本發(fā)明涉及一種細(xì)胞凍存液，尤其涉及一種直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液及其應(yīng)用方法。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：癌癥是困擾人類健康的首要問(wèn)題，細(xì)胞免疫治療為腫瘤的預(yù)防和治療提供了廣闊的前景。但是在臨床實(shí)際應(yīng)用的過(guò)程中，存在部分腫瘤患者自身免疫細(xì)胞難以采集、細(xì)胞擴(kuò)增能力差、免疫細(xì)胞與其它治療方式的時(shí)間窗口難以配合等諸多問(wèn)題；此外，從藥物研發(fā)和生產(chǎn)的角度，新鮮免疫細(xì)胞的異地運(yùn)輸、保存條件和存活時(shí)間都受到一定限制。所以，免疫細(xì)胞的有效凍存為免疫細(xì)胞作為藥物進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)技術(shù)保障。但是，目前市面上的免疫細(xì)胞凍存液多以胎牛血清、高比例DMSO、患者自體血漿、非臨床應(yīng)用級(jí)試劑配制而成，這些凍存液存在以下問(wèn)題：1.凍存效果差；2.凍存液成分不明確；3.凍存過(guò)程和后續(xù)應(yīng)用程序相對(duì)繁瑣；4.成本過(guò)高；5.臨床應(yīng)用存在風(fēng)險(xiǎn)性；6.不適于形成產(chǎn)業(yè)化。例如：公開(kāi)號(hào)為CN104026118A的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種免疫細(xì)胞凍存液、其制備方法及應(yīng)用，該申請(qǐng)用二甲基亞砜、滅活的人自體血漿及免疫細(xì)胞培養(yǎng)基成分，通過(guò)程序降溫的方法凍存免疫細(xì)胞。其存在的技術(shù)問(wèn)題是該申請(qǐng)的凍存液所使用患者滅活的自體血漿，數(shù)量和來(lái)源有限，不適合細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后的大規(guī)模凍存，且凍存過(guò)程繁瑣，批次控制較難。公開(kāi)號(hào)為CN105248413A的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種CIK細(xì)胞凍存液，該申請(qǐng)使用二甲基亞砜、葡萄籽提取物、棉籽糖、人血白蛋白、胎牛血清凍存CIK細(xì)胞。其存在的技術(shù)問(wèn)題是該申請(qǐng)的凍存液含有動(dòng)物源性血清，有動(dòng)物源性抗原物質(zhì)的引入的潛在風(fēng)險(xiǎn)，不能用于人體直接回輸。公開(kāi)號(hào)為CN105211051A的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種培養(yǎng)后的NK細(xì)胞的凍存液及其制備方法，該申請(qǐng)用二甲基亞砜、滅活的人自體血漿，添加葡萄籽提取物、茶多酚和維生素C作為凍存液的成分。其存在的技術(shù)問(wèn)題是該申請(qǐng)的凍存液所使用患者自體滅活血漿，數(shù)量和來(lái)源有限，不適合細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后的大規(guī)模凍存。公開(kāi)號(hào)為CN105123671A的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種細(xì)胞凍存液、應(yīng)用及免疫細(xì)胞凍存方法，該申請(qǐng)用二甲基亞砜、丙二醇、細(xì)胞培養(yǎng)基、人血白蛋白，添加非必需氨基酸、海藻糖、香菇多糖、維生素C作為凍存液的成分。其存在的技術(shù)問(wèn)題是該申請(qǐng)?jiān)搩龃嬉褐饕煞譃榧?xì)胞培養(yǎng)基，不具有穩(wěn)定劑的作用，不可直接用于臨床回輸。公開(kāi)號(hào)為CN104862275A的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的方法及其制備的細(xì)胞制劑，該申請(qǐng)用二甲基亞砜、1640細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、右旋糖酐，ddH2O作為凍存液的成分。其存在的技術(shù)問(wèn)題是該申請(qǐng)的凍存液含有動(dòng)物源性血清，有動(dòng)物源性抗原物質(zhì)的引入的潛在風(fēng)險(xiǎn)，不能用于人體直接回輸。綜上所述，現(xiàn)有凍存液有效成分多含有科研級(jí)別的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清等成分，不能直接應(yīng)用于人體輸注，且價(jià)格不菲。因此有必要研究一種凍存效果更好、價(jià)格更低廉、使用更方便、應(yīng)用更安全的免疫細(xì)胞凍存液。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的凍存效果差、凍存液成分不明確、凍存過(guò)程和后續(xù)應(yīng)用程序相對(duì)繁瑣、成本過(guò)高、臨床應(yīng)用存在風(fēng)險(xiǎn)性、不適合規(guī)?