本發(fā)明屬于蠶業(yè)生產(chǎn)領域，具體涉及一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法。

背景技術：

家蠶微粒子病是蠶業(yè)生產(chǎn)中最為嚴重的一種毀滅性傳染性疫病，該病病原為家蠶微孢子蟲(nosemabombycis)，是微孢子蟲nosema屬的典型種。家蠶微孢子蟲能夠在家蠶中腸、絲腺、肌肉、馬氏管等組織中寄生，感染后的家蠶不活潑、發(fā)育遲緩，體表出現(xiàn)黑褐色斑點，最終導致家蠶死亡。

家蠶微孢子蟲不僅能夠通過桑葉食下感染家蠶，也能夠通過蠶卵繼代傳播，因此該病一直備受業(yè)界重視，被世界上所有蠶桑生產(chǎn)國列為唯一法定檢疫對象。巴斯德創(chuàng)立的母蛾鏡檢法至今仍是家蠶微粒子病檢驗的關鍵技術措施。通過對產(chǎn)卵母蛾抽樣，在顯微鏡下檢查微孢子蟲，然后根據(jù)鏡檢結果淘汰有毒蠶種。近年來，我國微粒子病發(fā)生形勢嚴峻，因超毒被淘汰的蠶種數(shù)量居高不下，每年造成的經(jīng)濟損失達數(shù)千萬元。

目前，我國養(yǎng)蠶生產(chǎn)中推廣應用的家蠶品種都是具有雜種優(yōu)勢的四元雜交種，又稱普通種，它是由四個家蠶品種通過采取(a×b)×(c×d)的交配方式，即兩個家蠶品種先進行二元雜交產(chǎn)生雙交原種，然后兩個雙交種再雜交產(chǎn)生的四元雜交種。在普通種生產(chǎn)過程中，蠶種場主要是通過消毒藥物對養(yǎng)蠶場所、用具進行消毒，殺滅環(huán)境中的微孢子蟲從而避免家蠶感染。此外，廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所研發(fā)的“蠶用多菌靈粉”(原名“防微靈”)是目前唯一獲得農(nóng)業(yè)部生產(chǎn)批文的微粒子病治療藥物，該藥物的應用使家蠶微粒子疫病得到有效控制，穩(wěn)定了蠶種生產(chǎn)，有效解決了蠶種生產(chǎn)的重大難題。但是，研究發(fā)現(xiàn)藥物長期使用會對家蠶產(chǎn)生毒副作用，影響蠶種產(chǎn)量和品質。尋找有效、環(huán)保、安全的家蠶微粒子病新型防治方法一直是蠶病科學研究的重點和難點。

技術實現(xiàn)要素：

針對當前家蠶微粒子病防治藥物使用的缺陷以及四元雜交種在我國占絕對優(yōu)勢的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供一種針對家蠶四元雜交種微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，該方法通過對蠶種進行物理和化學結合處理，實現(xiàn)滅活蠶種中家蠶微孢子蟲的目的。本發(fā)明的操作簡單，成本較低，切實可行，處理后的蠶種能夠正常孵化，后代基本實現(xiàn)無微粒子病發(fā)生，且對后代無毒副作用，不影響其經(jīng)濟性狀。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

蠶卵無需冷藏處理的：家蠶產(chǎn)卵后將蠶卵于20-30℃靜置15-30h，然后在47～48℃的水中浸漬處理6～10min，浸漬時應保證蠶卵與水均勻、充分接觸；將蠶卵取出后用清水逐級洗脫至無味，干燥后催青孵化；

蠶卵經(jīng)過冷藏處理的：蠶卵從冷庫中取出，在10-20℃下靜置幾個小時，放入47～52℃的水中浸漬處理6～10min，浸漬時應保證蠶卵與水均勻、充分接觸，將蠶卵取出后用清水逐級洗脫至無味，干燥后催青孵化。

