本發(fā)明屬于豬繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一種提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：近年來，由于人工授精技術(shù)具有提高公豬利用率，提高母豬的受胎率；克服公母豬體格上的差別；防止傳染病的傳播以及不受時(shí)間和空間的限制等優(yōu)點(diǎn)，使人工授精技術(shù)越來越多的被用于動(dòng)物生產(chǎn)。在生豬養(yǎng)殖中，人工授精的比率已經(jīng)超過了90％。正是由于此項(xiàng)技術(shù)的快速發(fā)展，使得人們對(duì)公豬精液品質(zhì)尤其是在稀釋后經(jīng)過運(yùn)輸和保存后的精液品質(zhì)高度關(guān)注，精液品質(zhì)的好壞直接影響母豬情期受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，進(jìn)而決定豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，如何提高精子在運(yùn)輸和保存過程中的精子活力成為了當(dāng)前人工授精技術(shù)推廣和應(yīng)用的重要難題。豬的精液保存有常溫保存和低溫保存兩種方式。稀釋劑配方組成對(duì)精子保存后的精液質(zhì)量十分重要，除了培養(yǎng)液的ph、滲透壓要對(duì)精子的存活有利外，更需要為精子提供生存和活動(dòng)的能量，以保證精子在體外保存期間的活力以及人工授精時(shí)精子能快速到達(dá)輸卵管，并與卵子完成受精過程?？茖W(xué)合理的稀釋劑不僅為精細(xì)胞的創(chuàng)造一個(gè)良好的生存環(huán)境，也要為精子生存提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以延長(zhǎng)精液保存時(shí)間，增加運(yùn)輸距離和使用時(shí)間，進(jìn)而大大的改善配種效率，有助于優(yōu)質(zhì)的精液的推廣和應(yīng)用。然而目前豬精液稀釋液配方中主要關(guān)注在一些簡(jiǎn)單的離子平衡，對(duì)于精子生存、代謝和維持精子活力的許多營(yíng)養(yǎng)素供給欠缺，部分營(yíng)養(yǎng)素使用水平和方法不合理，導(dǎo)致精子在常溫保存或冷凍保存及運(yùn)輸過程中活力下降，授精率較低等。精子的能量代謝途徑包括己糖有氧氧化及無氧酵解，有氧氧化是在有氧情況下通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量的過程。糖酵解是指精子在有氧或無氧情況下，通過分解精漿中的果糖、葡萄糖、甘露糖等產(chǎn)生丙酮酸或乳酸的過程。除此以外，雙糖還能能夠在生物活性細(xì)胞脫水的情況下在細(xì)胞膜外面形成一層保護(hù)膜，從而在冷凍過程中發(fā)揮保護(hù)活性細(xì)胞的作用。糖與質(zhì)膜磷脂之間的這種氫鍵結(jié)構(gòu)降低了膜磷脂的相變溫度，減少了冷凍引起的膜融合、破裂的發(fā)生，起到膜穩(wěn)定劑的作用。氨基酸作為精子和精漿的重要組成部分，占干物質(zhì)的一半以上。精子和精漿中的氨基酸種類十分豐富，水平也各自不同，對(duì)于精子的活力、運(yùn)動(dòng)能力及受精能力的維持均具有重要意義。成年公豬所需要的氨基酸包括必需要氨基酸、非必需要氨基酸和功能性氨基酸，這些氨基酸在公豬精液保存中都發(fā)揮著重要作用。多年來，本團(tuán)隊(duì)一直致力于提高公豬精子體外常溫和低溫保存的精子質(zhì)量的研究，經(jīng)過一系統(tǒng)的篩選、推廣和應(yīng)用，最終形成了一套有利于提高精子體外保存活力和壽命的稀釋劑，對(duì)促進(jìn)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑及其制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑，每1000ml稀釋劑包括以下組分：碳水化合物5-12g，細(xì)胞膜穩(wěn)定劑3-6g，蛋氨酸1-4g,亮氨酸1-7g，異亮氨酸0.1-0.7g，纈氨酸3-7g，蘇氨酸4-8g，色氨酸2-6g，組氨酸2-5g，苯丙氨酸0.5-1.2g，丙氨酸為5-11g，l-型谷胺酰胺2-4g，谷氨酸1-5g，甘氨酸2-6g，l-脯氨酸2-8g，瓜氨酸1-2.5g，鳥氨酸0.15-0.3g，精胺0.3-0.9g，亞精胺0.1-0.3g，d-型天門冬氨酸0.5-1.5g，牛磺酸0.5-1.5g，半胱氨酸0.1-0.5g，氨乙基亞磺酸0.3-0.5g，tris2.5-6g，甘油2-6g，檸檬酸1.2-2g，青霉素80-1,00萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.15-0.4g，余量為雙蒸水，ph為6.9-7.2，滲透壓為300mosm。