具有人源化分化簇47基因的非人動物的制作方法

文檔序號：11280088閱讀：380來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>農(nóng)業(yè),林業(yè),園林,畜牧業(yè),肥料飼料的機械,工具制造及其應(yīng)用技術(shù)

相關(guān)專利申請的交叉引用

本申請要求2014年12月5日提交的美國專利申請序列號62/087,992的優(yōu)先權(quán)，該專利據(jù)此全文以引用方式并入本文。

序列表以引用方式并入

序列表為2015年11月23日創(chuàng)建的名稱為32584_10108wo01_sequencelisting.txt、大小為96.0kb的ascii文本文件，其經(jīng)由efs-web提交給美國專利及商標局，并且以引用方式并入本文中。

背景技術(shù)：

癌癥治療可分為四種主要類別：化療/放療、激素治療、靶向治療和免疫治療。醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)的重點集中于靶向治療并且已獲得重大改進，但癌癥仍然是患者和全球衛(wèi)生保健行業(yè)的重大挑戰(zhàn)。該重大挑戰(zhàn)部分是由于癌細胞能夠避開先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的監(jiān)測機制，這在一定程度上是吞噬清除抑制的結(jié)果。目前，不存在這樣的體內(nèi)系統(tǒng)，該體內(nèi)系統(tǒng)任選地確定設(shè)計為激活癌細胞的吞噬清除的新癌癥療法的治療潛力，以及確定癌細胞如何向巨噬細胞和吞噬細胞提供抑制信號的分子層面。此類系統(tǒng)提供了測定體內(nèi)吞噬作用和巨噬細胞功能的來源，以及目標為通過向免疫系統(tǒng)發(fā)起促吞噬信號而提供抗腫瘤環(huán)境的新癌癥療法的鑒定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涵蓋以下認知，即期望對非人動物進行工程化，以允許用于鑒定和開發(fā)新癌癥治療劑的改進的系統(tǒng)。本發(fā)明還涵蓋以下認知，即期望對非人動物進行工程化，以允許對人造血干細胞的改進的植入。另外，本發(fā)明還涵蓋以下認知，即具有人源化cd47基因和/或以其他方式表達、包含或產(chǎn)生人或人源化cd47多肽的非人動物對于例如用于鑒定和開發(fā)癌癥治療劑是所期望的，所述治療劑克服了cd47阻斷相關(guān)的全身毒性并且克服了cd47介導(dǎo)的腫瘤細胞吞噬作用抑制，并且提供了用于植入人造血干細胞的更有效的體內(nèi)系統(tǒng)，所述人造血干細胞提供了許多廣泛的人細胞類型穩(wěn)態(tài)的增加。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供具有包含cd47基因的基因組的非人動物，所述cd47基因包含來自兩種不同物種(例如人和非人)的遺傳物質(zhì)。在一些實施方案中，如本文所述的非人動物的cd47基因編碼包含人和非人部分的cd47多肽，其中所述人和非人部分連接在一起并且形成功能性cd47多肽。

在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含含有內(nèi)源部分和人部分的cd47基因，其中所述內(nèi)源和人部分可操作地連接至內(nèi)源啟動子。

在一些實施方案中，內(nèi)源部分包含內(nèi)源cd47基因的外顯子1和外顯子7下游的外顯子。在某些實施方案中，內(nèi)源cd47基因的外顯子1和外顯子7下游的外顯子與表3中呈現(xiàn)的小鼠cd47基因的對應(yīng)的外顯子1和外顯子7下游的外顯子具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實施方案中，內(nèi)源cd47基因的外顯子1和外顯子7下游的外顯子與表3中呈現(xiàn)的小鼠cd47基因的對應(yīng)的外顯子1和外顯子7下游的外顯子相同。

在一些實施方案中，人部分編碼人cd47多肽的氨基酸16-292。在一些實施方案中，人部分編碼人cd47多肽的氨基酸19-292。在一些實施方案中，人部分編碼人cd47多肽的氨基酸19-141。在一些實施方案中，人部分編碼人cd47多肽的氨基酸19-127。在一些實施方案中，人部分包含人cd47基因的外顯子2-7。

在一些實施方案中，人cd47基因的外顯子2-7與表3中呈現(xiàn)的人cd47基因的對應(yīng)的外顯子2-7具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實施方案中，人cd47基因的外顯子2-7與表3中呈現(xiàn)的人cd47基因的對應(yīng)的外顯子2-7相同。

在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含含有人cd47多肽的胞外部分和內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的cd47多肽。在一些實施方案中，cd47多肽包含人cd47多肽的跨膜部分。在其他實施方案中，cd47多肽包含非人cd47多肽的跨膜部分。在一些實施方案中，cd47多肽在非人動物的細胞中由非人信號肽翻譯。在某些實施方案中，非人信號肽是嚙齒動物(例如，小鼠或大鼠)信號肽。

在一些實施方案中，本發(fā)明的cd47多肽從內(nèi)源非人cd47基因表達。

在一些實施方案中，內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分包含胞質(zhì)內(nèi)尾部，所述胞質(zhì)內(nèi)尾部具有的氨基酸序列與表3中呈現(xiàn)的小鼠cd47多肽的胞質(zhì)內(nèi)尾部具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實施方案中，內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分包含胞質(zhì)內(nèi)尾部，所述胞質(zhì)內(nèi)尾部具有的氨基酸序列與表3中呈現(xiàn)的小鼠cd47多肽的胞質(zhì)內(nèi)尾部相同。

在一些實施方案中，人cd47多肽的胞外部分包含與人cd47多肽的殘基19-141對應(yīng)的氨基酸。在一些實施方案中，人cd47多肽的胞外部分包含與人cd47多肽的殘基19-127對應(yīng)的氨基酸。在一些實施方案中，人cd47多肽的胞外部分包含這樣的氨基酸序列：其與表3中呈現(xiàn)的人cd47多肽的胞外部分的對應(yīng)的氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實施方案中，人cd47多肽的胞外部分包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與表3中呈現(xiàn)的人cd47多肽的胞外部分的對應(yīng)的氨基酸序列相同。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供如本文所述的由非人動物的cd47基因編碼的cd47多肽。在某些實施方案中，編碼的cd47多肽包含與seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19或seqidno:20具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，編碼的cd47多肽包含與seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19或seqidno:20相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供人源化cd47基因，所述人源化cd47基因包含可操作地連接至人cd47基因的一個或多個外顯子的非人cd47基因的一個或多個外顯子。在某些實施方案中，本發(fā)明的人源化cd47基因包含編碼cd47多肽的胞內(nèi)部分的非人外顯子和編碼人cd47多肽的胞外部分的人外顯子。在一些實施方案中，人源化cd47基因還包含編碼人cd47多肽的跨膜部分的人外顯子。在某些實施方案中，本發(fā)明的人源化cd47基因包含編碼cd47多肽的全部或部分信號肽和胞內(nèi)部分的非人外顯子，以及編碼cd47多肽的胞外部分和任選的跨膜部分的人外顯子。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供來自如本文所述的非人動物的分離的細胞或組織。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含如本文所述的cd47基因的分離的細胞或組織。在一些實施方案中，細胞選自樹突狀細胞、淋巴細胞(例如，b細胞或t細胞)、巨噬細胞和單核細胞。在一些實施方案中，組織選自脂肪、膀胱、大腦、乳房、骨髓、眼、心、腸、腎、肝、肺、淋巴結(jié)、肌肉、胰腺、血漿、血清、皮膚、脾、胃、胸腺、睪丸、卵子以及它們的組合。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供非人胚胎干細胞，其基因組包含如本文所述的cd47基因。在一些實施方案中，非人胚胎干細胞為小鼠胚胎干細胞并且來自129品系、c57bl/6品系或balb/c品系。在一些實施方案中，非人胚胎干細胞為小鼠胚胎干細胞并且來自129和c57bl/6品系的混合物。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供如本文所述的非人胚胎干細胞用于制備非人動物的用途。在某些實施方案中，非人胚胎干細胞為小鼠胚胎干細胞并且用于制備包含如本文所述的cd47基因的小鼠。在某些實施方案中，非人胚胎干細胞為大鼠胚胎干細胞并且用于制備包含如本文所述的cd47基因的大鼠。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供非人胚胎包含含有如本文所述的cd47基因的非人胚胎干細胞、由其制備、由其獲得或由其產(chǎn)生。在某些實施方案中，非人胚胎是嚙齒動物胚胎。在一些實施方案中，嚙齒動物胚胎是小鼠胚胎。在一些實施方案中，嚙齒動物胚胎是大鼠胚胎。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種制備表達來自內(nèi)源cd47基因的cd47多肽的非人動物的方法，其中所述cd47多肽包含人序列，所述方法包括將基因組片段插入非人胚胎干細胞中的內(nèi)源cd47基因，所述基因組片段包含編碼全部或部分的人cd47多肽的核苷酸序列；獲得包含內(nèi)源cd47基因的非人胚胎干細胞，所述內(nèi)源cd47基因包含編碼全部或部分的人cd47多肽的核苷酸序列；以及使用包含編碼全部或部分的人cd47多肽的所述核苷酸序列的非人胚胎干細胞形成非人動物。