所述蠶卵為四元雜交種。

所述的幾個小時優(yōu)選1-3小時。

所述的水，優(yōu)選含有酸或過氧化氫；

所述的酸是鹽酸、硫酸、硝酸或醋酸等；

所述含有鹽酸的水，其密度為1.075-1.092g/cm³。

本發(fā)明方法靠的是水溫殺滅微孢子蟲，但對于家蠶四元雜交種，水溫和浸漬時間需要摸索和選擇。水溫低了不足以殺滅微孢子蟲，水溫過高則對蠶卵的孵化率有影響；浸漬時間亦是如此，時間短不足以殺滅微孢子蟲，浸漬久了又對蠶卵的孵化率有影響。本發(fā)明對這兩個特征的確定付出了創(chuàng)造性的勞動，得到了合適的范圍，取得了很好的效果。同時，本發(fā)明用稀酸溶液浸漬，有利于解除蠶卵滯育，提高孵化率。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：

1、本發(fā)明的方法能夠滅活97～99％的四元雜交種家蠶微孢子蟲病原，對家蠶微粒子病胚種垂直傳播的相對防治效果達90～97％。

2、本發(fā)明的方法蠶卵孵化率可達93％以上，對家蠶生長發(fā)育無不良影響。

附圖說明

圖1是浸漬溫度對非冷藏蠶種孵化率的影響。

圖2是浸漬時間對非冷藏蠶種孵化率的影響。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

“兩廣二號”四元雜交種，產(chǎn)卵后20h將蠶卵放入47℃、比重為1.075的鹽酸溶液中浸漬處理10min，然后取出洗脫、干燥，催青、孵化。實用孵化率達98％，3齡蠶顯微鏡檢驗，發(fā)病率僅為7.44％，而對照組發(fā)病率高達83.12％，與未處理對照相比，相對防治效果達91％。

相對防治效果的計算公式如下：

相對防治效果(％)＝(100-處理組發(fā)病率/對照組發(fā)病率)×100

通過real-timepcr對蟻蠶中的家蠶微孢子蟲病原進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病原滅活率達97％。

real-timepcr實驗的要點如下：

把對照組家蠶微孢子蟲基因的表達量定義為100，檢測各實施例家蠶處理后微孢子蟲的相對表達量。

蠶卵浸漬處理后催青。孵化后收集蟻蠶，每100頭蟻蠶為一區(qū)，按試劑盒說明書操作提取dna，以家蠶微孢子蟲單拷貝基因序列(nbo_934g0002)設計特異性引物(f:5′-acgaaatccgatgtccaaa-3′，

r:5′-gatgcgtactcttcccaaa-3′)，以家蠶actina1

(f:ctccctcgag-aagtcctacgaact，

r:ggatgccgcacgattccatac)為內參基因，進行每個樣品的pcr擴增，采用2^-△△ct法進行相對定量分析。

實施例2

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

“兩廣二號”四元雜交種，產(chǎn)卵后20h將蠶卵放入48℃、比重為1.075的鹽酸溶液中浸漬處理6min，然后取出洗脫、干燥，催青、孵化。實用孵化率達96％，3齡蠶顯微鏡檢驗，發(fā)病率僅為2.65％，而對照組發(fā)病率高達82.84％，與未處理對照相比，相對防治效果達97％。

另外，通過real-timepcr對蟻蠶中的家蠶微孢子蟲病原進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病原滅活率達99％。

實施例3

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

“兩廣二號”四元雜交種，產(chǎn)卵后20h將蠶卵放入47.5℃、比重為1.075的鹽酸溶液中浸漬處理7min，然后取出洗脫、干燥，催青、孵化。實用孵化率達99％，3齡蠶顯微鏡檢驗，發(fā)病率僅為3.70％，而對照組發(fā)病率高達83.15％，相對防治效果達96％。

另外，通過real-timepcr對蟻蠶中的家蠶微孢子蟲病原進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病原滅活率達97％。

