本發(fā)明涉及殺菌劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的制備方法。

背景技術(shù)：

自古以來，銀的廣譜抗菌活性得到了廣泛認(rèn)知，含銀抗菌劑已被廣大醫(yī)護(hù)人員用于傷口處理等方面。除了ag離子（ag⁺），文獻(xiàn)報道ag納米粒子（agnps）也具有抗菌活性，可以抑制包括革蘭氏陰性大腸桿菌(escherichiacoli，e.coli)在內(nèi)的多種細(xì)菌。與ag離子不同，agnps的抗菌活性和細(xì)胞毒性受很多因素的影響，比如agnps的粒徑和形貌等。較小的agnps由于具有更高的比表面積和較好的細(xì)胞穿透能力，有更好的抗菌活性。

為了得到溶液中穩(wěn)定的agnps，許多工作者采用聚合物、葡聚糖等大分子穩(wěn)定劑輔助合成agnps，這些聚合物或微球的使用雖然會得到粒徑均勻的agnps，但也大大降低ag的抗菌活性。水溶液中穩(wěn)定且分散良好的agnp組裝結(jié)構(gòu)可以避免單個ag納米粒子在溶液中發(fā)生聚集的問題，目前文獻(xiàn)報道的agnp組裝結(jié)構(gòu)中采用較多的是在一維、二維或三維模板上原位還原ag納米顆粒的方法來制備，常見的模板有微球（如tio2球，聚苯乙烯球或fe3o4與tio2核殼微球等）、碳納米管、石墨烯、纖維素等。

例如，bhatti等人報道合成了agnps修飾的碳納米管（cnts），不同的修飾時間可以得到不同粒徑的agnps，對大腸桿菌顯示出不同的殺菌活性。（s.javeriakazmi,m.a.shehzada,s.mehmood,m.yasaraaishanaeem,a.s.bhatti.sensorsandactuatorsa,2014,216:287–294），但存在負(fù)載效率低的問題，如果在溶液中使用，還容易出現(xiàn)團(tuán)聚的問題。

zhang等人通過種子生長的方法合成了agnps修飾的fe3o4@sio2核殼納米微球，納米粒子的粒徑和修飾密度都可以很好的進(jìn)行調(diào)控，所得產(chǎn)品證實(shí)對多種微生物有殺菌活性。（miaomiaoli,1,wenjiewu,1,ruqiao,linxiangtan,zhengquanli,yongzhang.journalofalloysandcompounds2016,676,113-119）。存在模板制作麻煩的問題，需要很多分離和純化步驟，過程繁瑣。

wang等人采用季銨鹽化的羧甲基殼聚糖、有機(jī)蒙脫石以及ag納米粒子制備出新型的殺菌紙，對細(xì)菌微生物有很好的殺菌效果。（yunzhiling,yuqiongluo,jiwenluo,xiaoyingwang,runcangsun.industrialcropsandproducts.2013,51,470–479）。也存在模板制作繁瑣的問題，除此之外，實(shí)驗(yàn)過程中還需要使用微波處理，在實(shí)際應(yīng)用中存在不便。

這些agnp組裝結(jié)構(gòu)雖然有相對較好的粒徑分布和微生物抗菌效果，但也存在一些缺點(diǎn)有待改進(jìn)。因此需要發(fā)明一種合適的、簡單易得的納米模板來組裝高密度的agnps陣列，并通過這種二維組裝結(jié)構(gòu)提高細(xì)菌外部ag納米粒子的局部濃度，增強(qiáng)其抗菌活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的制備方法，操作簡單，au@agnp的組裝效率高。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的制備方法，包括以下步驟：

⑴、用濾紙吸附金納米粒子；

⑵、將步驟⑴吸附有金納米粒子的濾紙，加入硝酸銀溶液中，發(fā)生還原反應(yīng)，得到紙基二維au@ag核殼納米粒子。

2、如權(quán)利要求1所述紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的制備方法，其特征在于：步驟⑴具體為：將濾紙剪切成方塊，放入金納米粒子溶液中浸泡0.8～1.5h。

3、如權(quán)利要求1或2所述紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的制備方法，其特征在于：金納米粒子的尺寸為3～7nm。

4、如權(quán)利要求1所述紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的制備方法，其特征在于：步驟⑵具體為：吸附有金納米粒子的濾紙置于硝酸銀溶液中浸泡1.6～2.5h，加入聚乙烯吡咯烷酮和抗壞血酸溶液，發(fā)生還原反應(yīng)0.8～1.5h，取出濾紙，80℃烘干。