；a(chǎn)等缺陷，提供一種直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液及其應(yīng)用方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：本發(fā)明的一種直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液，其由A液和B液組成，其中，所述的A液含有以下各成分：二甲基亞砜4-16v/v％，羥乙基淀粉0.3-5.5w/v％，右旋糖酐0.3-5.5w/v％，葡萄糖0.5-5w/v％，肝素鈉1-1000U/ml，其余為醫(yī)用注射液；所述的B液為含有2-25w/v％人血白蛋白的醫(yī)用注射液。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，A液中各成分的含量為：二甲基亞砜8.3v/v％，羥乙基淀粉2.75w/v％，右旋糖酐2.75w/v％，葡萄糖2.29w/v％，肝素鈉625U/ml，其余為醫(yī)用注射液；所述的B液為含有20w/v％人血白蛋白的醫(yī)用注射液。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的醫(yī)用注射液包括但不限于：無(wú)菌注射用水、生理鹽水、電解質(zhì)注射液、右旋糖酐注射液或羥乙基淀粉氯化鈉注射液中的一種或兩種以上。用于制備本發(fā)明所述凍存液的原料可以是原料藥或是經(jīng)溶液配制而成的藥品成品。例如羥乙基淀粉可以是羥乙基淀粉氯化鈉注射液，右旋糖酐、葡萄糖可以是右旋糖酐40葡萄糖注射液，肝素鈉可以為肝素鈉注射液。只要其有效成分的終濃度滿足上述要求即可。本發(fā)明通過(guò)二甲基亞砜、人血白蛋白、右旋糖酐、羥乙基淀粉、肝素鈉的優(yōu)化配比，均采用臨床藥用級(jí)別的原料，用醫(yī)用注射液配制而成。一方面避免了動(dòng)物源性物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)，另一方面，免疫細(xì)胞凍存效果較常規(guī)凍存液更好。從而保證了臨床使用的安全性和有效性。此外，本方法操作簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模凍存的實(shí)施，細(xì)胞復(fù)蘇后可直接輸注，便于臨床的實(shí)施。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了以上任一項(xiàng)所述的凍存液在凍存免疫細(xì)胞中的應(yīng)用。其中，優(yōu)選的，所述的免疫細(xì)胞包括但不限于：T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、DC細(xì)胞、γδT細(xì)胞、CAR-T細(xì)胞。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種體外凍存免疫細(xì)胞的方法，包括以下步驟：1)將本發(fā)明所述的凍存液的A液和B液按體積比3:2混勻，置于4℃冰箱預(yù)冷；2)收集需要凍存的免疫細(xì)胞，洗滌兩遍；3)用預(yù)冷的凍存液重懸免疫細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至凍存袋中，置于4℃冰箱平衡或若步驟3)的操作時(shí)間已長(zhǎng)于30min可跳過(guò)平衡步驟直接進(jìn)行步驟4)；4)將裝有細(xì)胞的凍存袋置于-80℃冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至液氮罐長(zhǎng)期保存。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，凍存的免疫細(xì)胞使用時(shí)，從液氮罐中迅速取出凍存袋，置于37℃水浴至完全融化，解凍后在1小時(shí)內(nèi)完成靜脈輸注。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，4℃冰箱平衡的時(shí)間為1-30min,。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的免疫細(xì)胞包括但不限于：T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、DC細(xì)胞、γδT細(xì)胞、CAR-T細(xì)胞。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的免疫細(xì)胞凍存密度為1×106/ml-1×108/ml。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的凍存效果差、凍存液成分不明確、凍存過(guò)程和后續(xù)應(yīng)用程序相對(duì)繁瑣、成本過(guò)高、臨床應(yīng)用存在風(fēng)險(xiǎn)性、不適合規(guī)模化生產(chǎn)等缺陷，提供了一種直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液及應(yīng)用方法。和常規(guī)凍存方法相比：1.