本發(fā)明涉及牛卵母細(xì)胞超低溫冷凍技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種調(diào)控玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中鈣離子濃度的方法。

背景技術(shù)：

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的冷凍保存是保護(hù)物種資源多樣性和拯救瀕危動(dòng)物的有效手段，也可以為體外受精、單精子注射和體細(xì)胞核移植等胚胎生物技術(shù)提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料，使卵母細(xì)胞的供給和使用不受時(shí)間和空間的限制。因此，卵母細(xì)胞的冷凍保存具有非常重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值，一直是低溫生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。目前，由于玻璃化冷凍具有降溫速度快、冷凍損傷低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為卵母細(xì)胞冷凍保存的有效手段(larmanandgardner,2014)。

盡管哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍保存取得很大進(jìn)展(vajtaetal.,1998；dinnyésetal.,2000；houetal.,2005；zhaoetal.,2011)，但其仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了畜牧業(yè)生產(chǎn)和胚胎生物技術(shù)快速發(fā)展的需要。究其原因，主要是由于玻璃化冷凍能引起卵母細(xì)胞中ca²⁺濃度異常升高，進(jìn)而導(dǎo)致皮質(zhì)顆粒的提前釋放，透明帶硬化，受精率降低(larmaneta1.,2006,2007；tianetal.,2007；boglioloetal.,2012；nikiforakietal.,2014)，嚴(yán)重影響了玻璃化冷凍卵母細(xì)胞應(yīng)用范圍。目前，玻璃化冷凍引起卵母細(xì)胞中ca²⁺濃度升高的機(jī)制還不十分清楚，更缺乏能夠有效調(diào)控玻璃化冷凍卵母細(xì)胞中ca²⁺濃度，提高玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞受精能力的有效措施。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種有效調(diào)控玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中鈣離子濃度的方法，進(jìn)而提高玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞的體外受精及發(fā)育能力。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于牛卵母細(xì)胞冷凍保存的玻璃化冷凍液，所述冷凍液中含有5-20μmbapta-am(鈣螯合劑)和0.5-2μmrr(線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，釕紅)，用edfsf40液配制。其中，所述edfsf40液由eg(乙二醇)、dmso(二甲基亞砜)和fsf液按照體積比2﹕2﹕6組成。fsf液為含有30w/v％聚蔗糖70(ficoll70)、0.5m蔗糖和20％fbs(胎牛血清)的dpbs溶液，不含鈣鎂。

優(yōu)選地，本發(fā)明的玻璃化冷凍液中bapta-am的濃度為5μm、10μm、20μm，rr的濃度為0.5μm、1μm、2μm。更優(yōu)選地，bapta-am的濃度為10μm，rr的濃度為1μm。

本發(fā)明還提供一種用于牛卵母細(xì)胞冷凍保存的試劑組合，包括體外成熟液、含bapta-am的體外成熟液、預(yù)處理液、玻璃化冷凍液、解凍液以及含rr的體外成熟液。

所述體外成熟液為含有10μg/mlfsh(卵泡刺激素)、10μg/mllh(黃體生成素)、1μg/ml雌二醇和10％fbs的m199培養(yǎng)液。

所述含bapta-am的體外成熟液為含有5-20μmbapta-am的體外成熟液。優(yōu)選地，bapta-am的濃度為5μm、10μm、20μm。更優(yōu)選地，bapta-am的濃度為10μm。

所述預(yù)處理液為含有10％eg和10％dmso的dpbs溶液(不含鈣鎂)。

所述解凍液為含有0.15-0.25m蔗糖的dpbs溶液(不含鈣鎂)。優(yōu)選地，所述解凍液為含有0.15m或0.25m蔗糖的dpbs溶液。

所述含rr的體外成熟液為含有0.5-2μmrr的體外成熟液。優(yōu)選地，rr的濃度為0.5μm、1μm、2μm。更優(yōu)選地，rr的濃度為1μm。

本發(fā)明還提供所述試劑組合在制備用于玻璃化冷凍保存牛卵母細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供bapta-am和rr在調(diào)控玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺、線粒體ca²⁺水平，提高玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞的卵裂率、囊胚率、受精及發(fā)育能力中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種調(diào)控玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中鈣離子濃度的方法，其是將體外成熟22h的牛卵母細(xì)胞置于含bapta-am的體外成熟液中孵育2h，然后采用ops法進(jìn)行冷凍，解凍后在含rr的體外成熟液中恢復(fù)30min。

