本發(fā)明涉及棉花育種領(lǐng)域，具體涉及棉花耐低溫發(fā)芽鑒定方法。
背景技術(shù)：
：中國棉區(qū)“西移北上”已經(jīng)成為不爭的事實(shí)，新疆作為我國棉花的主產(chǎn)區(qū)，因?yàn)槠涮厥獾牡乩項l件和氣候環(huán)境，低溫已經(jīng)成為限制新疆棉花生產(chǎn)的非生物脅迫因素之一。新疆地區(qū)有“前期升溫慢、后期降溫快”的氣候特點(diǎn)，無霜期短且春季氣候多變，常有明顯的“倒春寒”現(xiàn)象。棉花屬于非冷馴化作物，正常生長需足夠的熱量條件，對低溫敏感，生長發(fā)育各個階段均受到低溫的影響，特別是在萌發(fā)期和幼苗期遭受較低的低溫危害，其生育期將顯著延遲，現(xiàn)蕾、開花和成熟均推遲，極大地影響最終產(chǎn)量及品質(zhì)。培育耐低溫棉花新品種是重要的途徑，因此，開展棉花耐低溫種質(zhì)資源的篩選、鑒定和評價是必經(jīng)之路。目前，關(guān)于棉花耐低溫鑒定的研究還很少，缺少統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)和有效的評價體系，成為棉花種質(zhì)資源耐低溫鑒定的重要限制因素。在其它作物中常見低溫鑒定報道的有水稻、玉米、小麥等禾本科植物都為單子葉，棉花為雙子葉植物，棉花起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種非冷馴化的植物，這與擬南芥、油菜、大豆等雙子葉作物也不同。因此，其他作物中現(xiàn)存的鑒定方法不能直接照搬用到棉花中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了探索一種棉花耐低溫發(fā)芽鑒定方法及有效的評價方法，以期快速有效的對棉花種質(zhì)資源進(jìn)行耐低溫鑒定，為培育棉花耐低溫新品種奠定基礎(chǔ)，本發(fā)明的發(fā)明人提出并完成本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供棉花耐低溫發(fā)芽鑒定方法。根據(jù)本發(fā)明的棉花耐低溫發(fā)芽鑒定方法，包括以下步驟：1)種子的選擇：種子經(jīng)硫酸脫絨后，選擇籽粒飽滿成熟的種子；2)種子的預(yù)處理：所有種子進(jìn)行消毒處理；3)低溫脅迫處理：將種子擺放在鋪有濾紙的高溫滅菌的培養(yǎng)皿中，加入適量的純水，將培養(yǎng)皿放在溫度設(shè)置為15℃人工氣候箱進(jìn)行暗培養(yǎng)；4)耐低溫分級：采用相對萌發(fā)率為指標(biāo)對棉花耐低溫水平進(jìn)行評價，確定其耐低溫的水平。具體地，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式的方法，包括：(1)種子的選擇：栽培棉花種子軋花后種殼上仍然存有短絨，種子是否飽滿、是否成熟和是否有蟲害都不明顯，經(jīng)過硫酸脫絨后，種子外殼上的短絨去掉，挑選烏黑飽滿無蟲害的完整種子。如果棉花種子是當(dāng)年新收獲的種子，需要破除生理休眠，可以采取加熱干燥法，40℃，通風(fēng)良好，烘箱加熱烘干1天。(2)種子的預(yù)處理：種子經(jīng)過硫酸脫絨時會殺死一部分種殼上的微生物，但是在種子處理前仍需進(jìn)一步進(jìn)行消毒處理，5％的次氯酸鈉溶液浸泡10min，用純水沖洗干凈(4-5遍)。(3)低溫脅迫處理(15℃)：將消毒后的種子置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中(濾紙和培養(yǎng)皿均已采取高溫滅菌處理)，種子最好按照一個方向擺放，種子之間的間隔一定距離，每個培養(yǎng)皿中加入適量的蒸餾水，種子上方再加蓋兩層濕潤的濾紙。發(fā)芽期間保持適當(dāng)?shù)乃郑诌^大，易造成種子腐爛；水分過少，種子無法吸收足夠的水分從而影響種子萌發(fā)。放入設(shè)定溫度15℃的人工氣候培養(yǎng)箱中，對照溫度為30℃。每天8h光照，光照強(qiáng)度為13.5μmol/(㎡*s)～22.5μmol/(㎡*s)。人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)的相對濕度接近飽和，連續(xù)處理10天。前期為了確定有效的鑒定溫度，如果溫度太低，所有栽培棉種都不能正常萌發(fā)；15℃處理時，材料之間出現(xiàn)明顯的差異，不同材料的發(fā)芽勢和發(fā)芽率明顯不同；20℃以上的溫度，材料與材料之間的差別不大；因此，通過反復(fù)摸索，確定15℃為最佳的低溫發(fā)芽鑒定溫度。此外低溫脅迫種子發(fā)芽速度會減慢，把種子萌發(fā)的處理時間延長到10天。(4)耐低溫水平分級：參考國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)抗鹽鑒定的分級方法(葉武威和劉金定，1998)，計算正常萌發(fā)種子占總種子數(shù)的比率。