進(jìn)一步地，每g碳水化合物中含有重量比為2-1.5：1:1-0.5的果糖、葡萄糖和乳糖。進(jìn)一步地，每g細(xì)胞膜穩(wěn)定劑含有重量比為1：1.5-2的大豆卵磷脂和卵黃卵磷脂。本發(fā)明還公開了一種提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑的制備方法，包括以下步驟：步驟1、按照以下配比進(jìn)行稱量：碳水化合物5-12g，細(xì)胞膜穩(wěn)定劑4.5-6g，蛋氨酸1-4g，亮氨酸1-7g，異亮氨酸0.1-0.7g，纈氨酸3-7g，蘇氨酸4-8g，色氨酸2-6g，組氨酸2-5g，苯丙氨酸0.5-1.2g，丙氨酸為5-11g，l-型谷胺酰胺2-4g，谷氨酸1-5g，甘氨酸2-6g,l-脯氨酸2-8g，瓜氨酸1-2.5g，鳥氨酸0.15-0.3g，精胺0.3-0.9g,亞精胺0.1-0.3g，d-型天門冬氨酸0.5-1.5g，牛磺酸0.5-1.5g，半胱氨酸0.1-0.5g，氨乙基亞磺酸0.3-0.5g，tris2.5-6g,甘油2-6g，檸檬酸1.2-2g，青霉素80-1,00萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.15-0.4g，余量為雙蒸水，以上體積總量為1000ml；步驟2、將稱量好的碳水化合物、蛋氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，蘇氨酸，色氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，l-型谷胺酰胺，谷氨酸，甘氨酸,l-脯氨酸，瓜氨酸,鳥氨酸，精胺，亞精胺，d-型天門冬氨酸，?；撬?，半胱氨酸，氨乙基亞磺酸，tris加入到500ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液，攪拌均勻；步驟3、將步驟2制備得到混合液中依次加入稱量好的細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，甘油，檸檬酸，青霉素，乙二胺四乙酸二鈉，攪拌均勻，加入雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph為6.9-7.2，滲透壓為290mosm，制備得到提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑。進(jìn)一步地，每g碳水化合物中含有重量比為2-1.5：1:1-0.5的果糖、葡萄糖和乳糖。進(jìn)一步地，每g細(xì)胞膜穩(wěn)定劑含有重量比為1：1.5-2的大豆卵磷脂和卵黃卵磷脂。進(jìn)一步地，該提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑在16-18℃保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：1)本發(fā)明對(duì)精子活力、頂體完整性、精子畸形率和質(zhì)膜完整性均有不同程度的提高，效果十分顯著。2)采用本稀釋劑的公豬精液可以提高母豬的分娩率和產(chǎn)活仔數(shù)量，改善母豬的繁殖成績(jī)。當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。具體實(shí)施方式以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。