本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種臍帶保存液及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：臍帶是胎兒時期連接母體與胎兒的索狀結(jié)構(gòu)，其外被羊膜，內(nèi)含2條臍動脈、1條臍靜脈，在動靜脈之間含有特殊的胚胎粘液樣結(jié)締組織-華爾通氏膠(WhartonpsJelly)，從華爾通氏膠分離得到的基質(zhì)細(xì)胞即為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)。1991年McElreavery首次從人臍帶華通氏膠分離培養(yǎng)出一種具有多項分化潛能的成纖維樣細(xì)胞，即人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)。hUC-MSCs比來源于骨髓、脂肪以及其他組織的MSCs更具有優(yōu)勢，首先，臍帶來源不受倫理爭議，并且成本較低；其次，hUC-MSCs不會引起畸胎瘤，并且具有抑癌性，由于hUC-MSCs還具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)、基質(zhì)支持、旁分泌、遷移和基因穩(wěn)定性，故具有良好的臨床治療潛能。臍帶在采集、運輸、分離的過程中都需要處于無菌狀態(tài)，由于孕婦分娩時間的不確定性，臍帶在采集后不能完全保證馬上用于原代分離，大多數(shù)情況下都需要保存一段時間，臍帶保存液的功效決定了臍帶原代分離的成功率，傳統(tǒng)采用將臍帶組織浸沒在含多種組分的PBS中，例如專利CN101868536A公開了一種保存液，配方為186μg/mLCaCl2·2H2O，400μg/mLKCl，60μg/mLKH2PO4，200μg/mLMgSO4·7H2O，8000μg/mLNaCl，350μg/mLNaHCO3，90μg/mLNaH2PO4·7H2O，2000μg/mL葡萄糖、及青霉素和鏈霉素的1％等摩爾混合物。但是，這種PBS保存液配制較為復(fù)雜和繁瑣，自行配置工作量較大，而購買成品，因為其價格昂貴導(dǎo)致成本增加。針對上述問題，現(xiàn)有專利CN102550543A公開了一種成分簡單的臍帶保存液，由生理鹽水、青霉素和鏈霉素組成。雖然在該保存液制備上比較簡單，而且成本也較低，但是隨著青霉素和鏈霉素的大面積使用，導(dǎo)致一些耐藥性的細(xì)菌產(chǎn)生，使得這種雙抗的保存液在保存臍帶的效果方面不盡如人意。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種臍帶保存液及其應(yīng)用，使得所述臍帶保存液組成簡單，同時保證臍帶較好的保存效果。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種臍帶保存液，包括生理鹽水、甲砜霉素和甲硝唑。針對現(xiàn)有的含有雙抗的臍帶保存制劑保存效果不佳的問題，本發(fā)明從臍帶的保存效果角度考慮調(diào)整保存液中的成分，選擇甲砜霉素、甲硝唑和生理鹽水組成全新的保存液對臍帶進(jìn)行保存，達(dá)到了較高的保存效果。其中，作為優(yōu)選，甲砜霉素濃度為5-20mg/ml，更優(yōu)選為6mg/ml；甲硝唑濃度優(yōu)選為5-20mg/ml。在本發(fā)明具體實施方式中，上述兩個組分濃度可選擇如下：(1)甲砜霉素濃度為10mg/ml，甲硝唑濃度為15mg/ml；(2)甲砜霉素濃度為20mg/ml，甲硝唑濃度為10mg/ml；(3)甲砜霉素濃度為15mg/ml，甲硝唑濃度為8mg/ml；(4)甲砜霉素濃度為8mg/ml，甲硝唑濃度為18mg/ml；(5)甲砜霉素濃度為6mg/ml，甲硝唑濃度為5mg/ml；本發(fā)明保存液和專利CN102550543A實施例1保存液進(jìn)行保存效果的對比試驗，結(jié)果顯示，經(jīng)過本發(fā)明保存液保存24h后，臍帶污染率在5％以下，而專利CN102550543A實施例1保存液在保存臍帶24h后，污染率為10％。同時，本發(fā)明還將經(jīng)過保存液保存過的臍帶進(jìn)行hUC-MSCs的分離，在經(jīng)過傳代第3代時繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果表明，本發(fā)明保存液和現(xiàn)有專利的保存液均不影響hUC-MSCs的增殖能力。由此，本發(fā)明隨之提供了本發(fā)明所述臍帶保存液在保存臍帶和/或制備保存臍帶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。同時，本發(fā)明提供了一種保存臍帶的方法，將臍帶分離后置于本發(fā)明所述臍帶保存液中，于4℃下保存。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明選擇生理鹽水、甲砜霉素和甲硝唑作為臍帶保存液的組分，相比傳統(tǒng)的生理鹽水加雙抗的保存液，本發(fā)明在保持簡單組成的基礎(chǔ)上，在臍帶保存效果上表現(xiàn)出更為出色的功效，不僅能夠保證臍帶正?；?，而且降低染菌的程度，為臍帶提供更加有利的保存環(huán)境。附圖說明圖1所示為不同保存液保存臍帶后分離的hUC-MSCs的生長曲線。具體實施方式本發(fā)明實施例公開了一種臍帶保存液及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和應(yīng)用已通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。以下就本發(fā)明所提供的一種臍帶保存液及其應(yīng)用做進(jìn)一步說明。