本發(fā)明涉及植物育種領域，具體涉及席草的多倍體誘導方法。
背景技術：
：席草(JuncuseffususL.)是極佳的天然綠色植物纖維之一，因此宜于編織，使用席草編織的各類產品具有通氣、吸濕、清涼的作用，特別是席草莖具有調節(jié)干濕的功能。夏季能保持適度的干燥，使人的皮膚感觸異常舒適，冬季保溫性能良好，因此席草編織品已成為人們日常生活中不可缺少的家庭日常用品，也是一種獨特的室內時尚裝飾品，深受廣大消費者喜愛。雖然現在各式各樣的塑料、化纖、竹子等編織品，花色繁多，但是席草編織品的眾多特性和優(yōu)點是其他產品無法所替代的。日本人喜用席草編織品作為室內裝飾和睡眠。據說有調節(jié)空氣，促進新陳代謝的作用。據我國明朝醫(yī)學家李時珍著的《本草綱目》及有關醫(yī)學書《本草從新》、《韓氏醫(yī)通》等記述：席草根莖可作藥用。有利尿、安眠、止血、治小兒夜啼等功效。席草的編織與一般布匹的生產方式相近，也是以經緯交織而成，用原色或染色的席草，再依編織程序卡的設計，但要生產出各種多樣優(yōu)雅美麗的席面，需要品質好、韌性度高的席草，長應在130cm左右，一草到底不拼接。近年來，席草連年采用分株繁殖，導致品種退化嚴重，一般長為100cm左右，最長僅120cm左右，而且莖韌性越來越差，容易斷裂。此外，在席草的多倍體誘變過程中發(fā)現，采用常用的多倍體誘變劑秋水仙素、二甲基亞砜、安磺靈及濃度等浸泡處理對席草的外植體毒害很大，致死率達到95％以上，導致多倍體誘變率低。本發(fā)明的目的是針對上述問題，利用席草組織培養(yǎng)和多倍體誘變的雙重優(yōu)勢，使再生植株染色體加倍，誘導產生多倍體席草來提高其產量和品質，克服席草長期分株種植中出現品種退化問題。技術實現要素：本發(fā)明的目的，結合席草的組織培養(yǎng)和多倍體誘變的雙重優(yōu)勢，提供一種在最短的時間獲得大量誘變試管苗的誘變方法，該方法具有穩(wěn)定性好、操作簡便、誘變效率高的優(yōu)點。本發(fā)明的目的是通過以下方式實現的：一種席草的多倍體誘導方法，包括以下步驟：(1)預處理：將席草無菌苗浸泡于多倍體誘導劑中處理，所述的多倍體誘導劑是含有已過濾滅菌的安磺靈0.1-0.5mg/L，優(yōu)選0.1mg/L的水溶液，浸泡處理時間為30-60min，優(yōu)選60min；(2)共培養(yǎng)：將步驟(1)浸泡處理后的無菌苗取出，放置無菌濾紙上晾干后直接接種到包含安磺靈的增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(3)多倍體鑒定：選擇步驟(2)培養(yǎng)獲得的且表型變異明顯的植株進行生根，然后取變異苗根尖包含有分生區(qū)部位的部分，進行染色體核型鑒定；染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體；(4)移栽管理：將鑒定為四倍體的植株，打開瓶蓋煉苗，取出清洗根部培養(yǎng)基，隨后將幼苗直接移栽至水田。步驟(1)預處理是將0.5-1.0cm高的席草無菌苗浸泡于多倍體誘導劑中處理。步驟(1)處理溫度為4-25℃，優(yōu)選4℃。步驟(2)共培養(yǎng)是將步驟(1)浸泡處理后的無菌苗取出，放置無菌濾紙上晾干后直接接種到包含0.01-0.05mg/L,優(yōu)選0.03mg/L安磺靈的增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。步驟(2)共培養(yǎng)是25℃，光照培養(yǎng)30-60d，優(yōu)選60d，每天光照10小時，光照強度1000lx。步驟(2)的增殖培養(yǎng)基配方為1/2MS+6-BA1.2～4.5mg/L的瓊脂固體培養(yǎng)基，優(yōu)選1/2MS+6-BA3.5mg/L或者1/2MS+6-BA4.0mg/L。