本發(fā)明提供一種提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑，每1000ml稀釋劑包括以下組分：碳水化合物5-12g，細(xì)胞膜穩(wěn)定劑4.5-6g，蛋氨酸1-4g,亮氨酸1-7g,異亮氨酸0.1-0.7g，纈氨酸3-7g，蘇氨酸4-8g，色氨酸2-6g，組氨酸2-5g，苯丙氨酸0.5-1.2g，丙氨酸5-11g，l-型谷胺酰胺2-4g，谷氨酸1-5g，甘氨酸2-6g,l-脯氨酸2-8g，瓜氨酸1-2.5g,鳥氨酸0.15-0.3g，精胺0.3-0.9g,亞精胺0.1-0.3g，d-型天門冬氨酸0.5-1.5g，牛磺酸0.5-1.5g，半胱氨酸0.1-0.5g，氨乙基亞磺酸0.3-0.5g，tris2.5-6g,甘油2-6g，檸檬酸1.2-2g，青霉素80-1,00萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.15-0.4g，余量為雙蒸水，ph為6.9-7.2，滲透壓為300mosm。其中，每g碳水化合物中含有重量比為2-1.5：1:1-0.5的果糖、葡萄糖和乳糖。每g細(xì)胞膜穩(wěn)定劑含有重量比為1：1.5-2的大豆卵磷脂和卵黃卵磷脂。其中，碳水化合物和氨基酸的作為精子運(yùn)動(dòng)及活力提供重要的能量來源，如果添加量過少，則導(dǎo)致精子能量來源不足，降低精子活力；而添加量過多則導(dǎo)致滲透壓增加，影響精子質(zhì)膜完整性。細(xì)胞膜穩(wěn)定劑和甘油的添加對(duì)于維持精子細(xì)胞膜完整性十分重要，添加量過少導(dǎo)致精子細(xì)胞完整性下降，頂體受損，配種后母豬的妊娠率下降，而添加量過多時(shí)將對(duì)精子產(chǎn)生毒性，直接損傷和破壞精子活力?？股氐奶砑涌蓽p少精子微生物感染率，如果添加量不足導(dǎo)致微生物感染增加，通過精子傳播的疾病風(fēng)險(xiǎn)增大。乙二胺四乙酸二鈉和檸檬酸等是維持精子離子平衡的重要組成部分，過多或過少均影響精子胞內(nèi)滲透壓和畸形率。本發(fā)明還提供一種提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑的制備方法，包括以下步驟：步驟1、按照以下配比進(jìn)行稱量：碳水化合物5-12g，細(xì)胞膜穩(wěn)定劑4.5-6g，蛋氨酸1-4g,亮氨酸1-7g,異亮氨酸0.1-0.7g，纈氨酸3-7g，蘇氨酸4-8g，色氨酸2-6g，組氨酸2-5g，苯丙氨酸0.5-1.2g，丙氨酸5-11g，l-型谷胺酰胺2-4g，谷氨酸1-5g，甘氨酸2-6g，l-脯氨酸2-8g，瓜氨酸1-2.5g,鳥氨酸0.15-0.3g，精胺0.3-0.9g,亞精胺0.1-0.3g，d-型天門冬氨酸0.5-1.5g，牛磺酸0.5-1.5g，半胱氨酸0.1-0.5g，氨乙基亞磺酸0.3-0.5g，tris2.5-6g,甘油2-6g，檸檬酸1.2-2g，青霉素80-1,00萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.15-0.4g，余量為雙蒸水，以上體積總量為1000ml；步驟2、將稱量好的碳水化合物、蛋氨酸,亮氨酸,異亮氨酸，纈氨酸，蘇氨酸，色氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸為，l-型谷胺酰胺，谷氨酸，甘氨酸,l-脯氨酸，瓜氨酸,鳥氨酸，精胺，亞精胺，d-型天門冬氨酸，?；撬幔腚装彼?，氨乙基亞磺酸，tris加入到500ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液，攪拌均勻；步驟3、將步驟2制備得到混合液中依次加入稱量好的細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，甘油，檸檬酸，青霉素，乙二胺四乙酸二鈉，攪拌均勻，加入雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph為6.9-7.2，滲透壓為290mosm，制備得到提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑。其中，每g碳水化合物中含有重量比為2-1.5：1:1-0.5的果糖、葡萄糖和乳糖。每g細(xì)胞膜穩(wěn)定劑含有重量比為1：1.5-2的大豆卵磷脂和卵黃卵磷脂。該提高精子體外保存的營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑在16-18℃保存。在本方法中，精子所需要的必需氨基酸、非必需氨基酸和功能性氨基酸的添加水平以及碳水化合物和細(xì)胞膜穩(wěn)定劑的組成比例十分重要，這是在本課題組長(zhǎng)期研究和實(shí)踐中所總結(jié)出來的重要?jiǎng)?chuàng)新。