本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及巖白菜屬的厚葉巖白菜，是一種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細(xì)胞胚胎的方法。

背景技術(shù)：

厚葉巖白菜(bergeniacrassifolia(l.)fritsch)為虎耳草科巖白菜屬多年生常綠草本，是該屬中形體較大種類，國內(nèi)野生種僅見分布于新疆阿爾泰山，極早春開花，冬季葉片呈紫紅色，花葉俱美。全草含有巖白菜素，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的特效藥。自然狀態(tài)下，厚葉巖白菜主要靠分株或籽播繁殖，繁殖率低。野生資源被過度的采挖利用，資源日趨瀕危。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細(xì)胞胚胎的方法。所述的這種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細(xì)胞胚胎的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中，厚葉巖白菜繁殖率低的技術(shù)問題，并為遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)厚葉巖白菜體細(xì)胞胚胎的方法，包括如下步驟：

1)誘導(dǎo)愈傷組織：取無菌試管苗形態(tài)學(xué)上端第二對、第三對葉片，修剪葉片邊緣出現(xiàn)傷口，葉片遠(yuǎn)軸面朝下放于ms+2,4-d0.1～1.0mg/l+kt0.01～0.1mg/l+vc0.05～1.0mg/l培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)25～35天；

2)增殖愈傷組織：剝離誘導(dǎo)出的愈傷組織，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基ms+zt0.5～2.0mg/l+naa0.01～0.1mg/l+vc0.05～1.0mg/l，黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)25～35天；

3)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎：將愈傷組織轉(zhuǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基ms+zt0.1～2.0mg/l+iba0.01～0.1mg/l+vc0.05～1.0mg/l，黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)55～65天，誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎后，再轉(zhuǎn)移至光照下培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中，2,4-d濃度可以為0.1～1.0mg/l區(qū)間的任一濃度；kt濃度可以為0.01～0.1mg/l區(qū)間的任一濃度；vc濃度可以為0.05～1.0mg/l區(qū)間的任一濃度。其中最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為ms+2,4-d1.0mg/l+kt0.1mg/l+vc0.5mg/l，黑暗培養(yǎng)30天。

進(jìn)一步的，愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，zt濃度可以為0.5～2.0mg/l區(qū)間的任一濃度；naa濃度可以為0.01～0.1mg/l區(qū)間的任一濃度；vc濃度可以為0.05～1.0mg/l區(qū)間的任一濃度。其最佳愈傷組織增殖培養(yǎng)基為ms+zt1.0mg/l+naa0.1mg/l+vc0.5mg/l，黑暗培養(yǎng)30天。

進(jìn)一步的，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的培養(yǎng)基中，zt濃度可以為0.1～2.0mg/l區(qū)間的任一濃度；iba濃度可以為0.01～0.1mg/l區(qū)間的任一濃度；vc濃度可以為0.05～1.0mg/l區(qū)間的任一濃度。其最佳誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)基為ms+zt1.0mg/l+iba0.1mg/l+vc0.5mg/l，黑暗培養(yǎng)60天。

進(jìn)一步的，上述各種培養(yǎng)基，其ph值為5.6～5.9區(qū)間的任一數(shù)值；蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為2.5％～3.5％區(qū)間的任一數(shù)值；瓊脂的質(zhì)量百分比濃度為0.55％～0.75％區(qū)間的任一數(shù)值。

厚葉巖白菜作為用途較廣的中藥材，需求量不斷攀升，形體的大小、生長速度快慢、生態(tài)適應(yīng)性及巖白菜素含量高低是決定其能否推廣的幾個(gè)重要因素。本發(fā)明建立了愈傷組織發(fā)生途徑，首次誘導(dǎo)出了巖白菜屬體細(xì)胞胚胎，為今后擴(kuò)繁推廣、遺傳轉(zhuǎn)化及倍性育種培育新品種奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，技術(shù)效果是積極和明顯的，并具有獨(dú)特性、新穎性和創(chuàng)新性。本發(fā)明以厚葉巖白菜無菌苗的嫩葉為起始材料，誘導(dǎo)出愈傷組織，進(jìn)而誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎，分化率最高為26.67％，為遺傳轉(zhuǎn)化及倍性育種奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是厚葉巖白菜愈傷組織的照片。

圖2是厚葉巖白菜體細(xì)胞胚的照片。

圖3是厚葉巖白菜子葉胚的照片。

圖4是厚葉巖白菜子葉胚切片。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中的縮略詞中英文對照表

下述實(shí)施例中每種處理調(diào)查30個(gè)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)愈傷組織率、愈傷組織增重倍數(shù)、體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率。除特別說明外，每種處理重復(fù)3次。

誘導(dǎo)愈傷組織率＝愈傷組織數(shù)/接種數(shù)、愈傷組織增重倍數(shù)＝(愈傷組織培養(yǎng)后重量-愈傷組織培養(yǎng)前重量)/愈傷組織培養(yǎng)前重量、體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率＝體細(xì)胞胚胎數(shù)/接種數(shù)。

采用excel2003和spss18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素(one-wayanova)和duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較(α＝0.05)

