈴薯第4，5莖葉接種馬鈴薯晚疫病88069和t30-4的發(fā)病情況，照片拍攝接種6天后。a為馬鈴薯第4，5莖葉接種馬鈴薯晚疫病t30-4的發(fā)病情況，其中，上圖為pf27菌劑處理組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病t30-4孢子懸浮液的發(fā)病情況；下圖為對(duì)照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病t30-4孢子懸浮液發(fā)病情況，每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。b為pf27菌劑處理組和對(duì)照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病t30-4發(fā)病的病斑面積數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，n＝12。c為馬鈴薯第4，5莖葉接種馬鈴薯晚疫病88069的發(fā)病情況，其中，上圖為pf27菌劑處理組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病88069孢子懸浮液的發(fā)病情況；下圖為對(duì)照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病88069孢子懸浮液發(fā)病情況，每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。d為pf27菌劑處理組和對(duì)照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病88069發(fā)病的病斑面積，n＝12。

圖5為微生物pf27發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯黑痣病gs-3、馬鈴薯晚疫病t30-4和88069的抑菌示意圖。

圖6為pf27菌劑對(duì)馬鈴薯黑痣病gs-3、馬鈴薯晚疫病88069和t30-4的抑菌實(shí)驗(yàn)。a為pf27菌劑處理組和對(duì)照組平板接種馬鈴薯晚疫病88069和t30-4菌斑的生長(zhǎng)情況，其中，左圖為pf27菌劑處理組和對(duì)照組平板接種馬鈴薯晚疫病88069菌斑的生長(zhǎng)情況，右圖為pf27菌劑處理組和對(duì)照組平板接種馬鈴薯晚疫病t30-4菌斑生長(zhǎng)情況。b為pf27菌劑處理組和對(duì)照組平板接種馬鈴薯黑痣病gs-3菌斑的生長(zhǎng)情況。c為pf27菌劑對(duì)馬鈴薯晚疫病88069、t30-4和馬鈴薯黑痣病gs-3的抑制率的柱形圖統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖7為pf27代謝液對(duì)馬鈴薯瘡痂病4.1789、4.0076和4.1756的抑菌實(shí)驗(yàn)。a為接種馬鈴薯瘡痂病4.1789、4.0076和4.1756的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組培養(yǎng)基中的菌斑生長(zhǎng)情況。b為接種馬鈴薯瘡痂病4.1789、4.0076和4.1756的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組培養(yǎng)基中的抑制率的柱形圖統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

保藏說明

菌種名稱：熒光假單胞菌

拉丁名：pseudomonasfluorescens

菌株編號(hào)：pf27

保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：cgmcc

地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)

保藏日期：2017年5月8日

保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：cgmccno.14105

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中所用培養(yǎng)基配方如下(液體培養(yǎng)基僅將固體培養(yǎng)基中的瓊脂粉去除，且保持其他組分和濃度不變)：

mea培養(yǎng)基(固體)：maltextract30g，mycologicalpeptone5g，瓊脂粉15g，ph5.4；

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(固體)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂粉12g，水1000ml，ph7.2-7.4；

lb培養(yǎng)基(固體)：氯化鈉10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂粉12g，水1000ml，ph7.0；

kb培養(yǎng)基(固體)：蛋白胨20g，k2hpo41.5g，甘油8ml，mgso40.74g，h2o補(bǔ)足到1l，ph7.0；固體培養(yǎng)基加瓊脂粉12g。

pda培養(yǎng)基(固體)：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水1000ml。

10％v8培養(yǎng)基(固體)：v8汁上清液(將超市內(nèi)購(gòu)買的v8汁4000rpm離心10min，收集上清液)100ml，caco31g，瓊脂粉15g，水1000ml。

