本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)的防褐化方法，具體涉及一種月季組培苗防褐化的方法。

背景技術(shù)：

月季是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，被譽(yù)為花中皇后，又稱月月紅。月季在園林綠化中有著不可替代的價(jià)值，其四季均可觀賞，花期長(zhǎng)，觀賞價(jià)值高，在南北園林應(yīng)用中十分廣泛。月季的繁殖方法有傳統(tǒng)的扦插和嫁接，但因受限于繁殖材料難以大量快速的繁殖，后期發(fā)展的組織培養(yǎng)可以在短期內(nèi)繁育大量的優(yōu)良苗木，成為了月季育種中最為有效的快速繁殖手段之一。對(duì)于木本植物組織培養(yǎng)而言，褐化是影響組培成功的關(guān)鍵難題。褐化是由于外植體在切口釋放出的酚類物質(zhì)氧化后使培養(yǎng)基變褐，隨之外植體也會(huì)變褐，進(jìn)而導(dǎo)致其死亡。

本發(fā)明針對(duì)月季組培苗褐化嚴(yán)重的問題，提出一種預(yù)防月季褐化的組織培養(yǎng)方法，本發(fā)明通過控制月季取材，誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)基的成分、激素配比、ph以及外植體的前處理等能夠有效防止酚類物質(zhì)氧化，從而實(shí)現(xiàn)防止月季褐化現(xiàn)象的發(fā)生，極大提高月季快速繁殖效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種防止月季組培苗褐化的方法，極大提高月季快速繁殖效率。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種防止月季組培苗褐化的方法，包括如下步驟：

1)、取材：選取處于旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)的半木質(zhì)化月季帶芽莖段；去除莖尖及上部幼嫩莖段后切成2-3cm單芽莖段；

2)、消毒：

3)、接種前預(yù)處理：將接種前的已消毒的外植體用已過濾消毒的聚乙烯吡咯烷酮水溶液(濃度為2-3g/l)浸泡10分鐘左右進(jìn)行預(yù)處理；

4)、接種、誘導(dǎo)培養(yǎng)：將預(yù)處理后的月季莖段攤鋪在已消毒的濾紙上晾干后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，直至不定芽長(zhǎng)至3-4cm，待增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為22℃/白天，20℃/黑夜，12h/白天，12h/黑夜，光照強(qiáng)度為3000-4000lux；

5)、增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)生成的不定芽切下，在增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，15-20天繼代一次，增殖培養(yǎng)條件為22℃/白天，20℃/黑夜，12h/白天，12h/黑夜，光照強(qiáng)度為3000-4000lux；

6)、生根培養(yǎng)：將增殖培養(yǎng)的組培苗切成單株接種于生根培養(yǎng)基，于20℃/白天，18℃/黑夜，16h/白天，8h/黑夜，光照強(qiáng)度為4000-5000lux條件下培養(yǎng)。

優(yōu)選地，所述的步驟2)消毒步驟為：用流動(dòng)自來水沖洗1-2h，75％酒精浸泡30s后用已滅菌的蒸餾水沖洗3-5次，再用5％naclo處理15min后用已滅菌蒸餾水沖洗3-5次，消毒期間不斷搖晃使其消毒充分，切除已消毒莖段首尾置于已滅菌的濾紙晾干后待接種。

優(yōu)選地，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加的激素及其含量分別為：6-ba0.5-1mg/l、naa0.01-0.1mg/l，增殖培養(yǎng)基中添加的激素及其含量分別為：6-ba0.5-1mg/l、naa0.01-0.1mg/l、ga30.01mg/l，生根培養(yǎng)基中添加的激素及其含量分別為：naa0.2-0.4mg/l、iba0.1-0.2mg/l。

優(yōu)選地，誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中瓊脂用量為7.5-8g/l。

優(yōu)選地，誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的ph值調(diào)節(jié)為5.5-5.8。

優(yōu)選地，在增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中添加活性炭，活性炭用量0.5-1g/l。

優(yōu)選地，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：ms+30g/l蔗糖+7.5-8g/l瓊脂+0.5-1mg/l6-芐氨基嘌呤+0.01-0.1mg/l萘乙酸，ph5.5-5.8。增殖培養(yǎng)基的配方為：ms+30g/l蔗糖+7.5-8g/l瓊脂+0.5-1mg/l6-芐氨基嘌呤+0.01-0.1mg/l萘乙酸+0.01mg/l赤霉素+0.5-1g/l活性炭，ph5.5-5.8。生根培養(yǎng)基的配方為:1/2ms+25g/l蔗糖+7.5-8g/l瓊脂+0.2-0.4mg/l萘乙酸+0.1-0.2mg/l吲哚丁酸+0.5-1g/l活性炭，ph5.5-5.8。