所述方法包括以下步驟：

1)將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cocs)置于體外成熟液中培養(yǎng)22h，然后用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，收集mii期卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含bapta-am的體外成熟液中孵育2h；

2)將卵母細(xì)胞在預(yù)處理液中孵育30s，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中處理25s，然后裝入ops管中直接投入液氮中凍存；

3)解凍時(shí)，將ops管從液氮中取出，將裝有卵母細(xì)胞的部分迅速置于38.5℃含0.25m蔗糖的dpbs溶液中，用吸管將卵母細(xì)胞從ops管吹出放于38.5℃含0.25m蔗糖的dpbs溶液中1min，然后轉(zhuǎn)入38.5℃含0.15m蔗糖的dpbs溶液中5min，進(jìn)行解凍；

4)解凍后，將卵母細(xì)胞在含rr的體外成熟液中恢復(fù)30min。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：

s1、從屠宰場(chǎng)收集牛卵巢，保存于含75μg/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的35℃生理鹽水中2h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，從直徑為2-8mm的卵泡中抽出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，挑選至少有3層致密卵丘細(xì)胞的復(fù)合體清洗后用于體外成熟，約50個(gè)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體為一組置于盛有500μl體外成熟液、且表面覆蓋有礦物油的4孔板(即每500μl成熟液中含有約50個(gè)cocs)中，于38.5℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h，然后用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，收集mii期卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含bapta-am的體外成熟液中在38.5℃、5％co2的培養(yǎng)箱中孵育2h；

s2、將卵母細(xì)胞在預(yù)處理液中孵育30s，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中處理25s，然后裝入ops管中直接投入液氮中凍存；

s3、解凍時(shí)，將ops管從液氮中取出，將裝有卵母細(xì)胞的部分迅速置于38.5℃含0.25m蔗糖的dpbs溶液中，用吸管將卵母細(xì)胞從ops管吹出放于38.5℃含0.25m蔗糖的dpbs溶液中1min，然后轉(zhuǎn)入38.5℃含0.15m蔗糖的dpbs溶液中5min，進(jìn)行解凍；

s4、解凍后，將卵母細(xì)胞在含rr的體外成熟液中恢復(fù)30min。

本發(fā)明中采用的ops管為兩端開(kāi)口式塑料管(i.m.v，萊格勒，法國(guó))，管壁厚0.02mm，體積0.25ml；所述ops管的一端被人工拉細(xì)，用來(lái)盛放卵母細(xì)胞，拉細(xì)一端ops管的頂端外直徑為0.23mm。

研究表明，玻璃化冷凍會(huì)顯著性提高牛卵母細(xì)胞中胞內(nèi)ca²⁺水平、線粒體ca²⁺水平，rr、bapta-am處理能夠顯著降低冷凍卵母細(xì)胞中線粒體ca²⁺水平和胞內(nèi)ca²⁺水平，且與新鮮對(duì)照組無(wú)顯著性差異。進(jìn)一步研究表明，玻璃化冷凍會(huì)使牛卵母細(xì)胞中cg分布異常、atp含量減少。將牛卵母細(xì)胞采用含有1μmrr的玻璃化冷凍液冷凍、冷凍后在含有1μmrr的體外成熟液中恢復(fù)30min，能夠有效維持玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中線粒體ca²⁺水平、atp含量正常，進(jìn)而提供玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞孤雌激活后的發(fā)育能力。而將體外成熟22h的牛卵母細(xì)胞放入10μmbapta-am中孵育2h，然后采用含10μmbapta-am的玻璃化冷凍液進(jìn)行冷凍，能夠有效維持玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中胞內(nèi)ca²⁺水平、cg分布正常，進(jìn)而提高玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞體外受精后的卵裂率。最終，將體外成熟22h的牛卵母細(xì)胞放入10μmbapta-am孵育2h，然后采用含10μmbapta-am和1μmrr的玻璃化冷凍液進(jìn)行冷凍，解凍后在含1μmrr的體外成熟液中恢復(fù)30min，可使玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞的卵裂率、囊胚率、囊胚細(xì)胞數(shù)，以及體外受精能力、發(fā)育能力得到顯著性提高。