在一些實施方案中，人序列包含與人cd47多肽的殘基19-141(或19-292)對應(yīng)的氨基酸。在一些實施方案中，人序列包含與人cd47多肽的殘基19-127對應(yīng)的氨基酸。

在一些實施方案中，核苷酸序列包含人cd47基因的外顯子2-7。在一些實施方案中，核苷酸序列包含一個或多個選擇標志物。在一些實施方案中，核苷酸序列包含一個或多個位點特異性重組位點。

在一些實施方案中，所述方法還包括將基因組片段插入非人胚胎干細胞的內(nèi)源sirpα基因的步驟，所述基因組片段包含編碼全部或部分的人sirpα多肽(例如，編碼人sirpα多肽的胞外部分)的核苷酸序列。在某些實施方案中，在插入內(nèi)源cd47基因之前將包含編碼全部或部分的人sirpα多肽(例如，編碼人sirpα多肽的胞外部分)的核苷酸序列的基因組片段插入非人胚胎干細胞的內(nèi)源sirpα基因。

在一些實施方案中，所述方法還包括使包含內(nèi)源cd47基因(所述內(nèi)源cd47基因包括編碼全部或部分的人cd47多肽的核苷酸序列)的非人動物與第二非人動物交配，所述第二非人動物具有包含編碼sirpα多肽的sirpα基因的基因組，所述sirpα多肽包含人sirpα多肽的胞外部分(例如，與人sirpα多肽的殘基28-362對應(yīng)的氨基酸)和內(nèi)源sirpα多肽的胞內(nèi)部分。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種提供非人動物的方法，所述非人動物的基因組包含cd47基因，所述cd47基因編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分，所述方法包括修飾非人動物的基因組，使得其包含編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分的cd47基因，從而提供所述非人動物。在一些實施方案中，cd47基因編碼cd47多肽，所述cd47多肽包含連接至內(nèi)源非人cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分和跨膜部分。在其他實施方案中，cd47基因編碼cd47多肽，所述cd47多肽包含連接至內(nèi)源非人cd47多肽的跨膜部分和胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分。

在一些實施方案中，修飾非人動物的基因組在非人胚胎干細胞中進行。在某些實施方案中，非人胚胎干細胞為嚙齒動物胚胎干細胞；在一些實施方案中，為小鼠胚胎干細胞；在一些實施方案中，為大鼠胚胎干細胞。

在一些實施方案中，所述方法還包括修飾非人動物的基因組，使得其包含sirpα基因，所述sirpα基因編碼連接至內(nèi)源sirpα多肽的胞內(nèi)部分的人sirpα多肽的胞外部分(例如，與人sirpα多肽的殘基28-362對應(yīng)的氨基酸)。在某些實施方案中，修飾非人動物的基因組，使得其包含sirpα基因，所述sirpα基因編碼連接至內(nèi)源sirpα多肽的胞內(nèi)部分的人sirpα多肽的胞外部分(例如，與人sirpα多肽的殘基28-362對應(yīng)的氨基酸)，所述修飾非人動物的基因組在修飾非人動物的基因組，使得其包含cd47基因(所述cd47基因編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分和任選的跨膜部分)之前進行。

在一些實施方案中，所述方法還包括使非人動物與第二非人動物交配，所述非人動物的基因組包含cd47基因，所述cd47基因編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分，所述第二非人動物具有包含編碼sirpα多肽的sirpα基因的基因組，所述sirpα多肽包含人sirpα多肽的胞外部分(例如，與人sirpα多肽的殘基28-362對應(yīng)的氨基酸)和內(nèi)源sirpα多肽的胞內(nèi)部分。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供可通過如本文所述的方法獲得的非人動物。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種將人細胞植入非人動物的方法，所述方法包括以下步驟：提供非人動物，所述非人動物的基因組包含cd47基因，所述cd47基因編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分；以及將一種或多種人細胞移植到所述非人動物。在某些實施方案中，所述方法還包括測定所述非人動物中一種或多種人細胞的植入的步驟。在某些實施方案中，測定的步驟包括將一種或多種人細胞的植入與一種或多種野生型非人動物中或一種或多種非人動物中的植入相比較，所述非人動物的基因組不包含編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分的cd47基因。

在一些實施方案中，人細胞是造血干細胞。在一些實施方案中，人細胞是靜脈內(nèi)移植的。在一些實施方案中，人細胞是腹膜內(nèi)移植的。在一些實施方案中，人細胞是皮下移植的。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種評估靶向人細胞的藥物的治療功效的方法，所述方法包括提供非人動物，所述非人動物的基因組包含編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分的cd47基因；將一種或多種人細胞移植到所述非人動物；將候選藥物施用給所述非人動物；以及監(jiān)測非人動物中的人細胞，以確定候選藥物的治療功效。