過多或過低都將影響精子質(zhì)膜完整性，頂體完整性和精子活力，從而導(dǎo)致人工授精后母豬妊娠率下降。實(shí)施例1將3g果糖，1.5g葡萄糖，1.5g乳糖，蛋氨酸1.5g,亮氨酸2g,異亮氨酸為0.1g，纈氨酸為3.5g，蘇氨酸為4g，色氨酸為2g，組氨酸為2g，苯丙氨酸為0.5g，丙氨酸5g，l-型谷胺酰胺2g，谷氨酸2g，甘氨酸2g,l-脯氨酸2g，瓜氨酸2g,鳥氨酸0.2g，精胺0.3g，亞精胺0.1g，d-型天門冬氨酸0.5g，?；撬?.5g，半胱氨酸0.1g，氨乙基亞磺酸0.3g，tris3g,加入500ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液，攪拌均勻。然后再依次加入大豆卵磷脂含量1g，卵黃卵磷脂2g，甘油2g，檸檬酸1.5g，青霉素80萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.2g，攪拌均勻，加入雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph為6.9-7.2，滲透壓為290mosm。16-18℃保存即可。實(shí)施例2將2g果糖，2g葡萄糖，1g乳糖，蛋氨酸2g,亮氨酸2.5g，異亮氨酸0.15g，纈氨酸3g，蘇氨酸5g，色氨酸3g，組氨酸4g，苯丙氨酸為0.6g，丙氨酸5g，l-型谷胺酰胺4g，谷氨酸2g，甘氨酸4g,l-脯氨酸3g，瓜氨酸2.5g，鳥氨酸0.3g，精胺0.5g，亞精胺0.15g，d-型天門冬氨酸0.8g，?；撬?.8g，半胱氨酸0.15g，氨乙基亞磺酸0.4g，tris5g，加入500ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液，攪拌均勻。然后再依次加入大豆卵磷脂含量2g，卵黃卵磷脂3g，甘油3g，檸檬酸2g，青霉素100萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.3g，攪拌均勻，加入雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph為6.9-7.2，滲透壓為300mosm。16-18℃保存即可。實(shí)施例3將3g果糖，1.5g葡萄糖，1g乳糖，蛋氨酸2g,亮氨酸3g,異亮氨酸0.3g，纈氨酸5g，蘇氨酸5g，色氨酸2.5g，組氨酸3g，苯丙氨酸0.5g，丙氨酸8g，l-型谷胺酰胺3g，谷氨酸3g，甘氨酸3g,l-脯氨酸4g，瓜氨酸1.5g,鳥氨酸0.2g，精胺0.35g,亞精胺0.2g，d-型天門冬氨酸0.6g，?；撬?.5g，半胱氨酸0.1g，氨乙基亞磺酸0.35g，tris2.5g,加入500ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液，攪拌均勻。然后再依次加入大豆卵磷脂含量1.5g，卵黃卵磷脂3g，甘油2.5g，檸檬酸1.6g，青霉素100萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.25g，攪拌均勻，加入雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph為6.9-7.2，滲透壓為300mosm。16-18℃保存即可。實(shí)施例4將果糖2g、葡萄糖2g、乳糖2g，蛋氨酸1g，亮氨酸7g,異亮氨酸0.1g，纈氨酸7g，蘇氨酸4g，色氨酸6g，組氨酸2g，苯丙氨酸1.2g，丙氨酸為5g，l-型谷胺酰胺4g，谷氨酸1g，甘氨酸6g,l-脯氨酸2g，瓜氨酸2.5g,鳥氨酸0.15g，精胺0.9g,亞精胺0.1g，d-型天門冬氨酸1.5g，?；撬?.5g，半胱氨酸0.5g，氨乙基亞磺酸0.3g，tris6g，加入500ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液，攪拌均勻。然后再依次加入大豆卵磷脂含量1g，卵黃卵磷脂2g，甘油6g，檸檬酸1.2g，青霉素1,00萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.15g，攪拌均勻，加入雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph為7.2，滲透壓為300mosm。16℃保存即可。