本發(fā)明提供的玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞方法具有操作簡(jiǎn)單，成本低，對(duì)卵母細(xì)胞無(wú)毒無(wú)害，能有效保護(hù)冷凍卵母細(xì)胞的線粒體功能及其發(fā)育能力，這對(duì)于拓展冷凍卵母細(xì)胞的應(yīng)用范圍，具有重要的理論和實(shí)際意義，將在牛卵母細(xì)胞超低溫冷凍研究領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中牛卵母細(xì)胞線粒體ca²⁺染色圖。其中，a：新鮮卵母細(xì)胞中線粒體ca²⁺水平；b：冷凍卵母細(xì)胞中線粒體ca²⁺水平。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中rr處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞線粒體ca²⁺的影響。其中，肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p＜0.05)。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中atp測(cè)量過(guò)程中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中rr處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞atp含量的影響。

圖5為本發(fā)明卵實(shí)施例1中卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺染色圖。其中，a：正常情況下牛卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺濃度較低；b：玻璃化冷凍卵母細(xì)胞中胞內(nèi)ca²⁺濃度顯著升高。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中玻璃化冷凍對(duì)牛卵母細(xì)胞中胞內(nèi)胞胞內(nèi)ca²⁺的影響。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中牛卵母細(xì)胞中cg的染色圖。其中，a：正常分布，cgs分布在胞質(zhì)皮質(zhì)區(qū)，呈環(huán)狀分布。箭頭：環(huán)狀分布；b：異常分布，胞質(zhì)中有大量分布，無(wú)環(huán)狀分布。bar＝20μm。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1中牛卵母細(xì)胞精子穿卵染色圖。其中，a：正常受精后形成雌、雄原核；b：異常受精后除雌、雄元原核外，還有未解聚的精子。bar＝20μm。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

本發(fā)明中m199培養(yǎng)液購(gòu)自gibcobrl公司(格蘭德島，紐約，美國(guó))，胎牛血清購(gòu)自gibcobrldivision公司(格蘭德島，紐約，美國(guó))。

實(shí)施例1rr、bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞體外受精能力的影響

1、卵母細(xì)胞的收集和體外成熟

牛卵母細(xì)胞從當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)收集，保存于含有75μg/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的35℃生理鹽水中2h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，從直徑為2-8mm的卵泡中抽出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，挑選至少有3層致密卵丘細(xì)胞的復(fù)合體清洗后用于體外成熟，50個(gè)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體為一組置于盛有500μl體外成熟液，且表面覆蓋有礦物油的4孔板中，于38.5℃5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)22-24h，然后用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，收集mii期卵母細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。。

體外成熟液：含有10μg/mlfsh、10μg/mllh、1μg/ml雌二醇和10％fbs的m199培養(yǎng)液。

2、ops管的制備

按照vajta等(1998)公開(kāi)的方法，稍作改進(jìn)制備ops管，0.25ml的塑料管(i.m.v，萊格勒，法國(guó))，高溫變軟后人工拉長(zhǎng)，用顯微控制儀測(cè)量使頂端外直徑為0.23mm，管壁厚約0.02mm。

3、預(yù)處理和玻璃化冷凍液

預(yù)處理液：含有10％eg和10％dmso的dpbs溶液(不含鈣鎂)。

用于配制玻璃化冷凍液的edfsf40液：eg、dmso和fsf液按體積比2﹕2﹕6混勻。其中，fsf液：含有30w/v％聚蔗糖70、0.5m蔗糖和20％fbs的dpbs溶液，不含鈣鎂。

解凍液：含有0.15m或0.25m蔗糖的dpbs溶液。

4、卵母細(xì)胞的冷凍與解凍

卵母細(xì)胞在預(yù)處理液中孵育30s轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中處理25s，然后裝入ops管中直接投入液氮中凍存。