在一些實施方案中，人細胞是癌細胞，候選藥物是抗癌候選藥物。在某些實施方案中，候選藥物是抗體。

在一些實施方案中，非人動物還包含人免疫細胞。在某些實施方案中，候選藥物是結(jié)合人cd47和移植的人癌細胞上的抗原的雙特異性抗體。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，其包括提供一種或多種細胞，所述細胞的基因組包括編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分的cd47基因；使一種或多種細胞與標記的底物一起溫育；以及測量一種或多種細胞對標記的底物的吞噬作用。在一些實施方案中，該底物是熒光標記的。在一些實施方案中，該底物用抗體標記。在一些實施方案中，該底物是一種或多種紅細胞。在一些實施方案中，該底物是一種或多種細菌細胞。在一些實施方案中，該底物是一種或多種腫瘤細胞。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，其包括提供非人動物，所述非人動物的基因組包括編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分的cd47基因；使非人動物暴露于抗原；以及測量非人動物的一種或多種細胞對抗原的吞噬作用。在一些實施方案中，暴露的步驟包括使非人動物暴露于熒光標記的抗原。在一些實施方案中，暴露的步驟包括使非人動物暴露于包含該抗原的一種或多種細胞。在一些實施方案中，暴露的步驟包括使非人動物暴露于包含該抗原的一種或多種人細胞或暴露于包含該抗原的一種或多種細菌細胞。在一些實施方案中，暴露的步驟包括使非人動物暴露于轉(zhuǎn)化有該抗原的一種或多種細胞，使得該抗原在一種或多種轉(zhuǎn)化的細胞的表面上表達。在一些實施方案中，暴露的步驟包括使非人動物暴露于包含該抗原的一種或多種腫瘤細胞。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定或驗證藥物或疫苗的方法，所述方法包括以下步驟：將藥物或疫苗遞送至非人動物，所述非人動物的基因組包括編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分的cd47基因，以及監(jiān)測對藥物或疫苗的免疫應(yīng)答、藥物或疫苗的安全特性或?qū)膊』虿“Y的效應(yīng)中的一者或多者。在一些實施方案中，監(jiān)測安全特性包括確定非人動物是否由于藥物或疫苗的遞送而表現(xiàn)出副作用或不利反應(yīng)。在一些實施方案中，副作用或不利反應(yīng)選自發(fā)病率、死亡率、體重的改變、一種或多種酶(例如肝)的水平的改變、一個或多個器官的重量的改變、功能(例如感覺、運動、器官等)的喪失、增加的對一種或多種疾病的易感性、非人動物的基因組的改變、食物消耗的增加或減少以及一種或多種疾病的并發(fā)癥。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供如本文所述的非人動物在開發(fā)用于醫(yī)學(xué)例如用作藥劑的藥物或疫苗中的用途。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供如本文所述的非人動物在制造用于治療癌癥或瘤的藥劑中的用途。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供如本文所述的非人動物用于評估靶向人細胞的治療性藥物的功效的用途。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物移植有人細胞，并且將靶向所述人細胞的候選藥物施用給動物。在一些實施方案中，藥物的功效通過在施用藥物后監(jiān)測非人動物中的人細胞來測定。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于開發(fā)和/或鑒定用于治療或診斷的藥物(例如，抗體)的如本文所述的非人動物或細胞。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于開發(fā)和/或鑒定用于治療、預(yù)防或改善癌癥或瘤的藥物(例如，抗體)的如本文所述的非人動物或細胞。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供評估靶向人cd47的藥物的藥動學(xué)的方法，所述方法包括以下步驟：將藥物施用給如本文所述的非人動物，以及進行測定以確定靶向人cd47的藥物的一個或多個藥動學(xué)特性。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種評估靶向人cd47的藥物的在靶毒性的方法，所述方法包括以下步驟：將藥物施用給如本文所述的非人動物，以及進行與藥物的在靶毒性相關(guān)的一個或多個參數(shù)的測定。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種評估靶向人cd47的藥物的脫靶毒性的方法，所述方法包括以下步驟：將藥物施用給如本文所述的非人動物，以及進行與藥物的脫靶毒性相關(guān)的一個或多個參數(shù)的測定。

在多個實施方案中，如本文所述的非人動物是嚙齒動物，所述嚙齒動物的基因組包括編碼連接至內(nèi)源cd47多肽的胞內(nèi)部分的人cd47多肽的胞外部分的cd47基因；在一些實施方案中，嚙齒動物是小鼠；在一些實施方案中，嚙齒動物是大鼠。

在一些實施方案中，靶向人cd47的藥物為cd47拮抗劑。在某些實施方案中，cd47拮抗劑是抗cd47抗體。在一些實施方案中，靶向人cd47的藥物為cd47激動劑。

在多個實施方案中，本發(fā)明的cd47基因包括如本文所述的cd47基因。在多個實施方案中，本發(fā)明的cd47多肽包括如本文所述的cd47多肽。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物未可檢測地表達全長內(nèi)源非人cd47多肽。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物未可檢測地表達內(nèi)源cd47多肽的胞外部分。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物未可檢測地表達內(nèi)源cd47多肽和內(nèi)源sirpα多肽二者的胞外部分。

在多個實施方案中，人cd47多肽的胞外部分包含如本文所述的與人cd47多肽的殘基19-141對應(yīng)的氨基酸。

在多個實施方案中，人cd47多肽的n-末端免疫球蛋白v域包含如本文所述的與人cd47多肽的殘基19-127對應(yīng)的氨基酸。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物、細胞、組織、胚胎干細胞和/或胚胎具有的基因組還包含編碼sirpα多肽的sirpα基因，所述sirpα多肽包含人sirpα多肽的胞外部分(例如，與人sirpα多肽的殘基28-362對應(yīng)的氨基酸)和內(nèi)源sirpα多肽的胞內(nèi)部分。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物為嚙齒動物；在一些實施方案中，為小鼠；在一些實施方案中，為大鼠。

如本申請中所用，術(shù)語"約"和"大約"可等同使用。本申請中與或不與約/大約一起使用的任何數(shù)字意在涵蓋由相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的任何正常波動。

本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點在以下詳細描述中是顯而易見的。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細描述雖然指示本發(fā)明的實施方案，但其僅通過舉例說明的方式給出，而不是限制性的。根據(jù)詳細描述，本發(fā)明的范圍內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得明顯。

附圖說明

本專利或申請文件包含至少一個用彩色表現(xiàn)的附圖。根據(jù)請求并支付必要的費用后，專利局將提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_的副本。

本文中包括的由以下各圖組成的附圖僅用于舉例說明目的而非用于限制。

圖1示出非人(例如小鼠)和人分化簇47(cd47)基因的基因組組織的未按比例的示意圖。外顯子的編號在每個外顯子下面。

圖2示出用于使非人分化簇47(cd47)基因人源化的示例性方法的未按比例的示意圖。

圖3示出小鼠和人分化簇47(cd47)基因的基因組組織的未按比例的示意圖。標明了實施例1所述的測定中所用的探針的位置。

圖4示出了通過抗cd47抗體檢測的來自人源化cd47小鼠的紅細胞中cd47表達的示例性直方圖。aba、abb、abc、abd和abe：抗cd47抗體；higg4s：具有效應(yīng)子功能減小的修飾fc區(qū)且具有不相關(guān)特異性的人igg4；higg4：具有不相關(guān)特異性的人igg4抗體。

圖5通過抗cd47抗體示出了來自野生型(n＝2)和人源化cd47(n＝2)小鼠的小鼠紅細胞的示例性血凝。wt：野生型；hucd47：人源化cd47；aba、abb、abc、abd和abe：抗cd47抗體；higg4s：具有效應(yīng)子功能減小的修飾fc區(qū)且具有不相關(guān)特異性的人igg4；higg4：具有不相關(guān)特異性的人igg4抗體。

圖6示出了以抗體濃度(單位μg/ml，y軸)隨時間推移(單位天，x軸)表示的人源化cd47小鼠中的抗cd47抗體的示例性藥動學(xué)曲線；abf、abg、abh和abi：抗cd47抗體；higg4s：具有效應(yīng)子功能減小的修飾fc區(qū)且具有不相關(guān)特異性的人igg4抗體。

圖7示出了以抗體濃度(單位mcg/ml，y軸)隨時間推移(單位天，x軸)表示的人源化cd47/sirpα小鼠(cd47^hu/husirpα^hu/hu)中的抗cd47抗體的示例性藥動學(xué)曲線。abj、abf、abgandabi：抗cd47抗體；higg4s：具有效應(yīng)子功能減小的修飾fc區(qū)且具有不相關(guān)特異性的人igg4抗體。

圖8示出了以抗體濃度(單位mcg/ml，y軸)隨時間推移(單位天，x軸)表示的人源化cd47/sirpα小鼠(cd47^hu/husirpα^hu/hu)中的抗cd47抗體的示例性藥動學(xué)曲線。abj、abf：抗cd47抗體；abfs：具有效應(yīng)子功能減小的修飾fc區(qū)的abf；abfmono：單價型式的abf；higg4s：具有效應(yīng)子功能減小的修飾fc區(qū)且具有不相關(guān)特異性的人igg4抗體。

圖9示出了以抗體濃度(單位mcg/ml，y軸)隨時間推移(單位天，x軸)表示的野生型小鼠中的抗cd47抗體的示例性藥動學(xué)曲線。排除了表現(xiàn)出小鼠抗人抗體應(yīng)答(maha)的小鼠。abj、abf、abi和abg：抗cd47抗體；higg4s：具有效應(yīng)子功能減小的修飾fc區(qū)且具有不相關(guān)特異性的人igg4抗體(星號：由于maha在15天后從higg4s處理組排除的所有點)；abjf(ab’)2：abj的f(ab’)2片段。

定義

本發(fā)明不限于本文中描述的特定方法和實驗條件，因為此類方法和條件可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不旨在進行限制，因為本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求限定。