5、如權(quán)利要求4所述紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的制備方法，其特征在于：聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量濃度為1%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：采用廉價易得的普通濾紙作為模板，在其表面通過種子生長的方法制備銀包金核殼納米粒子，得到紙基二維au@ag核殼納米粒子組裝體。這種紙基含銀微生物殺菌劑對au@agnp的組裝效率高，操作簡便；另外整個實(shí)驗(yàn)過程減少了有毒化學(xué)試劑的使用，降低了殺菌劑的生產(chǎn)制作成本，也不需要大型儀器的參與，相對于其他殺菌劑制備方法有更高的實(shí)際應(yīng)用性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明濾紙上面au@ag核殼納米粒子的透射電子顯微鏡（tem）照片，a中標(biāo)尺為20nm，b中標(biāo)尺為200nm；

圖2為大腸桿菌與紙基二維復(fù)合殺菌劑作用前的tem照片，可以清楚的看到大腸桿菌形狀飽滿，細(xì)胞完好無損；

圖3為大腸桿菌與紙基二維復(fù)合殺菌劑作用后的tem照片，可以清楚的看到大腸桿菌的細(xì)胞破損，殺菌材料將細(xì)胞壁破壞，并進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部；

圖4為大腸桿菌與不同劑量紙基二維復(fù)合殺菌劑作用后的吸收光譜曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。

一種紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的制備方法，包括以下過程：濾紙先吸附金納米粒子（aunps）,此時濾紙上面呈現(xiàn)紅色；再以aunps為種子，還原硝酸銀（agno3）得到銀包金（au@ag）核殼納米粒子，與濾紙復(fù)合成為二維組裝體，此時濾紙上面呈現(xiàn)黑色。通過測量透射電子顯微鏡來觀察核殼納米粒子的形貌，制樣時需要將樣品滴在碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上面。由于au核在碳膜上的襯度高于ag，可以看到au核（顏色較黑）外面包裹一層ag殼（顏色稍淡），厚度有幾個nm，如圖1所示。

將上述制得的紙基二維復(fù)合殺菌劑，用于大腸桿菌（e.coli）的抗菌活性實(shí)驗(yàn)中，通過測量e.coli的吸收光譜、表征微生物的形貌來分析二維復(fù)合體的抗菌活性。較高的殺菌活性可以完全將e.coli殺死，從而抑制e.coli的生長，使吸收光譜值（opticaldensity，od值）不發(fā)生變化，透射電子顯微鏡照片中顯示e.coli的細(xì)胞被破壞，不再完整；如圖2-4所示。

本發(fā)明紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑的完整制備方法如下：

1、采用的lb培養(yǎng)基按照標(biāo)準(zhǔn)配方用胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉配置得到并調(diào)節(jié)ph到7.4，經(jīng)高溫殺菌后備用；所使用化學(xué)試劑均為從試劑公司購買的分析純化學(xué)藥品；定性濾紙為市售；瓶裝娃哈哈純凈水從超市購買得到。

2、濾紙-aunp組裝結(jié)構(gòu)制備：將濾紙剪成一定尺寸大小的方塊，并將剪好的濾紙放入直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，然后加入10ml含有一定濃度為的5nmaunps溶液中，浸泡吸附1h，然后將濾紙取出放于室溫干燥。

3、紙基二維au@ag核殼納米粒子復(fù)合殺菌劑制備：向一塊已經(jīng)吸附好aunps的濾紙上加入20μl不同濃度的硝酸銀（agno3）中，吸附2h，然后將濾紙取出，再加入一定量的1%的聚乙烯吡咯烷酮（pvp）和一定量的抗壞血酸（l-aa）溶液將agno3還原。反應(yīng)進(jìn)行1h，然后將濾紙取出，放于80℃烘干備用。

4、抗菌實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)之前，所有樣品及器材均在120℃高壓滅菌20min以保證無菌條件。實(shí)驗(yàn)中，向1.2mllb培養(yǎng)基中加入最終濃度為10⁶cfu/ml的大腸桿菌（e.coli）細(xì)菌樣品，然后加入不同劑量的紙基au@ag納米粒子復(fù)合組裝體樣品，在32℃和150rpm搖床上生長培養(yǎng)。細(xì)菌生長狀況和濃度通過測量600nm處的吸光值（od值）來確定，并根據(jù)吸光值繪制細(xì)菌生長曲線，實(shí)驗(yàn)中如果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的吸光值很高，需要將樣品稀釋后再測定。通過測量吸收曲線和透射電子顯微鏡對樣品形貌和殺菌效果進(jìn)行表征。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1）與已有技術(shù)方法相比，本發(fā)明采用濾紙為模板，價格低廉，使用方便，不需要大型儀器的輔助合成，降低了殺菌劑的制備成本和過程；

2）濾紙有較好的吸附作用，故相比于之前的技術(shù)，本發(fā)明所得au@ag核殼納米粒子具有粒徑均勻、溶液穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。