該方法復(fù)蘇后的免疫細(xì)胞與新鮮培養(yǎng)的免疫細(xì)胞相比，其免疫生物學(xué)特性(細(xì)胞活力、凋亡水平、免疫表型等)和生物學(xué)功能(對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果、細(xì)胞因子分泌水平等)無(wú)顯著差異；2.本發(fā)明的凍存液原料明確，無(wú)動(dòng)物源成分，且均為臨床藥用級(jí)，具備臨床應(yīng)用安全性；3.不使用患者自體血漿，原料數(shù)量和來(lái)源不受限且成本低，適合形成產(chǎn)業(yè)化；4.凍存液通過(guò)組份儲(chǔ)存方式，存儲(chǔ)穩(wěn)定性好；5.DMSO含量相對(duì)較低，且通過(guò)凍存液的預(yù)冷降低凍存液中DMSO的細(xì)胞毒性；6.免疫細(xì)胞凍存過(guò)程無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間程序降溫；7.復(fù)蘇后無(wú)需常規(guī)離心清洗步驟，可直接進(jìn)行靜脈回輸，極大的方便了臨床應(yīng)用。綜上，本發(fā)明摒棄了常規(guī)凍存液中不適用于臨床的成份，選用臨床常用的藥物經(jīng)過(guò)科學(xué)的配比制成凍存液，且用科學(xué)的儲(chǔ)存方式簡(jiǎn)化凍存液配制操作，再通過(guò)優(yōu)化的凍存方法簡(jiǎn)化操作步驟、提升凍存效果，為免疫細(xì)胞治療的實(shí)施提供了基本的保障。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明不僅安全性高，不含有潛在致病風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物源性血清，通過(guò)兩種組份可以長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。并且該凍存方法簡(jiǎn)便易行，能夠適用于臨床大規(guī)模操作的要求，且凍存效果優(yōu)于常規(guī)凍存方法，細(xì)胞復(fù)蘇后可以直接輸注，減少了中間繁瑣的處理環(huán)節(jié)和洗滌對(duì)細(xì)胞的損傷。且原料成本低，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1：直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液的制備及應(yīng)用1、所用原料及規(guī)格羥乙基淀粉氯化鈉注射液：500ml:羥乙基淀粉(200/0.5)30g右旋糖酐40葡萄糖注射液：500ml:30g右旋糖酐40與25g葡萄糖肝素鈉注射液：2ml:1.25萬(wàn)單位人血白蛋白注射液：50ml：10g總蛋白2、直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液的制備及應(yīng)用1)分別配制A液和B液A液(100ml)：8.3ml二甲基亞砜+45.8ml羥乙基淀粉氯化鈉注射液+45.8ml右旋糖酐40葡萄糖注射液+0.1ml肝素鈉注射液。A液中各成分的含量為：二甲基亞砜8.3v/v％，羥乙基淀粉2.75w/v％，右旋糖酐2.75w/v％，葡萄糖2.29w/v％，肝素鈉625U/ml，其余為醫(yī)用注射液。B液(100ml)：20w/v％人血白蛋白的注射液。2)將A液與B液按體積比3:2混勻，置于4℃冰箱待用。3)抽取健康志愿者外周血50ml，緩慢加入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，500g離心20分鐘，吸取白膜層細(xì)胞。用PBS洗滌兩遍，計(jì)數(shù)。4)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用2)中配制好、預(yù)冷的凍存液重懸PBMC細(xì)胞，使得細(xì)胞密度在1×107/ml，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存袋。5)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置4℃冰箱平衡15min。6)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置-80℃冰箱過(guò)夜。6)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置液氮保存。7)1、6、12個(gè)月后從液氮罐取出細(xì)胞，置于37℃水浴鍋解凍，取少量細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活率。同時(shí)采用對(duì)照凍存液(50％FBS+40％RPMI1640+10％DMSO)處理的PBMC細(xì)胞作為對(duì)照，除凍存液外，其他步驟同上。