實(shí)施例5將果糖6g、葡萄糖4g、乳糖2g，蛋氨酸4g,亮氨酸1g,異亮氨酸0.7g，纈氨酸3g，蘇氨酸8g，色氨酸2g，組氨酸5g，苯丙氨酸0.5g，丙氨酸為11g，l-型谷胺酰胺2g，谷氨酸5g，甘氨酸2g，l-脯氨酸8g，瓜氨酸1g,鳥氨酸0.3g，精胺0.3g,亞精胺0.3g，d-型天門冬氨酸0.5g，?；撬?.5g，半胱氨酸0.1g，氨乙基亞磺酸0.5g，tris2.5g,加入500ml雙蒸水制成稀釋液基礎(chǔ)液，攪拌均勻。然后再依次加入大豆卵磷脂含量2.4g，卵黃卵磷脂3.6g，甘油2g，檸檬酸2g，青霉素80萬iu，乙二胺四乙酸二鈉0.4g，攪拌均勻，加入雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph為6.9，滲透壓為300mosm。18℃保存即可。根據(jù)不同實(shí)例的稀釋劑，分別對(duì)常溫保存和冷凍保存后的豬精液效果如表所示：為了驗(yàn)證稀釋劑對(duì)常溫保存后精子質(zhì)量的影響，將本稀釋劑在三個(gè)豬場(chǎng)，分別對(duì)精子進(jìn)行稀釋后常溫保存3天，然后分析精子質(zhì)量，結(jié)果見表1。由表1可知，采用本發(fā)明實(shí)施例1-5配方以后，精子活力、頂體完整性、精子畸形率和質(zhì)膜完整性均有不同程度的提高，效果十分顯著。表1營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑對(duì)常溫保存后精子質(zhì)量的影響為了驗(yàn)證本發(fā)明的精液品質(zhì)和配種的應(yīng)用效果，在四川、河南、廣西等部分豬場(chǎng)做了初步應(yīng)用。通過在三個(gè)豬場(chǎng)，選用346頭ly經(jīng)產(chǎn)母豬，對(duì)照組采用該豬場(chǎng)的商業(yè)用稀釋劑，試驗(yàn)組采用本發(fā)明稀釋劑，分別對(duì)精液常溫保存3天后進(jìn)行配種，母豬的飼養(yǎng)管理、飼糧配制及免疫程序均按照相同程序進(jìn)行。結(jié)果見表2，通過實(shí)驗(yàn)表明，采用本稀釋劑的公豬精液可使母豬的分娩率提高2-5％、產(chǎn)活仔數(shù)提高0.4-0.8頭，改善了母豬的繁殖成績(jī)。表2本發(fā)明對(duì)母豬繁殖成績(jī)的效果表(數(shù)據(jù)來自三個(gè)豬場(chǎng)，n＝346)項(xiàng)目對(duì)照組(n＝155)試驗(yàn)組(n＝191)配種母豬數(shù)量(頭)155191分娩母豬數(shù)量(頭)136173配種分娩率(％)87.7590.57出生窩均總仔數(shù)11.2812.03出生窩均活仔數(shù)10.3510.89為了驗(yàn)證稀釋劑對(duì)冷凍保存后精子質(zhì)量的影響，將本稀釋劑在兩個(gè)豬場(chǎng)開展精子凍存實(shí)驗(yàn)，在凍存14天后對(duì)精子進(jìn)行解凍，結(jié)果見表3。由表3可知，采用本發(fā)明實(shí)施例1-5配方對(duì)精子凍存，在精子解凍后，精子活力、頂體完整性、精子畸形率和質(zhì)膜完整性均有不同程度的提高，效果十分顯著。表3營(yíng)養(yǎng)抗凍稀釋劑對(duì)冷凍保存后精子質(zhì)量的影響為了驗(yàn)證本發(fā)明的精子在凍存-解凍后精液品質(zhì)和配種的應(yīng)用效果，在四川、河南、廣西等部分豬場(chǎng)做了初步應(yīng)用。通過在二個(gè)豬場(chǎng)，選用168頭ly經(jīng)產(chǎn)母豬，采用凍存14天后的精液進(jìn)行配種，母豬的飼養(yǎng)管理、飼糧配制及免疫程序均按照相同程序進(jìn)行。結(jié)果見表4，通過實(shí)驗(yàn)表明，采用本稀釋劑的公豬精液可使母豬的分娩率提高5-8％、產(chǎn)活仔數(shù)提高0.3-0.8頭，改善了母豬的繁殖成績(jī)。表4本發(fā)明對(duì)母豬繁殖成績(jī)的效果表(數(shù)據(jù)來自三個(gè)豬場(chǎng)，n＝168)項(xiàng)目對(duì)照組(n＝76)試驗(yàn)組(n＝92)配種母豬數(shù)量(頭)7692分娩母豬數(shù)量(頭)136173配種分娩率(％)75.583.65出生窩均總仔數(shù)11.1512.22出生窩均活仔數(shù)10.211.05上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12