本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程學(xué)領(lǐng)域。具體涉及西藏虎頭蘭莖尖微滴玻璃化法超低溫保存方法。

背景技術(shù)：

西藏虎頭蘭為蘭科蘭屬(學(xué)名：cymbidiumtracyanuml.)：附生植物；假鱗莖橢圓狀卵形或長圓狀狹卵形，長5-11厘米，寬2-5厘米，大部分包藏于葉鞘之內(nèi)。葉5-8枚或更多，帶形。花葶從假鱗莖基部穿鞘而出，外彎或近直立；總狀花序通常具10余朵花；花大，直徑達13-14厘米，有香氣；萼片與花瓣黃綠色至橄欖綠色，有多條不甚規(guī)則的暗紅褐色縱脈；花瓣鐮刀形，下彎并扭曲，長4.5-6.5厘米，寬7-12毫米；唇瓣卵狀橢圓形，長4.5-6厘米，3裂。蒴果橢圓形?；ㄆ?-12月。西藏虎頭蘭花大色艷，花直徑達10-12cm，具有很高的觀賞價值，可以作為雜交親本(大花蕙蘭)。西藏虎頭蘭在中國分布面積比較小，只在貴州西南部、云南、廣西西北部和西藏東南部有分布，但是數(shù)量非常少。西藏虎頭蘭用種子或分株法繁殖，其種子在自然條件下極難萌發(fā)，自然繁殖率低。

超低溫保存一般是指使用液氮(-196℃)或液氮蒸汽保存生物材料的技術(shù)和方法。在液氮溫度下，細(xì)胞中所有的生化反應(yīng)都被暫時停止，從而可以使細(xì)胞在理論上進行無限期保存。超低溫保存技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物、動物和植物種質(zhì)資源的長期保存。蘭科植物的超低溫保存研究基本都集中在種子，圓球莖和類圓球莖的超低溫保存上。蘭科植物種子的超低溫保存是蘭科植物種質(zhì)資源保存的重要途徑。由于蘭科種子微小，可以一次保存大量種子，可以保存多樣性的基因資源。蘭科植物成熟種子超低溫保存是可行和高效的。但蘭科植物特別是地生蘭成熟種子存在萌發(fā)困難的問題。利用玻璃化途徑進行蘭科植物種子的超低溫保存，現(xiàn)有的研究看來對成熟種子和未成熟種子都非常高效。

迄今，未見有西藏虎頭蘭莖尖微滴玻璃化法超低溫保存方法的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種西藏虎頭蘭莖尖微滴玻璃化法超低溫保存方法，超低溫保存莖尖的存活率和再生率更高，解凍后的莖尖在恢復(fù)培養(yǎng)階段生長更為迅速，以解決現(xiàn)有技術(shù)中導(dǎo)致的上述多項缺陷。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下的技術(shù)方案：一種西藏虎頭蘭微滴玻璃化超低溫保存方法，包括以下步驟：

1)材料獲取，在西藏虎頭蘭離體植株上取大約2mm長的節(jié)段，將節(jié)段在無菌條件下接入vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

2)莖尖切割，在體視鏡下，以三葉階段的類圓球莖為材料，切割莖尖，莖尖體積約為1mm3，將外層的兩片葉原基切去，得到的莖尖由最后一片葉原基包裹；

3)莖尖預(yù)培養(yǎng)，切割得到的莖尖在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗處理和25℃下預(yù)培養(yǎng)48小時；

4)加載處理，將莖尖在加載溶液中，25℃下處理20分鐘；

5)植物微滴玻璃化處理，將莖尖轉(zhuǎn)入預(yù)冷的pvs2溶液，在冰上處理20-40分鐘；

6)超低溫保存，將經(jīng)過pvs2處理的莖尖轉(zhuǎn)移到無菌鋁箔條上并插入液氮，待降溫過程完成后轉(zhuǎn)入凍存管并進入液氮罐保存；

7)解凍和卸載處理，將鋁箔條從液氮中移出并直接轉(zhuǎn)入卸載溶液，在25℃下處理20分鐘；

8)恢復(fù)培養(yǎng)，將解凍后的莖尖轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上進行恢復(fù)培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述步驟1)中，vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加有0.06m蔗糖，2.27μmthidiazuron(tdz)和3g/l的phytagel。