解凍時(shí)，將ops管從液氮中取出，將裝有卵母細(xì)胞的部分迅速溶于38.5℃含0.25m蔗糖的dpbs溶液中，用口吸管將卵母細(xì)胞從ops管吹出放于38.5℃含0.25m蔗糖的dpbs溶液中1min，然后轉(zhuǎn)入38.5℃含0.15m蔗糖的dpbs溶液中5min。觀察卵母細(xì)胞膜和透明帶的完整性判斷其存活情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)挑選存活的卵母細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5、胞質(zhì)ca²⁺水平檢測(cè)

將卵母細(xì)胞置于10μmfluo-3/am中在38.5℃下孵育45min，然后用dbps/bsa液洗滌，最后在熒光顯微鏡下觀察。利用nikonez-c1freeviewer分析熒光強(qiáng)度來(lái)反映胞質(zhì)內(nèi)ca²⁺的水平。所有操作均需在暗室中進(jìn)行。

6、線粒體鈣ca²⁺濃度測(cè)定

線粒體鈣檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)杰美公司。線粒體ca²⁺濃度測(cè)定步驟如下：體外成熟液清洗卵母細(xì)胞3次，取300μla液放入1.5ml離心管中，并加入30μl染色液制成染色工作液；將清洗后的卵母細(xì)胞放入染色工作液中，室溫(25℃)避光孵育30min，再放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min；用體外成熟液洗去細(xì)胞表面殘余染色工作液，即刻封片后在激光共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，激發(fā)波長(zhǎng)550nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm，線粒體ca²⁺呈現(xiàn)紅色。采用圖像分析軟件(ez-c1freeviewer)進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析。

7、atp含量分析

采用vanblerkom等公開(kāi)的方法，稍作改進(jìn)分析atp數(shù)目，利用atp依賴性熒光素-熒光素酶，進(jìn)行生物熒光分析(atp生物熒光分析，kithsii瑞士羅氏診斷股份有限公司，曼海姆，德國(guó))，測(cè)定熒光產(chǎn)生量定量測(cè)定atp數(shù)目。

將20μl細(xì)胞裂解試劑加到有20個(gè)卵母細(xì)胞的0.5ml離心管中，吹打混勻使這些細(xì)胞均勻地溶解。溶液中atp的濃度從0.01pm升至10.0pm，每個(gè)濃度分析一次，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。atp待測(cè)液放到96孔板中平衡3-5min，隨后分析標(biāo)準(zhǔn)液和樣品發(fā)出的光，用光度計(jì)(infinitem200，tecan集團(tuán)有限公司，奧地利)10s內(nèi)即可測(cè)得。用連續(xù)稀釋液的相對(duì)光強(qiáng)度繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可看出樣品atp的濃度。

8、精子穿卵檢測(cè)

精子穿卵檢測(cè)：卵母細(xì)胞在含有精子的受精液中孵育12h后，在50μl0.1％的透明質(zhì)酸酶中用口吸管吹打精子脫除干凈。卵母細(xì)胞在固定液中4℃固定48h，用h33342染色9min，用脫色液脫去染色液，用指甲油封片。在相差顯微鏡測(cè)定細(xì)胞核狀態(tài)。

9、體外受精

體外受精：凍精37℃水浴解凍，解凍后置于7ml洗精液中，輕輕混勻，1800rpm離心5min2次。離心后吸去上清，用受精液調(diào)整精子密度為5×10⁶個(gè)/ml。吸取20μl精液加入含有20枚卵母細(xì)胞的80μl受精液中，在38.5℃、5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外受精。受精18-20h后，置于cr1aa中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后更換培養(yǎng)液(含10％fbs的cr1aa)。體外培養(yǎng)7d后，獲得體外受精囊胚。