步驟(3)的生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS+6-BA1.2～4.5mg/L+NAA0.02～1.0mg/L+IAA0.02～1.0mg/L+多效唑0.5～5.0mg/L的瓊脂固體培養(yǎng)基；優(yōu)選1/2MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.6mg/L+IAA0.5mg/L+多效唑3.0mg/L或者1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+IAA0.4mg/L+多效唑4.0mg/L。步驟(4)移栽管理是將鑒定為四倍體的植株，打開瓶蓋煉苗3-5d，取出清洗根部培養(yǎng)基，隨后將幼苗直接移栽至水田。在上述試驗的多個處理中，誘導率最高組合為0.1mg/L安磺靈溶液在4℃冰箱中預處理60min，然后將其接種到包含0.03mg/L安磺靈的增殖培養(yǎng)基上共培養(yǎng)60d，致死率為55.6％,四倍體誘導率為41.2％，二倍體與四倍體嵌合體誘導率達到46.26％，僅少量誘變苗為二倍體植株。本發(fā)明具有如下的優(yōu)點和效果：1、本發(fā)明選擇無菌苗為外植體，穩(wěn)定性好、操作簡便，取材容易，不需經過體外消毒，恢復期短，抵抗誘變劑的毒害作用強；2、常規(guī)浸泡誘變處理，對外植體的毒害作用強，致死率高達95％以上，甚至達到100％，而且誘變率為0；本發(fā)明采用短時間浸泡處理，再結合低濃度誘變劑共培養(yǎng)，能在短時間內獲得大量成活試管苗，致死率最低在10％以下；最佳處理組合在半致死條件下獲得的試管苗，表型變異明顯；經核型分析發(fā)現，四倍體誘導率達到41.2％，二倍體和四倍體嵌合體誘導率達到46.26％，將近90％的試管苗發(fā)生變異；本發(fā)明大大提高了誘變效率，而且節(jié)省了大量誘變探索時間；3、本發(fā)明選擇安磺靈為誘變劑，價格比秋水仙素低800-900元/g，大大降低了誘變成本；選擇4℃低溫處理，大大降低誘變劑對外植體的毒害作用，能獲得較多誘變成活的試管苗；4、本發(fā)明選擇二倍體植株為對照；兩者移栽條件一致，種苗為多倍體的植株相比于對照莖色濃綠，鮮草直徑相對較粗、草莖較長，頂草長，分蘗數多，根粗而長，尤其是草莖長平均達到138.67cm，超過了優(yōu)質產品的標準。5、本發(fā)明根據生產需要設計培養(yǎng)方法，首先將無菌苗誘導大量分蘗芽，抑制根的形成，提高增殖倍數，加快基礎苗的繁殖，增殖倍數達到7-10；每瓶獲得有效苗70株以上，大大提高了培養(yǎng)效率，節(jié)約了生產成本。6、批量化生產階段同步誘導分蘗芽、不定根，增殖與生根簡化為一步完成，即“一步成苗”方法，形成完整植株只需30d左右，節(jié)約了30d左右的生根時間。附圖說明圖1為對照例2安磺靈浸泡處理后的苗長勢情況；圖2為致死率低，表型變異不明顯的苗長勢情況；圖3為最佳處理組合在半致死條件下，表型變異明顯的苗長勢情況；圖4為對照株(左)與誘變株(右)試管苗生長情況；圖5為席草二倍體(2×)染色體核型圖(1000×)；圖6為席草四倍體(4×)染色體核型圖(1000×)；圖7為二倍體(左)與四倍體(右)大田苗的生長情況。具體實施方式下面結合實施例進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實施例1：1、多倍體的誘變與增殖生根：取席草(JuncuseffususL.)無菌苗，清洗根部的瓊脂，放置無菌空瓶中，浸泡于誘變劑中，誘變劑成分包含0.1mg/L、0.5mg/L安磺靈混合溶液中，處理溫度4℃、25℃，處理時間為30min、60min，設置3次重復；將無菌苗取出放置無菌濾紙上吸干水分，接種到包含誘變劑的增殖培養(yǎng)基上，誘變劑成分包含0.01mg/L、0.03mg/L、0.05mg/L安磺靈，25℃左右光照培養(yǎng)30d、60d，設置3次重復；2、多倍體鑒定：為了減少染色體數目檢測的工作量，將表型變異明顯的植株接種到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。