實施例4

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

“兩廣二號”四元雜交種，產(chǎn)卵后20h將蠶卵放入48℃、比重為1.075的鹽酸溶液中浸漬處理7min，然后取出洗脫、干燥，催青、孵化。實用孵化率達94％，3齡蠶顯微鏡檢驗，發(fā)病率僅為4.50％，而對照組發(fā)病率高達92.86％，與對照組相比，相對防治效果達95％。

另外，通過real-timepcr對蟻蠶中的家蠶微孢子蟲病原進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病原滅活率達98％。

實施例5

在其他操作相同的情況下，對四元雜交種9芙×7湘、7湘×9芙的蠶卵做不同浸漬溫度溶液的實驗，考察浸漬溫度對未冷藏四元雜交種蠶卵孵化率的影響，結果見圖1?？梢钥闯觯簻爻^48℃，蠶卵孵化率顯著下降，因此浸漬溶液的溫度上限選擇48℃。

同時，另外的實驗發(fā)現(xiàn)，浸酸溫度≥47℃對微孢子蟲才有滅活效果。因此，浸漬溶液的溫度選擇47～48℃。

實施例6

在其他操作相同的情況下(浸漬溶液溫度47.5℃)，對四元雜交種9芙×7湘、7湘×9芙的蠶卵做不同浸漬時間的實驗，考察浸漬時間對未冷藏四元雜交種蠶卵孵化率的影響，結果見圖2?？梢钥闯觯n時間超過10min，蠶卵孵化率顯著下降，因此浸漬時間選擇6～10min。

實施例7

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

“兩廣二號”四元雜交種，冷藏保存，將蠶卵從冷庫取出在中間溫度(15℃)下保護2h，放入47℃、比重為1.092的鹽酸溶液中浸漬處理10min，然后取出洗脫、干燥，催青、孵化。實用孵化率達95％，3齡蠶顯微鏡檢驗，發(fā)病率僅為4.31％，而對照組發(fā)病率高達92.67％，與未處理對照相比，相對防治效果達95％。

另外，通過real-timepcr對蟻蠶中的家蠶微孢子蟲病原進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病原滅活率達97％。

實施例8

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

“兩廣二號”四元雜交種，冷藏保存，將蠶卵從冷庫取出在中間溫度(15℃)下保護2h，放入52℃、比重為1.092的鹽酸溶液中浸漬處理6min，然后取出洗脫、干燥，催青、孵化。實用孵化率達95％，3齡蠶顯微鏡檢驗，發(fā)病率僅為3.31％，而對照組發(fā)病率高達82.47％，與未處理對照相比，相對防治效果達96％。

另外，通過real-timepcr對蟻蠶中的家蠶微孢子蟲病原進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病原滅活率達98％。

實施例9

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

“兩廣二號”四元雜交種，冷藏保存，將蠶卵從冷庫取出在中間溫度(15℃)下保護2h，放入50℃、比重為1.092的鹽酸溶液中浸漬處理8min，然后取出洗脫、干燥，催青、孵化。實用孵化率達97％，3齡蠶顯微鏡檢驗，發(fā)病率僅為3.81％，而對照組發(fā)病率高達85.14％，與未處理對照相比，相對防治效果達96％。

另外，通過real-timepcr對蟻蠶中的家蠶微孢子蟲病原進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病原滅活率達99％。

實施例10

一種針對四元雜交種家蠶微粒子病胚種垂直傳播的防治方法，包括以下步驟：

“兩廣二號”四元雜交種，冷藏保存，將蠶卵從冷庫取出在中間溫度(15℃)下保護2h，放入51℃、比重為1.092的鹽酸溶液中浸漬處理7.5min，然后取出洗脫、干燥，催青、孵化。實用孵化率達98％，3齡蠶顯微鏡檢驗，發(fā)病率僅為4.51％，而對照組發(fā)病率高達87.25％，與未處理對照相比，相對防治效果達95％。

另外，通過real-timepcr對蟻蠶中的家蠶微孢子蟲病原進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病原滅活率達97％。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。