下述實(shí)施例中的馬鈴薯黑痣病菌gs-3記載于如下文獻(xiàn)：趙偉全等，2006，中國(guó)馬鈴薯瘡痂病菌的鑒定，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的馬鈴薯晚疫病菌t30-4記載于如下文獻(xiàn)：sansomee等，disploidyandchromosomalstructuralhybridityinphytophthorainfestans.nature)；馬鈴薯晚疫病菌88069記載于如下文獻(xiàn)：劉衛(wèi)，馬鈴薯晚疫病抗性相關(guān)基因stbl-slgpk的克隆和功能分析；公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的馬鈴薯瘡痂病菌4.0076購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種目錄編號(hào)為accc40076；馬鈴薯瘡痂病菌4.1756和4.1789購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)分別為cgmccno.4.1756和cgmccno.4.1789。

實(shí)施例1、pf27菌株的分離與鑒定

一、pf27菌株的分離

pf27分離自云南省普洱市疣粒野生稻區(qū)根際土壤(北緯22^。33’56”，100^。35’12”，海拔737米)。具體分離方法如下：將采自疣粒野生稻區(qū)的根際土壤，挑取根系，刮取根際土，稱量5g，無菌條件下放進(jìn)已準(zhǔn)備好的滅菌三角瓶中，用滅菌水梯度稀釋到10^-6倍，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將梯度稀釋的土壤樣品取200μl分別涂到mea培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基和kb培養(yǎng)基平板上，分別在28℃，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果顯示稀釋為10^-5、10^-6倍時(shí)平板上基本上沒有菌落長(zhǎng)出，而稀釋為10^-4倍時(shí)，平板上能長(zhǎng)出單一的菌落，并挑取在kb培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單一的菌落，將其命名為pf27菌株，然后在kb液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，做進(jìn)一步的菌株鑒定。

二、pf27菌株的鑒定

1、pf27菌株的形態(tài)鑒定

pf27菌株在kb培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h～48h后可形成橙色菌落，菌落狀態(tài)呈圓形，表面光滑有凸起邊緣整齊，較粘稠，易挑起。

2、pf27菌株的分子鑒定

提取pf27菌株的dna，采用通用引物eubac27f/eubac1492r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到含有pf27菌株16srdna保守區(qū)的pcr產(chǎn)物。引物序列如下：

eubac27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；

eubac1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’。

將pcr產(chǎn)物經(jīng)ta克隆連接到peasy-t3(購(gòu)買自北京全式金生物有限公司)，以通用引物在英濰捷基公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明：pcr產(chǎn)物的核苷酸序列如序列1所示。將測(cè)序所得序列與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)后，通過mega5.1軟件對(duì)pf27和其他代表22種不同假單胞菌種的熒光假單胞模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

綜合上述鑒定結(jié)果，確定pf27菌株的分類命名為熒光假單胞菌pseudomonasfluorescens，該菌株已于2017年5月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為cgmccno.14105。

實(shí)施例2、微生物pf27菌劑、微生物pf27發(fā)酵液和微生物pf27代謝液的制備

1、微生物pf27菌劑的制備

將實(shí)施例1中獲得的熒光假單胞菌pf27接種于kb培養(yǎng)基中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12-16h，然后4000rpm離心20min，棄上清液，收集菌體沉淀，再用滅菌水將菌體沉淀進(jìn)行稀釋，制成微生物pf27菌劑(菌劑pf27)，微生物pf27菌劑成品中pf27活菌總濃度為1×10⁹-1×10¹⁰cfu/ml。

2、微生物pf27發(fā)酵液的制備

將實(shí)施例1中獲得的熒光假單胞菌pf27接種于kb培養(yǎng)液中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12-16h，然后4000rpm離心20min，收集上清液，即為微生物pf27發(fā)酵液，微生物pf27發(fā)酵液成品中pf27活菌總濃度為1×10²-1×10³cfu/ml。

3、微生物pf27代謝液的制備

將步驟2中微生物pf27發(fā)酵液經(jīng)過0.22μm濾膜過濾(該步驟的目的是除菌)，收集濾液，即為微生物pf27代謝液。

實(shí)施例3、微生物pf27菌劑對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲煙粉虱的抵抗能力