10、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺水平、cg分布和體外受精能力的影響

在cocs體外成熟過(guò)程中，在第22h時(shí)將其用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，選擇胞質(zhì)均勻的mii期卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞分別移至含5μm、10μm、20μmbapta-am的體外成熟液中繼續(xù)培養(yǎng)2h，而后分別用含5μm、10μm、20μmbapta-am的冷凍液進(jìn)行玻璃化冷凍(先將卵母細(xì)胞在預(yù)處理液中孵育30s，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中處理25s，然后裝入ops管中直接投入液氮中凍存)，解凍后恢復(fù)30min，分別進(jìn)行牛卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺水平、cg分布和精子穿卵能力、體外受精胚胎發(fā)育能力的檢測(cè)。進(jìn)而研究bapta-am處理對(duì)牛卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺、cg分布和體外受精能力的影響。

(2)rr處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中線粒體ca²⁺水平、atp含量和孤雌激活發(fā)育能力的影響

在cocs體外成熟24h后用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，選擇胞質(zhì)均勻的mii期卵母細(xì)胞，分別用含0.5μm、1μm、2μmrr的冷凍液進(jìn)行玻璃化冷凍(先將卵母細(xì)胞在預(yù)處理液中孵育30s，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中處理25s，然后裝入ops管中直接投入液氮中凍存)，解凍后分別在含0.5μm、1μm、2μmrr的體外成熟液中恢復(fù)30min，進(jìn)而研究rr處理對(duì)線粒體ca²⁺水平、atp含量和孤雌激活發(fā)育能力的影響。

(3)rr與bapta-am聯(lián)合處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞體外受精能力的影響

在cocs體外成熟過(guò)程中，在第22h時(shí)將其用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，選擇胞質(zhì)均勻的mii期卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞移入含有10μmbapta-am的體外成熟液中繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后用含有10μmbapta-am和1μmrr的玻璃化冷凍液進(jìn)行冷凍，解凍后放入含有1μmrr的體外成熟液中恢復(fù)30min，然后分別進(jìn)行牛卵母細(xì)胞體外受精能力的檢測(cè)。

13、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用sas軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，百分?jǐn)?shù)比較時(shí)經(jīng)反正旋轉(zhuǎn)化后采用方差分析，結(jié)果以平均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差表示，p<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。各處理組至少重復(fù)3次以上。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

(一)rr處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中線粒體ca²⁺水平的影響

(1)不同濃度rr處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中線粒體ca²⁺水平的影響

牛卵母細(xì)胞線粒體ca²⁺染色圖片見(jiàn)圖1，新鮮牛卵母細(xì)胞(圖1a)中線粒體ca²⁺濃度較低，而玻璃化冷凍對(duì)照組卵母細(xì)胞(圖1b)中線粒體ca²⁺濃度較高。如圖2所示，玻璃化冷凍組牛卵母細(xì)胞線粒體ca²⁺水平顯著高于新鮮組(p＜0.05)；rr處理組線粒體ca²⁺水平均顯著低于玻璃化冷凍組(p＜0.05)，其中0.5μm和1μm處理組仍顯著高于新鮮組(p＜0.05)，而2μm組與新鮮組差異不顯著(p>0.05)。

(2)rr處理對(duì)解凍后牛卵母細(xì)胞atp含量的影響

atp含量測(cè)定過(guò)程中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，所得標(biāo)準(zhǔn)方程為：y＝0.0049x+0.2133，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r²)為0.9991。樣品值除以樣品數(shù)，即為每個(gè)卵母細(xì)胞中atp含量。如圖4所示，玻璃化冷凍顯著降低了牛卵母細(xì)胞中atp含量(p＜0.05)，rr處理組atp含量顯著低于新鮮對(duì)照組(p＜0.05)，但顯著高于冷凍對(duì)照組(p＜0.05)，且各處理組之間相互存在顯著性差異(p＜0.05)。

(3)rr處理對(duì)解凍后牛卵母細(xì)胞孤雌激活發(fā)育潛力的影響

如表1所示，卵母細(xì)胞孤雌激活后玻璃化冷凍組的卵裂率(72.22％)、囊胚率(23.08％)顯著低于新鮮對(duì)照組(84.30％，41.18％；p＜0.05)，1μmrr處理組卵裂率(88.20％)、囊胚率(42.25％)與新鮮對(duì)照組(84.30％，41.18％)相比無(wú)顯著性差異、但顯著高于0.5μmrr處理組(77.18％，27.83％)。1μmrr處理組卵裂率(88.20％)顯著性高于2μmrr處理組(79.29％)、但囊胚率兩組(42.25％vs.34.23％)之間無(wú)顯著性差異。1μmrr處理效果高于2μmrr，原因可能是由于2μmrr濃度較高，進(jìn)而產(chǎn)生的毒性作用所致。