除非另有定義，否則本文中使用的所有術(shù)語和短語包括所述術(shù)語和短語在本領(lǐng)域中已獲得的含義，除非明確地指出相反或根據(jù)其中使用所述術(shù)語或短語的上下文明顯相反。盡管與本文中描述的那些方法和材料類似或等同的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或測試，但現(xiàn)在描述具體的方法和材料。所提及的所有出版物據(jù)此以引用方式并入。

如本文中用于一個或多個目標值的術(shù)語“大約”是指與所述參照值相似的值。在某些實施方案中，除非另有所指或根據(jù)上下文明顯不同，否則術(shù)語“大約”或“約”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述參照值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小內(nèi)的值的范圍(除了這樣的數(shù)字將超過可能值的100％的情況外)。

如本文中所用，術(shù)語“生物活性”是指在體外或體內(nèi)(例如，在生物體中)在生物系統(tǒng)中具有活性的任何試劑的特性。例如，當(dāng)存在于生物體中時在生物體內(nèi)具有生物效應(yīng)的試劑被認為具有生物活性。在具體實施方案，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或多肽具有生物活性時，所述該蛋白質(zhì)或多肽的共享所述蛋白質(zhì)或多肽的至少一種生物活性的部分通常被稱為“生物活性”部分。

如本文所用，術(shù)語“可比較的”是指兩種或更多種試劑、實體、狀況、條件組等，它們可彼此不同但充分相似以允許它們之間進行比較，以使得可基于觀察到的差異或相似性合理地得出結(jié)論。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在上下文中將理解，在任何給定的情況下，對于兩種或更多種這樣的試劑、實體、狀況、條件組等需要多大程度的同一性來被認為是可比較的。

如本文中用于描述保守氨基酸置換的術(shù)語“保守”是指氨基酸殘基被具有帶相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的側(cè)鏈r基團的另一個氨基酸殘基置換。一般來講，保守氨基酸置換基本上不會改變蛋白質(zhì)的目標功能特性，例如，受體結(jié)合配體的能力。具有帶相似化學(xué)性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸的組的實例包括：脂族側(cè)鏈諸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；脂族-羥基側(cè)鏈諸如絲氨酸和蘇氨酸；含酰胺側(cè)鏈諸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳族側(cè)鏈諸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；堿性側(cè)鏈諸如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性側(cè)鏈諸如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫側(cè)鏈諸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置換組包括例如纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、賴氨酸/精氨酸、丙氨酸/纈氨酸、谷氨酸/天冬氨酸以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些實施方案中，保守氨基酸置換可為丙氨酸對蛋白質(zhì)中的任何天然殘基的置換，如例如丙氨酸掃描誘變中所使用的。在一些實施方案中，保守置換是在gonnet等gonnet等人(1992)exhaustivematchingoftheentireproteinsequencedatabase,science256:1443-45(以引用方式并入)中公開的pam250對數(shù)似然矩陣中具有正值的置換。在一些實施方案中，如果置換在pam250對數(shù)似然矩陣中具有非負值，則該置換被認為是"適度保守的"。

如本文所用，術(shù)語“對照”是指“對照”在本領(lǐng)域中所理解的含義，作為結(jié)果對比的標準。通常，對照通過分離變量以得出有關(guān)此類變量的結(jié)論而用于增進實驗完整性。在一些實施方案中，對照是與測試反應(yīng)或測定同時進行以提供對比物的反應(yīng)或測定。如本文所用，“對照”可以指“對照動物”?！皩φ談游铩笨删哂腥绫疚乃龅男揎棧c本文所述的修飾不同的修飾或不具有修飾(即，野生型動物)。在一個實驗中，應(yīng)用"測試"(即，測試的變量)。在第二實驗"對照"中，不應(yīng)用測試的變量。在一些實施方案中，對照是歷史對照(即，此前進行的測試或測定，或此前已知的量或結(jié)果)。在一些實施方案中，對照是或包括印刷或以其他方式保存的記錄。對照可為陽性對照或陰性對照。

如本文所用，術(shù)語“破壞”是指與dna分子(例如與內(nèi)源同源序列例如基因或基因座)同源重組的結(jié)果。在一些實施方案中，破壞可實現(xiàn)或代表插入、缺失、取代、替換、錯義突變或dna序列移碼或它們的組合。插入可包括插入整個基因或基因片段，例如外顯子，其可來源于除內(nèi)源序列之外的其他來源(例如異源序列)。在一些實施方案中，破壞可提高基因或基因產(chǎn)物的(例如由基因編碼的蛋白質(zhì)的)表達和/或活性。在一些實施方案中，破壞可降低基因或基因產(chǎn)物的表達和/或活性。在一些實施方案中，破壞可改變基因或編碼的基因產(chǎn)物(例如編碼的蛋白質(zhì))的序列。在一些實施方案中，破壞可截短基因或編碼的基因產(chǎn)物(例如編碼的蛋白質(zhì))或使其片段化。在一些實施方案中，破壞可使基因或編碼的基因產(chǎn)物延長；在一些這樣的實施方案中，破壞可實現(xiàn)融合蛋白的組裝。在一些實施方案中，破壞可影響基因或基因產(chǎn)物的水平但不影響其活性。在一些實施方案中，破壞可影響基因或基因產(chǎn)物的活性但不影響其水平。在一些實施方案中，破壞可對基因或基因產(chǎn)物的水平?jīng)]有顯著影響。在一些實施方案中，破壞可對基因或基因產(chǎn)物的活性沒有顯著影響。在一些實施方案中，破壞可對基因或基因產(chǎn)物的水平或活性都沒有顯著影響。

術(shù)語“確定”、“測量”、“評價”、“評估”、“測定”和“分析”在本文中可互換使用以指代任何形式的測量，并包括確定某一要素是否存在。這些術(shù)語包括定量和/或定性測定。測定可為相對的或絕對的?！皽y定...的存在”包括確定存在的某物的量和/或確定其是否存在。

如本文所用，術(shù)語“內(nèi)源基因座”或“內(nèi)源基因”是指如本文所述的在引入斷裂、缺失、置換、改變或修飾之前可見于親本或參考生物體的遺傳基因座。在一些實施方案中，內(nèi)源基因座具有天然存在的序列。在一些實施方案中，內(nèi)源基因座為野生型基因座。在一些實施方案中，參考生物體為野生型生物體。在一些實施方案中，參考生物體為工程化生物體。在一些實施方案中，參考生物體是實驗室培育的生物體(無論是野生型的還是工程化的)。

術(shù)語“內(nèi)源啟動子”是指與內(nèi)源基因天然結(jié)合的啟動子，例如在野生型生物體中。

如本文所用，術(shù)語“異源”是指來自不同來源的試劑或?qū)嶓w。例如，當(dāng)參考多肽、基因或基因產(chǎn)物使用或存在于特定細胞或生物體中時，所述術(shù)語闡明相關(guān)多肽、基因或基因產(chǎn)物：1)被人工工程化；2)被人工(例如，經(jīng)由遺傳工程)引入細胞或生物體(或其前體)中；和/或3)是由相關(guān)細胞或生物體(例如，相關(guān)細胞類型或生物體類型)非天然地產(chǎn)生或非天然地存在于所述細胞或生物體中。