實施例1：本發(fā)明所述臍帶保存液生理鹽水，甲砜霉素濃度為10mg/ml，甲硝唑濃度為15mg/ml；實施例2：本發(fā)明所述臍帶保存液生理鹽水，甲砜霉素濃度為20mg/ml，甲硝唑濃度為10mg/ml；實施例3：本發(fā)明所述臍帶保存液生理鹽水，甲砜霉素濃度為15mg/ml，甲硝唑濃度為8mg/ml；實施例4：本發(fā)明所述臍帶保存液生理鹽水，甲砜霉素濃度為8mg/ml，甲硝唑濃度為18mg/ml；實施例5：本發(fā)明所述臍帶保存液生理鹽水，甲砜霉素濃度為6mg/ml，甲硝唑濃度為5mg/ml；實施例6：臍帶保存試驗保存液A-E：實施例1-實施例5保存液；保存液F：專利CN102550543A實施例1保存液；方法：采集臍帶50條(均經(jīng)過產(chǎn)婦授權(quán)同意，胎兒均足月生產(chǎn)且產(chǎn)婦無傳染性疾病)，每條臍帶平均截斷6份，分別置于中保存液A-F中，均置于4℃保存24h。保存24h后，統(tǒng)計六組標(biāo)本采集液的陽性率，即依據(jù)藥典檢測是否含有微生物。結(jié)果見表1。表1臍帶保存試驗結(jié)果保存液污染率(污染數(shù)/總數(shù))保存液A1/50，2％保存液B1/50，2％保存液C1/50，2％保存液D1/50，2％保存液E1/50，2％保存液F5/50，10％由表1可以看出，經(jīng)過本發(fā)明保存液保存過的臍帶，其污染率均在5％以下，而現(xiàn)有專利中的保存液污染率已經(jīng)達(dá)到10％。實施例7：保存液對hUC-MSCs的影響將實施例4中相同來源的臍帶經(jīng)保存液E和保存液F保存24h后按照常規(guī)方法分離hUC-MSCs，并傳代至第3代，分別取兩組對數(shù)生長期的第3代細(xì)胞，取12孔培養(yǎng)板，每孔以10000cell/孔的密度將復(fù)蘇后的細(xì)胞各接種于孔中，每孔加入含相關(guān)培養(yǎng)液1mL，置于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每三天換液一次。從第2天開始(剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞需要約24h適應(yīng)環(huán)境)，每隔24h取出板，隨機(jī)選擇3孔，吸棄舊培養(yǎng)液并用PBS清洗，加胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，制備單細(xì)胞懸液，吹勻，取10μL細(xì)胞懸液與10μL0.4％臺盼藍(lán)混勻后加樣到血細(xì)胞計數(shù)板上，10倍鏡下計數(shù)計數(shù)板四角大方格內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量，以時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果見圖1和表2。表2天數(shù)保存液E*104cell保存液F*104cell21.11.1231.21.4141.331.6852.762.8965.826.11712.1312.21812.1412.2由表2和圖1可以明顯看出，兩個保存液均對hUC-MSCs的增殖無影響。實施例8：細(xì)胞免疫表型分析取保護(hù)液E組第3代細(xì)胞，消化后清洗3次，制成細(xì)胞懸液，加入抗體，流式細(xì)胞儀檢測分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表達(dá)情況。結(jié)果見表2。表2CD73CD90CD105CD11bCD19CD34CD45HLA-DR100.00％99.90％95.70％0.50％0.00％0.30％0.10％0.60％由表2的流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果可知，保護(hù)液E組第3代細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34，CD45，CD11，HLA-DR和CD19，而整合素和黏附分子CD90，以及常用的人間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD73，CD105則均呈高表達(dá)，符合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。此外，將保護(hù)液A-D四組第3代細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果相同。實施例9：體外向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化檢測保護(hù)液E組第3代細(xì)胞，按2.5*104細(xì)胞濃度接種于含有DMEM/F12+20％FBS培養(yǎng)基的24孔板中，至細(xì)胞80％融合時，更換為含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰島素、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培養(yǎng)液，每周換液2次，3周后用多聚甲醛固定，油紅O染色。結(jié)果顯示，保護(hù)液E組第3代細(xì)胞可以形成脂肪細(xì)胞，油紅O染色發(fā)現(xiàn)后者細(xì)胞漿充滿了油滴空泡，說明該保存液保存臍帶后得到的細(xì)胞具有正常的分化能力。此外，將保護(hù)液A-D四組第3代細(xì)胞進(jìn)行成脂分化，結(jié)果相同。以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3