正常萌發(fā)的種子標(biāo)準(zhǔn)為胚根和下胚軸總長度大于種子長度的兩倍，有主根且下胚軸無病，色白，無腐爛變質(zhì)為正常芽。按照相對發(fā)芽率(相對發(fā)芽率＝特定低溫處理條件下的發(fā)芽率/對照溫度下的發(fā)芽率*100)，進(jìn)行耐低溫水平分級：耐性級別相對出苗率(％)高抗≥90.0抗75.0～89.9耐50.0～74.9感<50.0本發(fā)明為棉花耐低溫鑒定提供了一種新方法，在國際和國內(nèi)為獨(dú)創(chuàng)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)該方法采用相對出苗率進(jìn)行分級，給出了客觀的評價指標(biāo)，極大降低了人為主觀因素造成的誤差。(2)該方法采用人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)，除了設(shè)定不同的溫度，其他條件在人為控制下均可達(dá)到完全一致。減少了環(huán)境因素導(dǎo)致的誤差，使結(jié)果更加可靠。(3)該方法操作簡單，人力物力成本低，占用空間少，可進(jìn)行大批量材料的鑒定。附圖說明圖1四個栽培棉種的代表材料：草棉(中草1號)、亞洲棉(中亞1號)、陸地棉(中79)、海島棉(海7124)，低溫15℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，處理10天后，正常萌發(fā)的種子。具體實(shí)施方式實(shí)施例1棉花耐低溫發(fā)芽鑒定方法鑒定6份棉花材料的耐低溫水平1、棉花材料：中亞1號；TM-1，中12，中79；海7124，PM90共6份棉花材料2、種子的選擇:硫酸脫絨后的棉花種子，挑選大小一致，烏黑飽滿、無蟲害的完整的成熟種子。為了確保打破棉花種子的生理休眠，在通風(fēng)良好的條件下，把供試種子鋪成一薄層，40℃，加熱烘干24h，以打破種子休眠。保存?zhèn)溆谩?、種子的消毒：5％的次氯酸鈉溶液浸泡10min，用純水沖洗干凈(4-5遍)。這樣可以防止細(xì)菌、真菌等引起的種子霉?fàn)€。4、低溫脅迫處理：設(shè)置不同的溫度梯度：5℃、10℃、15℃、20℃、25℃，30℃(對照溫度)。將消毒后的種子置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中(濾紙和培養(yǎng)皿均已采取高溫滅菌處理)，種子整齊擺放，種子之間的間隔一定距離，每個培養(yǎng)皿中加入適量的蒸餾水，種子上方再加蓋兩層濕潤的濾紙。發(fā)芽期間保持適當(dāng)?shù)乃帧７謩e放入設(shè)定溫度(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃，30℃)的人工氣候培養(yǎng)箱中。每天8h光照，光照強(qiáng)度為13.5μmol/(㎡*s)～22.5μmol/(㎡*s)。人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)的相對濕度接近飽和，連續(xù)處理10天。每個處理重復(fù)3次。5、結(jié)果統(tǒng)計及分析：處理后第3天開始調(diào)查，20℃及以上的溫度處理下，種子開始萌發(fā)。15℃低溫脅迫下，種子開始露白。5℃和10℃條件下，種子沒有萌動。處理10天后，5℃和10℃種子雖有少數(shù)觀察到萌動露白，但是胚根沒有伸長，不算正常發(fā)芽。15℃、20℃、25℃、30℃條件下種子都已經(jīng)完成萌發(fā)。統(tǒng)計不同溫度下的種子的正常發(fā)芽數(shù)，通過公式計算相對出苗率，然后根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棉花的不同品種的發(fā)芽率隨著溫度降低而減低，在10℃及以下的溫度，不能正常萌發(fā)；在15℃時不同材料間的發(fā)芽率均達(dá)到極顯著水平，15℃可以作為棉花棉低溫脅迫的有效溫度。20℃及以上的溫度，相同材料的萌發(fā)率與對照(30℃)結(jié)果稍微有差別，但是差別沒有達(dá)到顯著水平，而且材料之間的差別不大，不能有效的對材料之間的耐低溫水平進(jìn)行鑒別。5、耐低溫水平分級：按照棉花耐低溫發(fā)芽鑒定法的標(biāo)準(zhǔn)，通過公式計算相對出苗率，然后根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(見表1)。表16個棉花材料的耐低溫水平如圖1所示，四個栽培棉種的代表材料：草棉(中草1號)、亞洲棉(中亞1號)、陸地棉(中79)、海島棉(海7124)，低溫15℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，處理10天后，正常萌發(fā)的種子。當(dāng)前第1頁1 2 3