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、番茄植株

(1)將中雜9號(hào)番茄種子(中蔬種業(yè)科技(北京)有限公司生產(chǎn))用3％naclo溶液消毒10min后，用ddh2o清洗6次，得到消毒后種子。然后將消毒后種子均勻鋪在滅菌的蛭石泥炭土基質(zhì)(蛭石和泥炭土按照1:1的比例混勻，121℃高壓滅菌20min)中，在26℃，光照：黑暗(12h:12h)條件下培養(yǎng)種子萌發(fā)，待種子萌發(fā)生長(zhǎng)到兩片真葉時(shí)，分別移栽到均勻添加pf27菌劑的蛭石泥炭土基質(zhì)(每kg蛭石泥炭土基質(zhì)添加50mlod值為1的pf27菌劑，pf27菌劑使用終濃度為1×10⁵cfu/ml)中和對(duì)照(以不添加任何菌劑作為對(duì)照，control)的營(yíng)養(yǎng)穴中。番茄苗移栽到育苗穴盤中(穴盤規(guī)格：上口直徑9厘米，下口直徑6厘米，高度8厘米)，放置在溫室中生長(zhǎng)(生長(zhǎng)條件：光照時(shí)間12h，溫度26℃，相對(duì)濕度50％)。

(2)將生長(zhǎng)到5周左右的番茄植株的單個(gè)葉片放置在盎司的塑料杯中(底、高、口徑大小為32mm×34mm×40mm，將塑料杯一側(cè)開直徑為5mm左右的開口，用于將煙粉虱置于杯中；另一側(cè)從口徑位置處開2mm左右的開口，用于放置葉柄)，然后將剛孵化的煙粉虱成蟲(3頭雌成蟲和3頭雄成蟲)從開口處接種到單片番茄葉子，再用透氣的醫(yī)用膠帶將其開口封住。10天后統(tǒng)計(jì)每個(gè)番茄葉片上的產(chǎn)卵量。每個(gè)處理8個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

(3)將生長(zhǎng)到5周左右的番茄植株的單個(gè)葉片放置在盎司的塑料杯中，將16頭雌成蟲接種到單個(gè)番茄葉片上，經(jīng)過2天的產(chǎn)卵時(shí)間，將全部的成蟲移除，22天后統(tǒng)計(jì)每個(gè)番茄葉片上發(fā)育到4齡幼蟲的數(shù)量。每個(gè)處理8個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

(4)將生長(zhǎng)到5周左右的pf27菌劑處理組和對(duì)照組的番茄幼苗分別放置在120目的籠子(40cm×40mm×40mm)的兩側(cè)，然后將煙粉虱成蟲在冰上冷凍2分鐘，每次數(shù)100頭煙粉虱成蟲放置兩株番茄之間，15分鐘后統(tǒng)計(jì)兩株番茄上的煙粉虱的數(shù)目，計(jì)算煙粉虱在兩株番茄上的選擇率。選擇率的計(jì)算方法：統(tǒng)計(jì)100頭煙粉虱中分別在pf27處理組和對(duì)照組植株上的煙粉虱數(shù)目，并且相加得選擇的煙粉虱數(shù)目總和，計(jì)算pf27處理組和對(duì)照組植株上煙粉虱所占選擇的總煙粉虱百分?jǐn)?shù)。每個(gè)處理6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2、馬鈴薯植株

將購(gòu)買自北京首航超市內(nèi)的土豆放置在潮濕黑暗的環(huán)境中，經(jīng)過一周后，挑選出芽一致的健康土豆的芽，用70％的酒精滅菌消毒刀片后將其切下。然后將幼芽分別移栽到均勻添加pf27菌劑的滅菌的蛭石泥炭土基質(zhì)(每kg蛭石泥炭土基質(zhì)添加50mlod值為1的pf27菌劑，pf27菌劑使用終濃度為1×10⁵cfu/ml)和對(duì)照(以不添加任何菌劑作為對(duì)照，control)的營(yíng)養(yǎng)穴中，并置于塑料花盆(規(guī)格：上口直徑為14厘米，下口直徑為9.5厘米，高度為12.5厘米)內(nèi)培養(yǎng)，表面覆蓋一層保鮮膜保濕，待其長(zhǎng)出子葉后將保鮮膜去掉，放置自然條件下生長(zhǎng)，得到馬鈴薯幼苗。