表1rr處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的影響

注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p＜0.05)。

(二)bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺水平、cg分布和體外受精能力的影響

(1)bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺和cg分布的影響

卵母細(xì)胞中胞內(nèi)ca²⁺的染色如圖5所示，正常情況下牛卵母細(xì)胞胞內(nèi)ca²⁺濃度較低(圖5a)，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞中胞內(nèi)ca²⁺濃度顯著升高(圖5b)。如圖6所示，新鮮對(duì)照組胞內(nèi)ca²⁺濃度顯著性低于玻璃化冷凍對(duì)照組，bapta-am各組胞內(nèi)ca²⁺水平均顯著低于玻璃化冷凍組(p＜0.05)，其中5μm處理組仍顯著高于新鮮組(p＜0.05)，而10μm、20μm處理組與新鮮組差異不顯著(p>0.05)。

卵母細(xì)胞cg的染色如圖7示，正常情況下cg分布在胞質(zhì)皮質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)環(huán)狀分布(圖7a)，異常情況下cg從皮質(zhì)區(qū)提前釋放進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)(圖7b)。如表2所示，玻璃化冷凍組cg正常分布率(56.25％)顯著性低于新鮮對(duì)照組(86.11％)，bapta-am處理后cg正常分布率均顯著提升(65.85％，75.56％，84.21％，86.11％)，且10μmbapta-am冷凍組(75.56％)、20μmbapta-am冷凍組(84.21％)cg正常分布率與新鮮對(duì)照組(86.11％)無(wú)顯著性差異。

表2bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞cg分布的影響

注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p＜0.05)。

(2)bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞精子穿卵能力的影響

精子穿卵染色如圖8所示，正常受精后卵母細(xì)胞中形成雌、雄原核(圖8a)，異常受精后卵母細(xì)胞中除雌、雄原核外，還有未解聚的精子(圖8b)。如表3所示，玻璃化冷凍組正常受精率(60％)顯著低于新鮮對(duì)照組(87.5％；p＜0.05)，10μmrr冷凍組正常受精率(84.85％)顯著高于5μmrr冷凍組(63.33％)和20μmrr冷凍組(70.97％)，且與新鮮對(duì)照組(87.5％)無(wú)顯著性差異。

表3bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞體外受精能力的影響

注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p＜0.05)。

(3)bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞體外受精效率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，冷凍對(duì)照組體外受精卵裂率(41.63％)、囊胚率(12.37％)顯著低于新鮮對(duì)照組(75％，34.09％)。rr處理組中，10μmrr冷凍組卵裂率(65.73％)顯著高于冷凍對(duì)照組(41.63％)、5μmrr冷凍組(52.54％)、20μmrr冷凍組(49.73％)，但與新鮮對(duì)照組(75％)無(wú)顯著性差異。各組之間囊胚率無(wú)顯著性差異(11.96％-15.71％)、均顯著性低于新鮮對(duì)照組(34.09％)。

表4bapta-am處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞體外受精能力的影響

注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p＜0.05)。

(三)rr與bapta-am聯(lián)合處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞體外受精能力的影響

經(jīng)過(guò)rr、bapta-am前期實(shí)驗(yàn)，確定1μmrr和10μmbapta-am進(jìn)行聯(lián)合處理實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，冷凍對(duì)照組的卵裂率(58.24％)、囊胚率(10.53％)顯著低于新鮮對(duì)照組(83.55％，34.72％；p＜0.05)，rr、bapta-am聯(lián)合處理組的卵裂率(79.42％)、囊胚率(29.09％)顯著性高于冷凍對(duì)照組(58.24％％，10.53％％；p＜0.05)

表5rr與bapta-am聯(lián)合處理對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞體外受精效率的影響

注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p＜0.05)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

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