下述實(shí)施例中各種培養(yǎng)基的ph值為5.6～5.9，蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為2.5％～3.5％，瓊脂的質(zhì)量百分比濃度為0.55％～0.75％。

實(shí)施例1誘導(dǎo)愈傷組織

取無菌試管苗形態(tài)學(xué)上端第二對、第三對葉片。

修剪葉片邊緣出現(xiàn)傷口，以利于營養(yǎng)吸收與再分化，葉片遠(yuǎn)軸面朝下放置于培養(yǎng)基ms+2,4-d0.1～1.0mg/l+kt0.01～0.1mg/l+vc0.05～1.0mg/l，黑暗培養(yǎng)。

葉片在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基培養(yǎng)的第10d，邊緣切口處開始產(chǎn)生乳黃色的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織增多，培養(yǎng)至30d時(shí)，可以剝下，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

實(shí)施例2增殖愈傷組織

將初代誘導(dǎo)得到的愈傷組織分成5mm大小，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，zt、ba濃度設(shè)置在0.5～2.0mg/l之間，naa濃度設(shè)置在0.01～0.1mg/l之間、vc濃度設(shè)置在0.05～1.0mg/l之間，黑暗培養(yǎng)，30d為一個(gè)周期。

表1ba、zt及不同濃度水平對愈傷增殖的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，表中數(shù)字后不同的字母表示0.05水平差異顯著性(p﹤0.05)

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，愈傷組織都能夠進(jìn)行增殖生長，但非常容易褐變，所有培養(yǎng)基中都添加了vc0.05～1.0mg/l，及采取黑暗培養(yǎng)，也只是在一定程度上減輕了褐變程度，延長褐變時(shí)間，但不能從根本上解決愈傷組織的褐變。經(jīng)30d培養(yǎng)，愈傷組織體積膨大，重量增重為原來的1.1～2.5倍(表1)，其中在ms+zt1.0mg/l+naa0.1mg/l+vc0.5mg/l培養(yǎng)基上，增殖速度最快，與其它處理相比，差異顯著，部分愈傷組織呈乳白色(圖1)，后期培養(yǎng)證明更容易分化。

愈傷組織在ms+zt1.0mg/l+naa0.1mg/l+vc0.5mg/l培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后，挑選色澤乳白，結(jié)構(gòu)致密，大小類似，來源一致的愈傷組織，轉(zhuǎn)接入無任何激素的ms基本培養(yǎng)基上，不管培養(yǎng)時(shí)間多長，都不能分化出不定芽，更不能誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎。其愈傷組織進(jìn)一步的分化或誘導(dǎo)需要添加細(xì)胞分裂素，培養(yǎng)結(jié)果取決于添加的激素種類，添加ba的培養(yǎng)基分化出不定芽，而添加zt的培養(yǎng)基則可以誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎。

實(shí)施例3誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎

誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的培養(yǎng)基以ms為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，zt濃度設(shè)置在0.1～2.0mg/l之間，iba濃度設(shè)置在0.01～0.1mg/l之間、vc濃度設(shè)置在0.05～1.0mg/l之間，黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎后，再轉(zhuǎn)移至光照下培養(yǎng)。

在添加zt的培養(yǎng)基上，厚葉巖白菜愈傷組織可以誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎，當(dāng)其濃度超過1.0mg/l時(shí)，與低于此濃度的其它組相比，處理效果差異顯著(表2)。經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)在ms+zt1.0mg/l+iba0.1mg/l+vc0.5mg/l培養(yǎng)基上培養(yǎng)至60d時(shí)，誘導(dǎo)率最高為26.67％，出胚愈傷組織可以誘導(dǎo)形成2～3個(gè)體細(xì)胞胚胎(圖2)。誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚胎形態(tài)正常，色澤嫩白，胚芽端胚根端明顯，容易從愈傷組織上脫離，單獨(dú)發(fā)育(圖3)，通過組織切片觀察，其子葉胚具有獨(dú)立的維管束結(jié)構(gòu)，并具有明顯的兩極性(圖4)。但是愈傷組織需要一直處于黑暗中培養(yǎng)，如果愈傷組織轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)，則在培養(yǎng)至10d時(shí)，開始逐漸褐變，培養(yǎng)至30d時(shí)，完全死亡，分化不出體細(xì)胞胚胎。

表2不同激素及不同激素水平對體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，表中數(shù)字后不同的字母表示0.05水平差異顯著性(p﹤0.05)

結(jié)論：

中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所通過愈傷組織途徑分化出不定芽，但未見誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎的報(bào)道，本發(fā)明經(jīng)過長達(dá)兩年的探索，終于誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎，是該屬植物在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎方面的首次突破。但在本發(fā)明的培養(yǎng)中，同樣出現(xiàn)了愈傷組織嚴(yán)重褐變的情況，加入抗褐化劑vc、pvp、硫代硫酸鈉時(shí)，褐變率有所降低，但仍然不能從根本上解決褐變問題，愈傷組織的褐變也是導(dǎo)致目前體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)率比較低的重要原因。本發(fā)明主要采用暗培養(yǎng)的模式，誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎后，再轉(zhuǎn)移至光下培養(yǎng)模式以降低褐變。