(2)自然條件下觀察煙粉虱成蟲在pf27菌劑處理下和對(duì)照的馬鈴薯幼苗上的生長(zhǎng)狀態(tài)及數(shù)量。每個(gè)處理6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

二、抗蟲效果統(tǒng)計(jì)

在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)煙粉虱在選擇的葉片上的產(chǎn)卵量、發(fā)育到4齡幼蟲的數(shù)量及煙粉虱在pf27菌劑處理組和對(duì)照組的番茄植株的選擇率。

結(jié)果如圖2所示。和對(duì)照組相比，微生物pf27菌劑處理組的番茄上煙粉虱成蟲產(chǎn)卵量和發(fā)育到4齡幼蟲的數(shù)量顯著降低，產(chǎn)卵量減少約50.11％，發(fā)育到4齡幼蟲的蟲量約減少33.51％。煙粉虱在pf27菌劑處理組和對(duì)照組的番茄植株的雙向選擇實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：pf27菌劑處理組的番茄植株對(duì)煙粉虱具有明顯的驅(qū)蟲作用，pf27菌劑處理組和對(duì)照組的選擇率分別是35.28％和64.72％，驅(qū)蟲效果為29.44％。同時(shí)在自然狀態(tài)下觀察pf27菌劑處理組的馬鈴薯幼苗植株對(duì)煙粉虱的影響，發(fā)現(xiàn)微生物pf27菌劑處理的馬鈴薯幼苗上的煙粉虱數(shù)量顯著少于對(duì)照組的煙粉虱數(shù)量。

實(shí)施例4、微生物pf27菌劑對(duì)馬鈴薯黑痣病gs-3的致病力的影響

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、馬鈴薯幼苗的種植

將購(gòu)買自北京首航超市內(nèi)的土豆放置在潮濕黑暗的環(huán)境中，經(jīng)過一周后，挑選出芽一致的健康土豆的芽，用70％的酒精滅菌消毒刀片后將其切下。然后將幼芽分別移栽到均勻添加菌劑pf27的滅菌的蛭石泥炭土基質(zhì)(每kg蛭石泥炭土基質(zhì)添加50mlod值為1的pf27菌劑，pf27菌劑使用終濃度為1×10⁵cfu/ml)和對(duì)照(以不添加任何菌劑作為對(duì)照，control)的營(yíng)養(yǎng)穴中，并置于塑料花盆(規(guī)格：上口直徑為14厘米，下口直徑為9.5厘米，高度為12.5厘米)內(nèi)培養(yǎng)，表面覆蓋一層保鮮膜保濕，待其長(zhǎng)出子葉后將保鮮膜去掉，放置自然條件下生長(zhǎng)，得到馬鈴薯幼苗。

2、菌液配置

將馬鈴薯黑痣病菌gs-3接種到pda培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到能夠在顯微鏡下觀察到成熟孢子囊的馬鈴薯黑痣病gs-3，利用含有0.01％吐溫20的蒸餾水沖洗培養(yǎng)皿，收集孢子，制成孢子濃度為1.0×10⁵cfu/ml的gs-3孢子懸浮液，然后在室溫下靜置2～3小時(shí)后用于接種。