如本文所用，術(shù)語“宿主細胞”是指已將異源(例如，外源)核酸或蛋白質(zhì)引入其中的細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容后將理解，此類術(shù)語不僅指特定的主題細胞，而且還用于指該細胞的子代。因為某些修飾可因突變或環(huán)境影響而在后續(xù)世代中發(fā)生，所以這樣的子代事實上可不等同于親本細胞，但仍包括在如本文中使用的術(shù)語“宿主細胞”的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，宿主細胞為原核或真核細胞或包含原核或真核細胞。一般來講，宿主細胞是適于接受和/或產(chǎn)生異源核酸或蛋白質(zhì)的任何細胞，而與所述細胞被指定所屬的生命界無關(guān)。示例性細胞包括原核生物和真核生物(單細胞或多細胞)的細胞、細菌細胞(例如，大腸桿菌(e.coli)、芽孢桿菌屬菌種(bacillusspp.)、鏈霉菌屬菌種(streptomycesspp.)等的菌株)、分枝桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如，釀酒酵母(s.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、巴斯德畢赤酵母(p.pastoris)、甲醇畢赤酵母(p.methanolica)等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如，sf-9、sf-21、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾(trichoplusiani)等)、非人動物細胞、人細胞或細胞融合物例如雜交瘤或四源雜交瘤。在一些實施方案中，細胞為人、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施方案中，細胞為真核細胞并且選自以下細胞：cho(例如chok1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如cos-7)、視網(wǎng)膜細胞、vero、cv1、腎(例如hek293、293ebna、msr293、mdck、hak、bhk)、hela、hepg2、wi38、mrc5、colo205、hb8065、hl-60、(例如bhk21)、jurkat、daudi、a431(表皮的)、cv-1、u937、3t3、l細胞、c127細胞、sp2/0、ns-0、mmt060562、sertoli細胞、brl3a細胞、ht1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞和來源于前述細胞的細胞系。在一些實施方案中，細胞包含一個或多個病毒基因，例如表達病毒基因的視網(wǎng)膜細胞(例如per.c6tm細胞)。在一些實施方案中，宿主細胞為分離的細胞或包含分離的細胞。在一些實施方案中，宿主細胞為組織的一部分。在一些實施方案中，宿主細胞為生物體的一部分。

如本文所用，根據(jù)其領(lǐng)域所理解的含義，術(shù)語”人源化”是指這樣的核酸或蛋白質(zhì)：所述核酸或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(即，核苷酸或氨基酸序列)包括與非人動物中天然存在的特定基因或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基本上或完全對應(yīng)的部分，并且還包括與相關(guān)的特定非人基因或蛋白質(zhì)中所存在的部分不同但與相應(yīng)的人基因或蛋白質(zhì)中存在的可比較結(jié)構(gòu)更接近對應(yīng)的部分。在一些實施方案中，“人源化”基因是編碼具有與人多肽(例如，人蛋白質(zhì)或其部分-例如其特征性部分)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的基因。僅舉一個實例，在膜受體的情況下，“人源化”基因可編碼具有胞外部分的多肽，所述胞外部分具有的氨基酸序列與人胞外部分的氨基酸序列相同，并且剩余序列與非人(例如小鼠)多肽的序列相同。在一些實施方案中，人源化基因包含人基因的dna序列的至少一部分。在一些實施方案中，人源化基因包含人基因的完整dna序列。在一些實施方案中，人源化蛋白質(zhì)包含出現(xiàn)在人蛋白質(zhì)中的部分的序列。在一些實施方案中，人源化蛋白質(zhì)包含人蛋白質(zhì)的完整序列，并且由對應(yīng)于人基因的同源物或直向同源物的非人動物的內(nèi)源基因座表達。

如本文結(jié)合序列比較使用的術(shù)語“同一性”是指如通過本領(lǐng)域中已知的可用于測量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的許多不同算法中的任何算法所確定的同一性。在一些實施方案中，使用clustalwv.1.83(慢)比對(利用10.0的開放缺口罰分、0.1的延伸缺口罰分)和使用gonnet相似性矩陣(macvectortm10.0.2,macvectorinc.,2008)來確定本文所述的同一性。

如本文所用，術(shù)語“分離的”是指這樣的物質(zhì)和/或?qū)嶓w，所述物質(zhì)和/或?qū)嶓w(1)已與至少一些當(dāng)最初產(chǎn)生(無論天然地還是在實驗環(huán)境中)時與其關(guān)聯(lián)的組分分離，和/或(2)通過人工設(shè)計、產(chǎn)生、制備和/或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可與約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或超過約99％的最初與其關(guān)聯(lián)的其他組分分離。在一些實施方案中，分離的試劑為約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或超過約99％純的。如本文所用，如果物質(zhì)基本上不含其他組分，則其是“純的”。在一些實施方案中，如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，物質(zhì)在與某些其他組分例如一種或多種載體或賦形劑(例如，緩沖液、溶劑、水等)組合后，仍可被認為是“分離的”或甚至“純的”；在此類實施方案中，計算物質(zhì)在不包括此類載體或賦形劑情況下的分離百分比或純度。只是給出一個例子，在一些實施方案中，天然存在的生物聚合物諸如多肽或多核苷酸a)在因其衍生的起源或來源而不與在其天然狀態(tài)下天然伴隨其的一些或全部組分關(guān)聯(lián)時；b)在其基本上不含與天然產(chǎn)生其的物種相同的物種的其他多肽或核酸時；c)當(dāng)由不是天然產(chǎn)生其的物種的細胞或其他表達系統(tǒng)表達或以其他方式與來自所述細胞或其他表達系統(tǒng)的組分關(guān)聯(lián)時，被認為是“分離的”。因此，例如，在一些實施方案中，化學(xué)合成的或在與天然產(chǎn)生其的細胞系統(tǒng)不同的細胞系統(tǒng)中合成的多肽被認為是"分離的"多肽?？蛇x地或另外地，在一些實施方案中，已歷經(jīng)一種或多種純化技術(shù)的多肽在其已與a)在自然界中與其關(guān)聯(lián)的；和/或b)當(dāng)最初產(chǎn)生時與其關(guān)聯(lián)的其他組分分離的程度上可被認為是“分離的”多肽。

如本文所用，術(shù)語“非人動物”是指任何非人的脊椎生物體。在一些實施方案中，非人動物為圓口綱脊椎動物、硬骨魚、軟骨魚(例如，鯊魚或鰩)、兩棲動物、爬行動物、哺乳動物或鳥。在一些實施方案中，非人哺乳動物為靈長類動物、山羊、綿羊、豬、狗、?；驀X動物。在一些實施方案中，非人動物為諸如大鼠或小鼠的嚙齒動物。

如本文所用，術(shù)語“核酸”在其最寬泛的意義上是指被摻入或可被摻入寡核苷酸鏈的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實施方案中，“核酸”是通過磷酸二酯鍵聯(lián)被摻入到或可被摻入到寡核苷酸鏈中的化合物和/或物質(zhì)。從上下文可以看出，在一些實施方案中，“核酸”是指單個核酸殘基(例如核苷酸和/或核苷)；在一些實施方案中，“核酸”是指含有含單個核酸殘基的寡核苷酸鏈。在一些實施方案中，“核酸”為rna或包含rna；在一些實施方案中，“核酸”為dna或包含dna。在一些實施方案中，“核酸”為一個或多個天然核酸殘基、包含一個或多個天然核酸殘基或由一個或多個天然核酸殘基組成。在一些實施方案中，“核酸”為一個或多個核酸類似物、包含一個或多個核酸類似物或由一個或多個核酸類似物組成。在一些實施方案中，核酸類似物與“核酸”的差別在于其不利用磷酸二酯主鏈。例如，在一些實施方案中，“核酸”為一個或多個“肽核酸”、包含一個或多個肽核酸或由一個或多個肽核酸組成，所述肽核酸在本領(lǐng)域中是已知的并且在主鏈中具有肽鍵而非磷酸二酯鍵，其被認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？蛇x擇地或另外地，在一些實施方案中，“核酸”具有一個或多個硫代磷酸酯和/或5’-n-亞磷酰胺鍵聯(lián)而非磷酸二酯鍵。在一些實施方案中，“核酸”為一個或多個天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)、包含一個或多個天然核苷、或由一個或多個天然核苷組成。在一些實施方案中，“核酸”為一個或多個核苷類似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、o(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化堿基、插入型堿基及其組合)、包含一個或多個核苷類似物或由一個或多個核苷類似物組成。在一些實施方案中，與天然核酸中的糖相比，“核酸”包含一個或多個經(jīng)修飾的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2’-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些實施方案中，“核酸”具有編碼功能性基因產(chǎn)物諸如rna或蛋白質(zhì)的核苷酸序列。在一些實施方案中，“核酸”包括一個或多個內(nèi)含子。在一些實施方案中，“核酸”通過下述方式中的一種或多種來制備：從天然來源分離、通過基于互補模板的聚合(體內(nèi)或體外)進行的酶促合成、在重組細胞或系統(tǒng)中的復(fù)制、化學(xué)合成及其組合。在一些實施方案中，“核酸”的長度為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基。在一些實施方案中，“核酸”為單鏈的；在一些實施方案中，“核酸”為雙鏈的。在一些實施方案中，“核酸”具有包含至少一個元件的核苷酸序列，所述元件編碼多肽或與編碼多肽的序列互補。在一些實施方案中，“核酸”具有酶促活性。