3）本發(fā)明所制備的殺菌劑二維組裝面積大，與細(xì)菌等微生物能夠有較大的接觸面積，殺菌活性高；

4）本發(fā)明所制備的二維復(fù)合殺菌劑組裝效率高，用量少，殺菌效果好。

5）殺菌劑使用過后回收方便，濾紙易降解，對環(huán)境沒有污染

6）本發(fā)明體系操作簡單、快捷。

實(shí)例1:

將濾紙剪成大小的方塊，并將20塊剪好的濾紙放入直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，然后加入10ml含有20nm濃度為的5nmaunps溶液中，浸泡吸附1h，然后將濾紙取出，放于室溫干燥12h。剩下的aunps溶液的濃度通過測量紫外-可見吸收光譜進(jìn)行定量，并反推得到濾紙上面吸附aunps的濃度。接著，向已經(jīng)吸附好aunps的濾紙上面滴加20μl20mm的硝酸銀（agno3）中，吸附2h，然后再加入20μl1%的聚乙烯吡咯烷酮（pvp）和20μl0.05m的抗壞血酸（l-aa）將agno3還原。反應(yīng)進(jìn)行1h，然后將濾紙取出，放于80℃烘干備用。在抗菌實(shí)驗(yàn)之前，所有樣品及器材均在120℃高壓滅菌20min以保證無菌條件。實(shí)驗(yàn)中，向1.2mllb培養(yǎng)基中加入最終濃度為10⁶cfu/ml的大腸桿菌（e.coli）細(xì)菌樣品，然后加入5塊制備的紙基au@ag納米粒子復(fù)合組裝體樣品（ag含量在3.24mg/l），在32℃和150rpm搖床上生長培養(yǎng)48h。細(xì)菌生長狀況和濃度通過測量600nm處的吸光值（od值）來確定，并根據(jù)吸光值繪制細(xì)菌生長曲線，實(shí)驗(yàn)中如果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的吸光值很高，需要將樣品稀釋后再測定。實(shí)現(xiàn)中觀察到這個濃度的紙基復(fù)合殺菌劑可以抑制大腸桿菌的生長長達(dá)23h。

實(shí)例2：

將濾紙剪成大小的方塊，并將20塊剪好的濾紙放入直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，然后加入10ml含有20nm濃度為的5nmaunps溶液中，浸泡吸附1h，然后將濾紙取出，放于室溫干燥12h。接著，向已經(jīng)吸附好aunps的濾紙上滴加20μl50mm的agno3，吸附2h，然后再加入20μl1%的pvp）和20μl0.1m的l-aa將agno3還原。反應(yīng)進(jìn)行1h，然后將濾紙取出，放于80℃烘干備用。在抗菌實(shí)驗(yàn)之前，所有樣品及器材均在120℃高壓滅菌20min以保證無菌條件。實(shí)驗(yàn)中，向1.2mllb培養(yǎng)基中加入最終濃度為10⁶cfu/ml的大腸桿菌（e.coli）細(xì)菌樣品，然后加入5塊制備的紙基au@ag納米粒子復(fù)合組裝體樣品（ag含量在6.48mg/l），在32℃和150rpm搖床上生長培養(yǎng)48h。細(xì)菌生長狀況和濃度通過測量600nm處的吸光值（od值）來確定，并根據(jù)吸光值繪制細(xì)菌生長曲線，實(shí)驗(yàn)中如果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的吸光值很高，需要將樣品稀釋后再測定。實(shí)驗(yàn)中觀察到這個濃度的紙基復(fù)合殺菌劑可以抑制大腸桿菌的生長長達(dá)33h。

實(shí)例3：

將濾紙剪成大小的方塊，并將20塊剪好的濾紙放入直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，然后加入10ml含有50nm濃度為的5nmaunps溶液中，浸泡吸附1h，然后將濾紙取出，放于室溫干燥12h。接著，向已經(jīng)吸附好aunps的濾紙上滴加20μl100mmagno3，吸附2h，然后再加入20μl1%的pvp和20μl0.2m的l-aa將agno3還原。反應(yīng)進(jìn)行1h，然后將濾紙取出，放于80℃烘干備用。在抗菌實(shí)驗(yàn)之前，所有樣品及器材均在120℃高壓滅菌20min以保證無菌條件。實(shí)驗(yàn)中，向1.2mllb培養(yǎng)基中加入最終濃度為10⁶cfu/ml的大腸桿菌（e.coli）細(xì)菌樣品，然后加入5塊制備的紙基au@ag納米粒子復(fù)合組裝體樣品（ag含量在14.4mg/l），在32℃和150rpm搖床上生長培養(yǎng)48h。細(xì)菌生長狀況和濃度通過測量600nm處的吸光值（od值）來確定，并根據(jù)吸光值繪制細(xì)菌生長曲線，實(shí)驗(yàn)中如果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的吸光值很高，需要將樣品稀釋后再測定。實(shí)驗(yàn)中觀察到這個濃度的紙基復(fù)合殺菌劑可以抑制大腸桿菌的生長長達(dá)48h。