優(yōu)選的，所述步驟3)中，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為添加0.3m蔗糖和0.3％(w/v)phytagel的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述步驟4)中，加載溶液為添加2m甘油和0.4m蔗糖的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述步驟5)中，pvs2溶液為添加30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)dmso和0.4m蔗糖的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述步驟7)中，卸載溶液為添加1.2m蔗糖的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述步驟8)中，將莖尖直接轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述步驟8)中，轉(zhuǎn)入vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.3m蔗糖平板，2天或6天后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述步驟8)中所述恢復(fù)培養(yǎng)基為添加30gl-1蔗糖、1.0mgl-1ba和3gl–1phytagel的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

采用以上技術(shù)方案的有益效果是：本發(fā)明的技術(shù)方案中超低溫保存莖尖的存活率和再生率更高，解凍后的莖尖在恢復(fù)培養(yǎng)階段生長更為迅速。

附圖說明

圖1為預(yù)培養(yǎng)時間對西藏虎頭蘭莖尖超低溫保存后再生率的影響示意圖；

圖2為解凍后滲透處理對西藏虎頭蘭莖尖超低溫保存后再生率的影響示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。

本發(fā)明的具體實施方式：一種西藏虎頭蘭微滴玻璃化超低溫保存方法，包括以下步驟：

1)材料獲取，在西藏虎頭蘭離體植株上取大約2mm長的節(jié)段，將節(jié)段在無菌條件下接入vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基，vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加有0.06m蔗糖，2.27μmthidiazuron(tdz)和3g/l的phytagel；

2)莖尖切割，在體視鏡下，以三葉階段的類圓球莖為材料，切割莖尖，莖尖體積約為1mm3，將外層的兩片葉原基切去，得到的莖尖由最后一片葉原基包裹；

3)莖尖預(yù)培養(yǎng)，切割得到的莖尖在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗處理和25℃下預(yù)培養(yǎng)48小時，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為添加0.3m蔗糖和0.3％(w/v)phytagel的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

4)加載處理，將莖尖在加載溶液中，25℃下處理20分鐘，加載溶液為添加2m甘油和0.4m蔗糖的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

5)植物微滴玻璃化處理，將莖尖轉(zhuǎn)入預(yù)冷的pvs2溶液，在冰上處理20-40分鐘，pvs2溶液為添加30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)dmso和0.4m蔗糖的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

6)超低溫保存，將經(jīng)過pvs2處理的莖尖轉(zhuǎn)移到無菌鋁箔條上并插入液氮，待降溫過程完成后轉(zhuǎn)入凍存管并進入液氮罐保存；

7)解凍和卸載處理，將鋁箔條從液氮中移出并直接轉(zhuǎn)入卸載溶液，在25℃下處理20分鐘，卸載溶液為添加1.2m蔗糖的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

8)恢復(fù)培養(yǎng)，將解凍后的莖尖轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上進行恢復(fù)培養(yǎng)。

恢復(fù)培養(yǎng)是將在卸載溶液處理結(jié)束后，將莖尖直接轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基，或者轉(zhuǎn)入vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.3m蔗糖平板，2天或6天后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。另外一組對照實驗中，莖尖在解凍后直接轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。

恢復(fù)培養(yǎng)基為添加30gl-1蔗糖、1.0mgl-1ba和3gl–1phytagel的vw基礎(chǔ)培養(yǎng)基，恢復(fù)培養(yǎng)的前7天為暗培養(yǎng)，解凍后前7天為暗處理，后轉(zhuǎn)入光下?；謴?fù)培養(yǎng)4周以后在顯微鏡下統(tǒng)計再生率。明確表現(xiàn)生長和形成新類圓球莖的超低溫保存莖尖為再生。

實施例1：

1.類圓球莖的誘導(dǎo)：在西藏虎頭蘭離體植株上取大約2mm長的節(jié)段，將節(jié)段在無菌條件下接入添加了0.06m蔗糖，2.27μmthidiazuron(tdz)和3g/l的phytagel的vw培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為25℃，14/10h(光/暗)的光照周期，光強為40μmolm^-2s^-1。將誘導(dǎo)得到的類圓球莖作為以細(xì)胞薄層培養(yǎng)擴繁類圓球莖的起始材料。