如本文所用，術(shù)語“可操作地連接”是指并置，其中所描述的組分處于允許它們以預(yù)期方式起作用的關(guān)系。與編碼序列"可操作地連接"的控制序列以這樣的方式連接，使得在與控制序列相容的條件下獲得編碼序列的表達。"可操作地連接"序列包括與目標基因相鄰的表達控制序列和以反式方式作用或遠距離作用以控制目標基因的表達控制序列。如本文所用，術(shù)語“表達控制序列”是指這樣的多核苷酸序列：所述多核苷酸序列是實現(xiàn)與其相連的編碼序列表達和加工所必需的?！氨磉_控制序列”包括合適的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的rna加工信號例如剪接和多聚腺苷酸化信號；使細胞質(zhì)mrna穩(wěn)定的序列；增強翻譯效率的序列(即kozak共有序列)；增強蛋白穩(wěn)質(zhì)定性的序列；以及當(dāng)需要時，增強蛋白分質(zhì)泌的序列。這種控制序列的性質(zhì)隨宿主生物體而不同。例如，在原核生物中，此類控制序列通常包括啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列，而在真核生物中，典型地，此類表達控制序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語"控制序列"旨在包括其存在對于表達和加工來說是必需的組分，并且還可包括額外的組分，其存在是有利的，例如，前導(dǎo)序列和融合伴侶序列。

如本文所用，術(shù)語“多肽”是指任何氨基酸的聚合鏈。在一些實施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些實施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些實施方案中，多肽具有氨基酸序列，其包含彼此單獨天然存在的部分(即，來自兩種或更多種不同的生物體，例如，人和非人部分)。在一些實施方案中，多肽具有通過人工行為進行設(shè)計和/或產(chǎn)生的被工程化的氨基酸序列。

如本文所用，術(shù)語“重組”旨在指通過重組手段設(shè)計、工程化、制備、表達、產(chǎn)生或分離的多肽(例如，本文所述的cd47多肽)，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主細胞中的重組表達載體表達的多肽、從重組的組合人多肽文庫分離的多肽(hoogenboomh.r.,(1997)tibtech.15:62-70；azzazyh.和highsmithw.e.,(2002)clin.biochem.35:425-445；gavilondoj.v.和larrickj.w.(2002)biotechniques29:128-145；hoogenboomh.和chamesp.(2000)immunologytoday21:371-378)、從用人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如，taylor,l.d.等人(1992)nucl.acidsres.20:6287-6295；kellermanns-a.和greenl.l.(2002)currentopinioninbiotechnology13:593-597；littlem.等人(2000)immunologytoday21:364-370；murphy,a.j.等人(2014)proc.natl.acad.sci.u.s.a.111(14):5153-5158)或通過牽涉將選定的序列元件彼此剪接的任何其他手段來制備、表達、產(chǎn)生或分離的多肽。在一些實施方案中，此類選定的序列元件中的一個或多個是天然存在的。在一些實施方案中，此類選定的序列元件中的一個或多個是計算機設(shè)計的(insilico)。在一些實施方案中，一個或多個此類選定的序列元件由已知序列元件的誘變(例如體內(nèi)或體外)產(chǎn)生，所述已知序列元件例如來自天然來源或合成來源。例如，在一些實施方案中，重組多肽由存在于目標來源生物體(例如人、小鼠等)的基因組中的序列構(gòu)成。在一些實施方案中，重組多肽具有由誘變(例如，體外或體內(nèi)，例如在非人動物中)產(chǎn)生的氨基酸序列，以使得所述重組多肽的氨基酸序列為這樣的序列，該序列雖然源自多肽序列且與多肽序列相關(guān)，但可能不天然存在于非人動物體內(nèi)的基因組內(nèi)。

如本文所用，術(shù)語“替換”是指通過其將宿主基因座中(例如，基因組中)存在的“被替換的”核酸序列(例如，基因)從該基因座移除并將不同的“替換”核酸置于該位置的過程。在一些實施方案中，被替換的核酸序列與替換核酸序列是相互可比較的，因為，例如，它們彼此同源和/或含有相應(yīng)的元件(例如，蛋白質(zhì)編碼元件、調(diào)控元件等)。在一些實施方案中，被替換的核酸序列包含啟動子、增強子、剪接供體位點、剪接接受位點、內(nèi)含子、外顯子、非翻譯區(qū)(utr)中的一個或多個；在一些實施方案中，替換核酸序列包含一個或多個編碼序列。在一些實施方案中，替換核酸序列為被替換的核酸序列的同源物。在一些實施方案中，替換核酸序列為被替換的序列的直向同源物。在一些實施方案中，替換核酸序列為人核酸序列或包含人核酸序列。在一些實施方案中，包括在替換核酸序列為人核酸序列或包含人核酸序列的情況下，被替換的核酸序列為嚙齒動物序列或包含嚙齒動物序列(例如小鼠或大鼠序列)。這樣放置的核酸序列可包含其為用于獲得這樣放置的序列的來源核酸序列的部分的一個或多個調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子、增強子、5'-或3'-非翻譯區(qū)等)。例如，在多個實施方案中，替換是異源序列對內(nèi)源序列的置換，所述置換導(dǎo)致從這樣放置的核酸序列(包含所述異源序列)產(chǎn)生基因產(chǎn)物，但不表達內(nèi)源序列；替換是用編碼與由內(nèi)源序列編碼的蛋白質(zhì)具有相似功能的蛋白質(zhì)的核酸序列替換內(nèi)源基因組序列(例如，內(nèi)源基因組序列編碼cd47蛋白，并且dna片段編碼一個或多個人cd47蛋白)。在多個實施方案中，內(nèi)源基因或其片段被對應(yīng)的人基因或其片段替換。對應(yīng)的人基因或其片段是作為被替換的內(nèi)源基因或其片段的直向同源物的人基因或片段，或在結(jié)構(gòu)和/或功能上與被替換的內(nèi)源基因或其片段基本上相似或相同的人基因或片段。

如本文所用，術(shù)語“分化簇47蛋白”或“cd47蛋白”是指屬于免疫球蛋白超家族的多次跨膜蛋白，并且具有胞外氨基末端免疫球蛋白v域、五個跨膜域和短羧基末端胞內(nèi)尾部。cd47在細胞表面上表達，并且涉及膜表面蛋白例如整聯(lián)蛋白、sirpα和血小板反應(yīng)蛋白-1(tsp-1)之間的相互作用。cd47在正常組織中表達，并且在很多人癌癥中上調(diào)。cd47顯示出涉及多個細胞過程例如細胞凋亡、增殖、粘附和遷移。已鑒定小鼠和人之間若干可變剪接cd47同種型。僅以舉例說明的方式，表3中提供了小鼠和人cd47基因的核苷酸和氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容后將認識到，基因組中的一個或多個內(nèi)源cd47基因(或全部)可被一個或多個異源cd47基因(例如多態(tài)變體、亞型或突變體、來自另一物種的基因、人源化形式等)替代。

如本文所用，“cd47表達細胞”是指表達cd47跨膜蛋白的細胞。在一些實施方案中，cd47表達細胞在其表面上表達cd47跨膜蛋白。在一些實施方案中，cd47蛋白以足夠的量在細胞的表面上表達，通過在細胞的表面上表達的cd47跨膜蛋白介導(dǎo)細胞間相互作用。示例性cd47表達細胞包括神經(jīng)元、免疫細胞、角質(zhì)細胞和循環(huán)細胞。cd47表達細胞調(diào)節(jié)免疫細胞和循環(huán)細胞的相互作用，以調(diào)節(jié)各種細胞過程，諸如粘附、細胞增殖和/或細胞凋亡、血管生成和炎癥。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物展示出經(jīng)由在非人動物的一種或多種細胞表面上表達的人源化cd47蛋白對多個細胞過程(如本文所述)的調(diào)節(jié)。