實(shí)例4：

將濾紙剪成大小的方塊，并將20塊剪好的濾紙放入直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，然后加入10ml含有50nm濃度為的5nmaunps溶液中，浸泡吸附1h，然后將濾紙取出，放于室溫干燥12h。接著，向已經(jīng)吸附好aunps的濾紙上滴加20μl150mm的agno3中，吸附2h，然后再加入20μl1%的pvp和20μl0.2m的l-aa將agno3還原。反應(yīng)進(jìn)行1h，然后將濾紙取出，放于80℃烘干備用。在抗菌實(shí)驗(yàn)之前，所有樣品及器材均在120℃高壓滅菌20min以保證無菌條件。實(shí)驗(yàn)中，向1.2mllb培養(yǎng)基中加入最終濃度為10⁶cfu/ml的大腸桿菌（e.coli）細(xì)菌樣品，然后加入5塊制備的紙基au@ag納米粒子復(fù)合組裝體樣品（ag含量在20mg/l），在32℃和150rpm搖床上生長培養(yǎng)48h。細(xì)菌生長狀況和濃度通過測量600nm處的吸光值（od值）來確定，并根據(jù)吸光值繪制細(xì)菌生長曲線，實(shí)驗(yàn)中如果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的吸光值很高，需要將樣品稀釋后再測定。實(shí)驗(yàn)中觀察到這個濃度的紙基復(fù)合殺菌劑可以抑制大腸桿菌的生長長達(dá)48h。

實(shí)例5：

將濾紙剪成大小的方塊，并將20塊剪好的濾紙放入直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，然后加入10ml含有10nm濃度為的5nmaunps溶液中，浸泡吸附1h，然后將濾紙取出，放于室溫干燥12h。接著，向已經(jīng)吸附好aunps的濾紙上滴加20μl150mm的agno3中，吸附2h，然后再加入20μl1%的pvp和20μl0.3m的l-aa。反應(yīng)進(jìn)行1h，然后將濾紙取出，放于80℃烘干備用。在抗菌實(shí)驗(yàn)之前，所有樣品及器材均在120℃高壓滅菌20min以保證無菌條件。實(shí)驗(yàn)中，向1.2mllb培養(yǎng)基中加入最終濃度為10⁶cfu/ml的大腸桿菌（e.coli）細(xì)菌樣品，然后加入5塊制備的紙基au@ag納米粒子復(fù)合組裝體樣品（ag含量在20mg/l），在32℃和150rpm搖床上生長培養(yǎng)48h。細(xì)菌生長狀況和濃度通過測量600nm處的吸光值（od值）來確定，并根據(jù)吸光值繪制細(xì)菌生長曲線，實(shí)驗(yàn)中觀察到這個濃度的紙基復(fù)合殺菌劑可以完全抑制大腸桿菌的生長。

實(shí)例6：

將濾紙剪成大小的方塊，并將20塊剪好的濾紙放入直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，然后加入10ml含有50nm濃度為的5nmaunps溶液中，浸泡吸附1h，然后將濾紙取出，放于室溫干燥12h。接著，將已經(jīng)吸附好aunps的濾紙加入到20μlh2o，吸附2h，然后再加入20μl1%的聚乙烯吡咯烷酮（pvp）和20μl0.1m的抗壞血酸（l-aa）。反應(yīng)進(jìn)行1h，然后將濾紙取出，用純凈水將多余的反應(yīng)試劑沖洗掉，最后將制備好的紙基au@ag納米粒子復(fù)合組裝體放于80℃烘干備用。在抗菌實(shí)驗(yàn)之前，所有樣品及器材均在120℃高壓滅菌20min以保證無菌條件。實(shí)驗(yàn)中，向1.2mllb培養(yǎng)基中加入最終濃度為10⁶cfu/ml的大腸桿菌（e.coli）細(xì)菌樣品，然后加入5塊制備的紙基au@ag納米粒子復(fù)合組裝體樣品（ag含量在14.4mg/l），在32℃和150rpm搖床上生長培養(yǎng)48h。細(xì)菌生長狀況和濃度通過測量600nm處的吸光值（od值）來確定，并根據(jù)吸光值繪制細(xì)菌生長曲線，實(shí)驗(yàn)中觀察到?jīng)]有ag還原的紙基復(fù)合殺菌劑對照樣品對大腸桿菌沒有殺菌活性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。