2.通過細(xì)胞薄層培養(yǎng)擴繁類圓球莖

在體視顯微鏡下，用無菌的鑷子和手術(shù)刀徒手制備類圓球莖細(xì)胞薄層。將劍葉蝦脊蘭和細(xì)花蝦脊蘭的類圓球莖做橫切，得到厚度大約為0.5毫米左右的細(xì)胞薄層。將細(xì)胞薄層切片接種到添加了0.06m蔗糖和3gl-1phytagel的vw培養(yǎng)基，并在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)第二周，細(xì)胞薄層開始產(chǎn)生新的類圓球莖。培養(yǎng)第7周，新的類圓球莖開始產(chǎn)生葉原基。三個葉片階段的類圓球莖被收集和用于切割莖尖。

3.莖尖的切割：在體視鏡下，以三葉階段的類圓球莖為材料，切割莖尖。莖尖體積約為1mm³。將外層的兩片葉原基切去，得到的莖尖由最后一片葉原基包裹。

4.莖尖預(yù)培養(yǎng)，切割得到的莖尖在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗處理和25℃下預(yù)培養(yǎng)48小時。

5.微滴玻璃化超低溫保存。

將莖尖切割后在預(yù)培養(yǎng)基上，暗處理和25℃下預(yù)培養(yǎng)48小時。預(yù)培養(yǎng)基的組成為vw+0.3m蔗糖+0.3％(w/v)phytagel。預(yù)培養(yǎng)后的莖尖在25℃下loadingsolution處理20分鐘。loadingsolution的組成為vw培養(yǎng)基添加2m甘油和0.4m蔗糖。loadingsolution處理結(jié)束后，移掉loadingsolution，加入1ml預(yù)冷的pvs2在冰上處理一定的時間。pvs2處理結(jié)束后將莖尖轉(zhuǎn)入鋁箔并插入液氮保存。解凍時將帶有莖尖的鋁箔從液氮中取出，直接插入6厘米直徑培養(yǎng)皿中10mlunloadingsulution中，unloadingsolution的組成為vw+1.2m蔗糖。解凍完成后，莖尖直接轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基，或者轉(zhuǎn)入vw+0.3m蔗糖平板，2天或6天后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。另外一組對照實驗中，莖尖在解凍后直接轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍后前7天為暗處理，后轉(zhuǎn)入光下?；謴?fù)培養(yǎng)四周以后在顯微鏡下統(tǒng)計再生率。明確表現(xiàn)生長和形成新類圓球莖的超低溫保存莖尖記為再生。

本發(fā)明中，測試了莖尖在添加0.3m蔗糖的預(yù)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24，48，72和96小時后的超低溫保存再生率。經(jīng)過24小時預(yù)培養(yǎng)的莖尖的超低溫保存再生率僅為7.5％(圖1)。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間為48小時，超低溫保存莖尖的再生率上升到17.5％(圖1)。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間延長到72小時時，再生率進一步顯著性的上升到25％(圖1)。預(yù)培養(yǎng)96小時后莖尖的再生率達到了30％(圖1)?？梢婎A(yù)培養(yǎng)對超低溫保存西藏虎頭蘭莖尖很重要。

本發(fā)明中，測試了解凍后滲透處理對西藏虎頭蘭超低溫保存莖尖的再生率有重要的影響。在解凍后不做滲透處理，直接轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基的情況下，再生率僅為3.3％(圖2)。當(dāng)對解凍后的莖尖進行2天的滲透處理后，再生率上升到10％，但次結(jié)果與對照組并無顯著差異(圖2)。當(dāng)滲透處理被延長到6天時，再生率被顯著提升到了61.7％(圖2)。

實施例2：

西藏虎頭蘭莖尖超低溫保存莖尖存活和再生情況

在優(yōu)化的超低溫保存條件下，超低溫存的莖尖在解凍后1周即可見到再生的跡象。存活的莖尖經(jīng)過四周的恢復(fù)培養(yǎng)可以產(chǎn)生新的類圓球莖。超低溫保存莖尖產(chǎn)生1或2個新類圓球莖的情況都有發(fā)生。新類圓球莖在轉(zhuǎn)入不添加激素的vw半固體培養(yǎng)基后可以發(fā)育成完整的試管苗。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。