如本文所用，術(shù)語“參照”描述了與目標試劑、動物、隊列、個體、群體、樣本、序列或值相比較的標準或?qū)φ赵噭㈥犃小€體、群體、樣本、序列或值。在一些實施方案中，參照試劑、隊列、個體、群體、樣本、序列或值的測試或測定與目標試劑、隊列、個體、群體、樣本、序列或值的測試或測定基本上同時進行。在一些實施方案中，參照試劑、隊列、個體、群體、樣本、序列或值為歷史參照，其任選地以有形媒介體現(xiàn)。在一些實施方案中，參照可指對照。如本文所用，“參照”可以指“參照動物”?！皡⒄談游铩笨删哂腥绫疚乃龅男揎?，與本文所述的修飾不同的修飾或不具有修飾(即，野生型動物)。通常，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將理解，參照試劑、動物、隊列、個體、群體、樣本、序列或值一定的條件下進行測定或表征，所述條件與用來測定或表征目標試劑、動物(例如哺乳動物)、隊列、個體、群體、樣本、序列或值的條件類似。

如本文所用，術(shù)語“基本上”是指表現(xiàn)出全部或接近全部范圍或程度的目標特性或性質(zhì)的定性狀況。生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，生物和化學(xué)現(xiàn)象很少(如果有的話)進行至完成和/或進行至完全，或?qū)崿F(xiàn)或避免絕對的結(jié)果。因此術(shù)語“基本上”用于捕捉潛在的在許多生物和化學(xué)現(xiàn)象中固有的完全性的缺乏。

如本文所用，術(shù)語“基本上同源”是指氨基酸或核酸序列之間的比較。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，如果兩個序列在對應(yīng)的位置上含有同源殘基，則它們通常被認為是“基本上同源的”。同源殘基可為相同的殘基。或者，同源殘基可為具有適當(dāng)相似的結(jié)構(gòu)和/或功能特性的不相同的殘基。例如，如由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的，某些氨基酸通常被歸類為“疏水性”或“親水性”氨基酸，和/或歸類為具有“極性”或“非極性”側(cè)鏈。一個氨基酸對另一個相同類型的氨基酸的置換可通常被認為是“同源”置換。典型的氨基酸類別匯總于表1和表2中。

表1

表2

如本領(lǐng)域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多種算法中的任意算法來進行比較，所述算法包括商業(yè)計算機程序中可獲得的那些算法如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、空位blast和psi-blast。示例性的此類程序描述于altschul等人(1990)basiclocalalignmentsearchtool,j.mol.biol.,215(3):403-410；altschul等人(1997)methodsinenzymology；altschul等人,“gappedblastandpsi-blast:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms”,nucleicacidsres.25:3389-3402；baxevanis等人(1998)bioinformatics:apracticalguidetotheanalysisofgenesandproteins,wiley；和misener等人(編輯)(1999)bioinformaticsmethodsandprotocols(methodsinmolecularbiology,第132卷),humanapress。除了鑒定同源序列以外，上文提及的程序通常還提供同源性程度的指示。在一些實施方案中，如果兩個序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相應(yīng)殘基在相關(guān)的殘基序列段(stretch)上是同源的，則這兩個序列被認為是基本上同源的。在一些實施方案中，相關(guān)序列段為完全序列。在一些實施方案中，相關(guān)序列段為至少9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或更多個殘基。在一些實施方案中，相關(guān)序列段包括沿著完全序列的連續(xù)殘基。在一些實施方案中，相關(guān)序列段包括沿著完全序列的不連續(xù)的殘基。在一些實施方案中，相關(guān)區(qū)段為至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個或更多個殘基。

如本文所用，術(shù)語“基本上相同”是指氨基酸或核酸序列之間的比較。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，如果兩個序列在對應(yīng)的位置上含有相同殘基，則它們通常被認為是“基本上相同的”。如本領(lǐng)域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多種算法中的任意算法來進行比較，所述算法包括商業(yè)計算機程序中可獲得的那些算法如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、空位blast和psi-blast。示例性的此類程序描述于altschul等人(1990)basiclocalalignmentsearchtool,j.mol.biol.,215(3):403-410；altschul等人,methodsinenzymology；altschul等人(1997)nucleicacidsres.25:3389-3402；baxevanis等人(1998)bioinformatics:apracticalguidetotheanalysisofgenesandproteins,wiley；和misener等人,(編輯)(1999)bioinformaticsmethodsandprotocols(methodsinmolecularbiology,第132卷),humanapress。除了鑒定相同的序列以外，上文提及的程序通常還提供同一性程度的指示。在一些實施方案中，如果兩個序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相應(yīng)殘基在相關(guān)的殘基序列段上是相同的，則這兩個序列被認為是基本上相同的。在一些實施方案中，相關(guān)序列段為完全序列。在一些實施方案中，相關(guān)區(qū)段為至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個或更多個殘基。

如本文所用，術(shù)語“靶向載體”或“靶向構(gòu)建體”是指包含靶向區(qū)域的多核苷酸分子。靶向區(qū)域包含與靶細胞、組織或動物中的序列相同或基本上相同并且提供靶向構(gòu)建體經(jīng)由同源重組至所述細胞、組織或動物的基因組內(nèi)的位置中的整合的序列。還包括使用位點特異性重組酶識別位點(例如，loxp或frt位點)進行靶向的靶向區(qū)域。在一些實施方案中，本發(fā)明的靶向構(gòu)建體還包含特定目標核酸序列或基因、可選擇標志物、控制和/或調(diào)控序列、以及允許通過幫助或促進牽涉此類序列的重組的蛋白質(zhì)的外源性添加而介導(dǎo)的重組的其他核酸序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的靶向構(gòu)建體還包含全部或部分的目標基因，其中所述目標基因為編碼具有與由內(nèi)源序列編碼的蛋白質(zhì)相似的功能的全部或部分的蛋白質(zhì)的異源基因。在一些實施方案中，本發(fā)明的靶向構(gòu)建體還包含全部或部分的目標人源化基因，其中所述目標人源化基因編碼具有與由內(nèi)源序列編碼的蛋白質(zhì)相似的功能的全部或部分的蛋白質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語“變體”是指顯示出與參照實體的顯著結(jié)構(gòu)同一性但相較于所述參照實體在一個或多個化學(xué)部分的存在或水平上與所述參照實體結(jié)構(gòu)上不同的實體。在許多實施方案中，“變體”還在功能上與其參照實體不同。一般來講，特定實體是否被適當(dāng)?shù)卣J為是參照實體的“變體”是基于其與參照實體的結(jié)構(gòu)同一性的程度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，任何生物或化學(xué)參照實體具有某些特征性結(jié)構(gòu)元件。根據(jù)定義，“變體”是共享一個或多個此類特征性結(jié)構(gòu)元件的不同的化學(xué)實體。只是給出一些例子，小分子可具有特征性核結(jié)構(gòu)元件(例如，大環(huán)核)和/或一個或多個特征性側(cè)鏈部分，以使得小分子的變體是共享核結(jié)構(gòu)元件和特征性側(cè)鏈部分，但在其他側(cè)鏈部分上和/或在存在于核內(nèi)的鍵的類型(單鍵相對于雙鍵，e相對于z，等)上不同的分子，多肽可具有包含在線性或三維空間中相對于彼此具有指定的位置和/或促成特定生物功能的多個氨基酸的特征性序列元件，核酸可具有包含在線性或三維空間中相對于彼此具有指定的位置的多個核苷酸殘基的特征性序列元件。例如，“變體多肽”可由于氨基酸序列中的一個或多個差異和/或共價附接于多肽主鏈的化學(xué)部分(例如，碳水化合物、脂質(zhì)等)中的一個或多個差異而與參照多肽不同。在一些實施方案中，“變體多肽”顯示出與參照多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的總體序列同一性?？蛇x擇地或另外地，在一些實施方案中，“變體多肽”不與參照多肽共享至少一個特征性序列元件。在一些實施方案中，參照多肽具有一種或多種生物活性。在一些實施方案中，“變體多肽”共享參照多肽的一種或多種生物活性。在一些實施方案中，“變體多肽”缺乏參照多肽的一種或多種生物活性。在一些實施方案中，“變體多肽”顯示出相較于參照多肽降低水平的一種或多種生物活性。在許多實施方案中，如果目標多肽具有與親代的氨基酸序列相同但在特定位置上具有少數(shù)序列改變的氨基酸序列，則目標多肽被認為是親代或參照多肽的“變體”。通常，變體中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的殘基相較于親代被置換。在一些實施方案中，“變體”變體相較于親代具有10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個置換的殘基。通常，“變體”具有極少數(shù)目(例如，少于5個、4個、3個、2個或1個)的置換的功能殘基(即，參與特定生物活性的殘基)。此外，相較于親代，“變體”通常具有不超過5個、4個、3個、2個或1個添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于約25個、約20個、約19個、約18個、約17個、約16個、約15個、約14個、約13個、約10個、約9個、約8個、約7個、約6個殘基，并且通常少于約5個、約4個、約3個或約2個殘基。在一些實施方案中，親代或參照多肽是天然發(fā)現(xiàn)的多肽。如將由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，特定目標多肽的多個變體通?？蔀樘烊淮嬖诘模貏e是當(dāng)目標多肽為傳染原多肽時。