本發(fā)明所具有的有益效果:

本發(fā)明優(yōu)化了月季組織培養(yǎng)各個(gè)階段的操作方法，有效降低褐化率到10％以下，解決了月季組培褐化率高的難題。具體地：

本發(fā)明采用了聚乙烯吡咯烷酮和活性炭?jī)煞N吸附劑，采用聚乙烯吡咯烷酮浸泡作為外植體的前處理方法，培養(yǎng)基中添加活性炭來吸附外植體釋放的酚類物質(zhì)以及氧化后形成的醌類物質(zhì)，從而達(dá)到預(yù)防褐化的效果。

本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選了月季組織培養(yǎng)各個(gè)階段的培養(yǎng)基配方，有效降低了月季組培過程中的褐化問題。

培養(yǎng)基的硬度會(huì)影響酚類物質(zhì)的擴(kuò)散，適當(dāng)增加瓊脂用量會(huì)降低褐化率，本發(fā)明優(yōu)選瓊脂用量為7.5-8g/l。

培養(yǎng)基的低ph具有降低多酚氧化酶活性的作用，能夠抑制褐化；本發(fā)明培養(yǎng)基的ph值調(diào)節(jié)為5.5-5.8。

月季外植體傷口處積累的酚類物質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間會(huì)引起褐化，通過縮短繼代周期，可以減輕月季組培苗的褐化現(xiàn)象。本發(fā)明將繼代培養(yǎng)時(shí)間縮短到20天以內(nèi)。

溫度直接影響植物體內(nèi)酶活性，在保證植物正常生長(zhǎng)的前提下適當(dāng)降低溫度可以降低相關(guān)酶活性，從而抑制酚類物質(zhì)的合成，進(jìn)而減輕褐化現(xiàn)象的發(fā)生。本發(fā)明將月季增殖培養(yǎng)置于22℃/白天，20℃/黑夜條件下培養(yǎng)；生根培養(yǎng)置于20℃/白天，18℃/黑夜條件下培養(yǎng)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一種防止月季組培苗褐化的方法，包括如下步驟：

選取北方地區(qū)春末季節(jié)半木質(zhì)化的月季帶芽莖段，去除莖尖及上部幼嫩莖段后切成2-3cm單芽莖段，流動(dòng)自來水沖洗1h，75％酒精處理30s后用已滅菌的蒸餾水沖洗3次，5％naclo處理15min后用已滅菌蒸餾水沖洗3次對(duì)外植體進(jìn)行消毒，消毒期間不斷搖晃使其消毒充分，切除已消毒莖段首尾置于已滅菌的濾紙晾干后待接種。

用孔徑為0.22μm過濾膜過濾2g/l聚乙烯吡咯烷酮水溶液，將待接種的月季莖段浸泡于上述已滅菌的聚乙烯吡咯烷酮中10min，攤鋪在已消毒的濾紙上晾干后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(ms+30g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂+0.5mg/l6-芐氨基嘌呤+0.01mg/l萘乙酸，ph5.8)，誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為22℃/白天，20℃/黑夜，12h/白天，12h/黑夜，光照強(qiáng)度為3300lux。

待經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的不定芽長(zhǎng)至4-5cm時(shí)，將誘導(dǎo)生成的不定芽切下，在增殖培養(yǎng)基(ms+30g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂+0.5mg/l6-芐氨基嘌呤+0.01mg/l萘乙酸+0.01mg/l赤霉素+0.5g/l活性炭，ph5.6)中進(jìn)行培養(yǎng)，15天繼代一次，增殖培養(yǎng)條件為22℃/白天，20℃/黑夜，12h/白天，12h/黑夜，光照強(qiáng)度為3300lux。

待月季組培苗培養(yǎng)至5-6cm后，切成單芽置于生根培養(yǎng)基(1/2ms+25g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂+0.2mg/l萘乙酸+0.1mg/l吲哚丁酸+0.5g/l活性炭，ph5.6)中，于20℃/白天，18℃/黑夜，16h/白天，8h/黑夜，光照強(qiáng)度4500lux條件下培養(yǎng)。

本方法有效解決了月季組織培養(yǎng)褐化率高的問題，改善月季組培苗各生長(zhǎng)階段的關(guān)鍵步驟，有效地將月季組培苗褐化率降到10％以下，對(duì)月季產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。