然后切取植株根尖包含有分生區(qū)部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。3、將鑒定為四倍體的植株，打開瓶蓋煉苗3-5d，取出清洗根部培養(yǎng)基，隨后將幼苗直接移栽至水田。4、結果表明本發(fā)明實驗方法誘變處理后的外植體培養(yǎng)20d左右，恢復生長，一般從分蘗芽基部逐漸長出新芽，但隨處理濃度和時間的升高，致死率和誘變率隨之升高；低濃度低溫短時間預處理，結合低濃度短時間共培養(yǎng)處理的苗生長恢復期短，增殖率高，致死率在10％以下，但表型變異率低；對照例2安磺靈浸泡處理后的苗長勢情況如圖1所示，大部分都黃化死亡；致死率低，表型變異不明顯的苗長勢情況如圖2所示，大部分能夠保持生長；反之，苗生長恢復期長，尤其是25℃條件下浸泡處理，致死率大幅度升高；本發(fā)明多個處理中最佳組合為0.1mg/L安磺靈溶液在4℃冰箱中預處理60min，然后將其接種到包含0.03mg/L安磺靈的增殖培養(yǎng)基上共培養(yǎng)60d，恢復期較快，表型變異率達到80％以上，致死率為55.6％；最佳處理組合在半致死條件下，表型變異明顯的苗長勢情況如圖3所示，幾乎一半能夠存活生長，而且表型變異明顯；二倍體與變異植株試管苗的生長情況如圖4所示，變異株明顯長勢強。表1安磺靈誘變效果(2)染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。經染色體核型鑒定發(fā)現，該席草二倍體染色體數目為2n＝2x＝30,四倍體為4n＝4x＝60；本發(fā)明最優(yōu)組合四倍體誘導率為41.2％，二倍體和四倍體嵌合體誘導率達到46.26％，僅少量試管苗為二倍體植株。席草對照株和誘變株染色體核型圖如圖5、圖6所示。(3)本發(fā)明選擇二倍體植株為對照；兩者移栽條件一致，適時追肥一次；移栽7個月左右，種苗為多倍體的植株相比于對照莖色濃綠，鮮草直徑相對較粗、草莖較長，頂草長，分蘗數多，根粗而長，尤其是草莖長平均值達到138.67cm，超出了優(yōu)質產品的標準。席草四倍體與二倍體的主要形態(tài)特征比較如表2所示，二倍體與四倍體的植株長勢如圖7所示。表2席草四倍體與二倍體的主要形態(tài)特征比較實施例2：采用本發(fā)明經過優(yōu)化的增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA3.5mg/L和生根培養(yǎng)基1/2MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.6mg/L+IAA0.5mg/L+多效唑3.0mg/L，發(fā)現30天增殖倍數達到7-10，每瓶獲得有效苗70株以上，大大提高了培養(yǎng)效率，節(jié)約了生產成本。而且增殖與生根簡化為一步完成，生根率達到95％以上，形成完整誘變植株的時間僅僅30天，大大提高了生產效率。對照例1：以0.1％秋水仙素+2％二甲基亞砜浸泡無菌苗72h，浸泡溫度25℃，培養(yǎng)時間60d，但增殖培養(yǎng)時培養(yǎng)基中不添加誘導劑為對照，該對照處理方式是現有技術中誘變多倍體的常規(guī)條件。結果如下：誘導劑處理致死率誘導率對照處理100％0本發(fā)明最優(yōu)處理方式55.6％41.2％對照例2：以0.1mg/L安磺靈浸泡無菌苗72h，浸泡溫度4℃，培養(yǎng)時間60d，但增殖培養(yǎng)時培養(yǎng)基中不添加誘導劑為對照，該對照處理方式是現有技術中誘變多倍體的常規(guī)條件。結果如下：誘導劑處理致死率誘導率對照處理96.1％0本發(fā)明最優(yōu)處理方式55.6％41.2％當前第1頁1 2 3