3、人工接種及病情調(diào)查

接種時(shí)取4和5葉位的葉頂端10片單葉，將葉柄插在濃度為1％的固體瓊脂培養(yǎng)基上平板內(nèi)，每個(gè)平板內(nèi)放置兩片單葉，加2ml滅菌的蒸餾水到平板上以保濕，每個(gè)單葉片中心滴20μlgs-3孢子懸浮液在葉片的上表面，最后蓋上培養(yǎng)皿蓋，用透氣的醫(yī)用膠帶封住，放置在溫度為20℃，光照：黑暗(12h:12h)，濕度為60％的條件下培養(yǎng)。同時(shí)以不滴加任何菌液的0.01％吐溫20作為對(duì)照。處理第6天調(diào)查病斑面積，病斑面積計(jì)算公式：s＝(病斑長(zhǎng)度×病斑寬度)×π/4。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

二、抗病效果統(tǒng)計(jì)

結(jié)果如圖3所示。和對(duì)照組相比，微生物pf27菌劑處理組的馬鈴薯黑痣病gs-3發(fā)病降低，病斑面積平均顯著性降低約46.61％。說明微生物pf27菌劑對(duì)馬鈴薯黑痣病gs-3有顯著的抗病效果。

實(shí)施例5、微生物pf27菌劑對(duì)馬鈴薯晚疫病t30-4和88069兩種菌致病力的影響

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、馬鈴薯幼苗的種植

同實(shí)施例4步驟一中的1。

2、菌液配置

將馬鈴薯晚疫病菌t30-4和88069分別接種到10％v8固體培養(yǎng)基上，20℃黑暗環(huán)境培養(yǎng)2～3天后切取大小均勻的菌絲塊，置于20ml的10％v8液體培養(yǎng)基中，于20℃黑暗靜置培養(yǎng)2～3天后將菌絲叢移入無菌的培養(yǎng)皿中，加入適量的滅菌純水，于26℃光照靜置12h左右，即可產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子囊；利用含有0.01％吐溫20的蒸餾水沖洗培養(yǎng)皿，收集孢子，制成孢子濃度為1.0×10⁵cfu/ml的t30-4懸浮液和88069懸浮液，然后在室溫下靜置2～3小時(shí)后用于接種。

3、人工接種及病情調(diào)查

人工接種及病情調(diào)查同實(shí)施例4步驟一中的3。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

二、抗病效果統(tǒng)計(jì)

結(jié)果如圖4所示。和對(duì)照組相比，微生物pf27菌劑處理組的馬鈴薯葉片上接種馬鈴薯晚疫病t30-4和88069病原菌后，病斑面積顯著性降低，接種t30-4的病斑面積減少了53.85％，接種88069的病斑面積則減少了79.80％。說明微生物pf27菌劑對(duì)馬鈴薯晚疫病t30-4和88069有顯著的抗病效果。

實(shí)施例6、微生物pf27發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯黑痣病gs-3、馬鈴薯晚疫病t30-4和88069的抑菌率的影響

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、將pf27發(fā)酵液按照1:50的比例加入到已經(jīng)融化并冷卻至50℃左右的pda培養(yǎng)基中，充分混勻后鋪制平板，得到含有pf27菌劑的pda培養(yǎng)基。同時(shí)設(shè)置不加任何菌劑的培養(yǎng)基為對(duì)照。

將pf27發(fā)酵液按照1:50的比例加入到已經(jīng)融化并冷卻至50℃左右的10％v8培養(yǎng)基中，充分混勻后鋪制平板，得到含有pf27菌劑的v8培養(yǎng)基。同時(shí)設(shè)置不加任何菌劑的培養(yǎng)基為對(duì)照。

2、抑菌實(shí)驗(yàn)

將pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天的馬鈴薯黑痣病gs-3病原真菌菌落邊緣打取直徑為6mm、生長(zhǎng)均勻的菌碟，菌絲面向下，接種于含有pf27菌劑的pda培養(yǎng)基的中央，于20℃恒溫培養(yǎng)。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

分別將v8培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天的馬鈴薯晚疫病t30-4和88069病原真菌菌落邊緣打取直徑為6mm、生長(zhǎng)均勻的菌碟，菌絲面向下，接種于含有pf27菌劑的v8培養(yǎng)基的中央，于20℃恒溫培養(yǎng)。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