3、結(jié)果采用不同凍存液的PBMC復(fù)蘇活率比較如表1所示：表1采用不同凍存液的PBMC復(fù)蘇活率比較本發(fā)明的凍存液對(duì)照凍存液1個(gè)月活率98.5％87.1％6個(gè)月活率96.2％85.4％12個(gè)月活率93.7％80.7％實(shí)施例2:直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液的制備及應(yīng)用1、所用原料及規(guī)格羥乙基淀粉氯化鈉注射液：500ml:羥乙基淀粉(200/0.5)30g右旋糖酐40葡萄糖注射液：500ml:30g右旋糖酐40與25g葡萄糖肝素鈉注射液：2ml:1.25萬(wàn)單位人血白蛋白注射液：50ml：5g總蛋白2、直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液的制備及應(yīng)用1)分別配制A液和B液A液(100ml)：10ml二甲基亞砜+70ml羥乙基淀粉氯化鈉注射液+19.9ml右旋糖酐40葡萄糖注射液+0.1ml肝素鈉注射液A液中各成分的含量為：二甲基亞砜10v/v％，羥乙基淀粉4.2w/v％，右旋糖酐1.19w/v％，葡萄糖1.0w/v％，肝素鈉625U/ml，其余為醫(yī)用注射液；B液(100ml)：10w/v％的人血白蛋白注射液2)將A液與B液按照體積比3:2混勻，置于4℃冰箱待用。3)取培養(yǎng)擴(kuò)增后的NK細(xì)胞至離心管中，300g離心10min。用PBS洗滌兩遍，計(jì)數(shù)。4)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用2)中配制好、預(yù)冷的凍存液重懸NK細(xì)胞，使得細(xì)胞密度在1×108/ml，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存袋。5)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置4度冰箱平衡15min。6)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置-80℃冰箱過(guò)夜。6)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置液氮保存。7)1、6、12個(gè)月后從液氮罐取出細(xì)胞，置于37℃水浴鍋解凍，取少量細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活率。同時(shí)采用對(duì)照凍存液(50％FBS+40％RPMI1640+10％DMSO)處理NK細(xì)胞作為對(duì)照，除凍存液外，其他步驟同上。3、結(jié)果采用不同凍存液的NK復(fù)蘇活率比較如表2所示：表2采用不同凍存液的NK細(xì)胞復(fù)蘇活率比較實(shí)施例2實(shí)施例2對(duì)照1個(gè)月活率96.4％82.6％6個(gè)月活率92.8％75.3％12個(gè)月活率90.5％60.2％實(shí)施例3:直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液的制備及應(yīng)用1、所用原料及規(guī)格羥乙基淀粉氯化鈉注射液：500ml:羥乙基淀粉(200/0.5)30g右旋糖酐40葡萄糖注射液：500ml:30g右旋糖酐40與25g葡萄糖肝素鈉注射液：2ml:1.25萬(wàn)單位。人血白蛋白注射液：50ml：5g總蛋白2、直接靜脈回輸?shù)拿庖呒?xì)胞凍存液的制備及應(yīng)用1)分別配制A液和B液A液(100ml)：9ml二甲基亞砜+33ml羥乙基淀粉氯化鈉注射液+57.9ml右旋糖酐葡萄糖注射液+0.1ml肝素鈉注射液。A液中各成分的含量為：二甲基亞砜9v/v％，羥乙基淀粉1.98w/v％，右旋糖酐3.47w/v％，葡萄糖2.9w/v％，肝素鈉625U/ml，其余為醫(yī)用注射液；B液(100ml)：10w/v％的人血白蛋白注射液。2)將A液與B液按3:2混勻，置于4℃冰箱待用。3)取培養(yǎng)擴(kuò)增后的CAR-T細(xì)胞至離心管中，300g離心10min。用PBS洗滌兩遍，計(jì)數(shù)。4)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用2)中配制好、預(yù)冷的凍存液重懸CAR-T細(xì)胞，使得細(xì)胞密度在5×107/ml，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存袋。5)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置4℃冰箱平衡15min。6)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置-80℃冰箱過(guò)夜。6)將裝有細(xì)胞的凍存袋放置液氮保存。7)1、6、12個(gè)月后從液氮罐取出細(xì)胞，置于37℃水浴鍋解凍，取少量細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活率。同時(shí)采用對(duì)照凍存液(50％FBS+40％RPMI1640+10％DMSO)處理的CAR-T細(xì)胞作為對(duì)照，除凍存液外，其他步驟同上。3、結(jié)果采用不同凍存液的CAR-T復(fù)蘇活率比較如表3所示：表3采用不同凍存液的CAR-T細(xì)胞復(fù)蘇活率比較實(shí)施例3實(shí)施例3對(duì)照1個(gè)月活率98.1％85.5％6個(gè)月活率96.7％80.5％12個(gè)月活率93.3％72.4％以上實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3