接種后逐日觀察，并用十字交叉方法測(cè)量各供試病原真菌在培養(yǎng)基平板上的直徑，并按照下列公式計(jì)算抑菌率：抑菌率(％)＝(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100％，菌餅直徑為6mm。抑菌示意圖如圖5所示。

二、抑菌效果統(tǒng)計(jì)

結(jié)果如表1和圖7所示。在對(duì)馬鈴薯的主要病害馬鈴薯黑痣病gs-3、馬鈴薯晚疫病88069和t30-4的抑菌效果中，pf27菌劑對(duì)馬鈴薯黑痣病gs-3的抑菌率為82.56％，馬鈴薯晚疫病88069的抑菌率為47.33％，馬鈴薯晚疫病t30-4的抑菌率約為10％。

表1、pf27對(duì)馬鈴薯黑痣病、馬鈴薯晚疫病和馬鈴薯瘡痂病的抑菌率統(tǒng)計(jì)

實(shí)施例7、微生物pf27代謝液對(duì)馬鈴薯瘡痂病4.0076、4.1756和4.1789的抑菌率的影響

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、將pf27代謝液按照1:50的比例加入到冷卻至40℃左右的lb固體培養(yǎng)基中，混勻后在滅菌的超凈臺(tái)中制備固體培養(yǎng)平板，待平板凝固后在平板中央用打孔器打一個(gè)直徑為6mm左右的孔，得到實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基。

將大腸桿菌e.colidh5α在lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)12-16h，然后4000rpm離心20min，收集上清液，并將其用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，收集濾液，得到dh5α代謝液；將dh5α代謝液按照1:50的比例加入到冷卻至40℃左右的lb固體培養(yǎng)基中，混勻后在滅菌的超凈臺(tái)中制備固體培養(yǎng)平板，待平板凝固后在平板中央用打孔器打一個(gè)直徑為6mm左右的孔，得到對(duì)照組培養(yǎng)基。

同時(shí)在lb固體培養(yǎng)基中央用打孔器打一個(gè)直徑為6mm左右的孔，得到空白組培養(yǎng)基。

2、將馬鈴薯瘡痂病病菌4.0076、4.1756和4.1789分別接種到lb液體培養(yǎng)基中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12-16h后，分別獲得馬鈴薯瘡痂病病原菌液4.0076，4.1756和4.1789。取20μl的馬鈴薯瘡痂病病原菌液4.0076，4.1756和4.1789分別加入到步驟1制備的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基、對(duì)照組培養(yǎng)基和空白組培養(yǎng)基的6mm孔內(nèi)，逐日觀察，并統(tǒng)計(jì)抑菌率。抑菌率(％)＝(空白組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(空白組菌落直徑-菌餅直徑)×100％。處理組分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。菌餅直徑為6mm。

二、抑菌效果統(tǒng)計(jì)

結(jié)果如表1和圖7所示。pf27代謝液對(duì)馬鈴薯的主要病害馬鈴薯瘡痂病的4.0076、4.1576和4.1789平均抑菌率分別達(dá)到了49.74％、39.39％和45.47％，而大腸桿菌e.colidh5α對(duì)馬鈴薯瘡痂病的4.0076、4.1576和4.1789的平均抑菌率分別只有5.73％、17.37％和11.89％。說明pf27代謝液對(duì)馬鈴薯三個(gè)細(xì)菌病害具有很好的抑菌效果。

綜上所述，pf27菌劑或pf27發(fā)酵液或pf27代謝液對(duì)馬鈴薯主要病害具有廣譜的抑菌效果。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所

<120>熒光假單胞菌pf27在抗煙粉虱和防治馬鈴薯病害中的應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>1508bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagc60

ggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatct120

gcctggtagtgggggataacgttcggaaacgaacgctaataccgcatacgtcctacggga180

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gcgatccc1508