如本文所用，術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運與其關(guān)聯(lián)的另一種核酸的核酸分子。在一些實施方案中，載體能夠在宿主細胞諸如真核和/或原核細胞中進行染色體外復(fù)制和/或表達與它們連接的核酸。能夠指導(dǎo)有效連接的基因的表達的載體在本文中被稱為“表達載體”。

如本文所用，術(shù)語“野生型”具有其領(lǐng)域所理解的含義，是指具有如在“正?！?相對于突變、患病的、改變的等)狀態(tài)或環(huán)境中天然存在的結(jié)構(gòu)和/或活性的實體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，野生型基因和多肽通常以多種不同的形式(例如，等位基因)存在。

某些實施方案的詳述

本發(fā)明尤其提供具有編碼分化簇47(cd47)基因的人源化遺傳物質(zhì)的改進的和/或工程化的非人動物，所述非人動物用于確定cd47拮抗劑(例如，抗cd47抗體)的治療功效，所述cd47拮抗劑用于癌癥的治療以及移植植入物、激活和吞噬作用以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的測定。可想到的是，此類非人動物在確定cd47拮抗劑的治療功效及其用于cd47阻斷的潛力方面提供改進。還可想到的是，此類非人動物提供了人細胞的移植植入的改進。因此，本發(fā)明特別可用于開發(fā)抗cd47療法，所述療法用于治療多種癌癥，以及用于維持非人動物中的人造血細胞。具體地講，本發(fā)明包括對鼠科cd47基因的人源化，其導(dǎo)致人源化cd47蛋白在非人動物細胞表面上的表達。此類人源化cd47蛋白能夠提供用于確定抗cd47治療劑激活腫瘤細胞的吞噬作用的功效的人cd47⁺細胞的來源。另外，此類人源化cd47蛋白能夠通過接合植入的人細胞表面上存在的其他細胞表面蛋白和配體(例如，sirpα)來識別植入的人細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物能夠經(jīng)由阻斷通過在非人動物細胞表面上表達的人源化cd47蛋白的cd47信號傳導(dǎo)而激活吞噬作用。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物能夠接納移植的人造血細胞；在一些實施方案中，此類非人哺乳動物發(fā)展和/或具有包含人細胞的免疫系統(tǒng)。在一些實施方案中，人源化cd47蛋白具有與人cd47蛋白的n-末端免疫球蛋白v域?qū)?yīng)的序列。在一些實施方案中，人源化cd47蛋白具有與人cd47蛋白的n-末端部分對應(yīng)的序列，所述人cd47蛋白包含人cd47蛋白的胞外部分和跨膜部分，其中胞外部分包括人cd47蛋白的n-末端免疫球蛋白v域，跨膜部分包括人cd47蛋白的五個跨膜域。在一些實施方案中，人源化cd47蛋白具有與非人(例如，鼠科)cd47蛋白的胞質(zhì)內(nèi)尾部對應(yīng)的序列。在一些實施方案中，人源化cd47蛋白具有與人cd47蛋白的氨基酸殘基19-292(或19-141或19-127)對應(yīng)的序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含含有來自非人動物和異源物種(例如，人)的遺傳物質(zhì)的內(nèi)源cd47基因。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含人源化cd47基因，其中所述人源化cd47基因包含編碼胞外部分的人cd47基因的外顯子，所述胞外部分包括人cd47基因的n-末端免疫球蛋白v域。在一些實施方案中，人源化cd47基因包含人cd47外顯子，例如編碼人cd47蛋白的n-末端部分的外顯子2-7，所述人cd47蛋白包含人cd47蛋白的胞外部分和跨膜部分，其中胞外部分包括人cd47蛋白的n-末端免疫球蛋白v域，跨膜部分包括人cd47蛋白的五個跨膜域。在一些實施方案中，人源化cd47基因包含編碼非人cd47蛋白的全部或部分的信號肽和胞質(zhì)內(nèi)尾部的非人cd47外顯子。在一些實施方案中，人源化cd47基因包含編碼胞質(zhì)內(nèi)尾部和3’utr的非人cd47外顯子1和外顯子7下游的外顯子。根據(jù)同種型，具有終止密碼子和3’utr的外顯子7下游的一個或多個外顯子可存在于所有同種型的最后一個外顯子中。例如，表3所示的小鼠和人cd47二者的同種型2具有外顯子7下游的兩個外顯子，稱為外顯子8和9。

在下面的章節(jié)中詳細地描述本發(fā)明的各個方面。章節(jié)的使用不意味著限制本發(fā)明。每一個章節(jié)可適用于本發(fā)明的任何方面。在本申請中，除非另有說明，"或"的使用意指"和/或"。

分化簇47(cd47)基因

cd47，由于其在免疫細胞上從整聯(lián)蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，原稱為整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(iap)，是包括n-末端免疫球蛋白v(igv)域、五個跨膜域和短c-末端胞質(zhì)內(nèi)尾部的跨膜蛋白。根據(jù)已鑒定的四個可變剪接同種型，胞質(zhì)內(nèi)尾部的長度不同。cd47(或iap)最初描述為在所有組織(同種型2)、神經(jīng)元(同種型4)以及角質(zhì)細胞和巨噬細胞(同種型1；參見reinhold等人(1995)j.cellsci.108:3419-3425)上表達。關(guān)于同種型3的認知很少，盡管該形式具有四個同種型中第二長的胞質(zhì)內(nèi)尾部。除整聯(lián)蛋白之外，已知cd47與許多其他細胞表面蛋白例如血小板反應(yīng)蛋白和sirp家族的成員相互作用。最值得注意的是，cd47與sirpα相互作用，并且引起調(diào)節(jié)許多細胞間應(yīng)答例如吞噬作用的抑制和t細胞激活的雙向信號傳導(dǎo)。實際上，cd47-sirpα相互作用由于其使得腫瘤細胞能夠避開免疫監(jiān)視能力中的作用而在近幾年備受關(guān)注。cd47與sirpα的結(jié)合通常通過用于正常細胞的抗吞噬信號(“請勿吃我(don’teatme)”)來提供保護。然而，據(jù)發(fā)現(xiàn)腫瘤也表達抗吞噬信號，包括cd47，以通過吞噬作用避免破壞。有趣的是，已知cd47在許多血液癌中上調(diào)，并且有助于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移(chao等人(2012)curropinimmunol.24(2):225–232)。

作為癌癥的新療法，靶向cd47和cd47-sirpα通路的完整作用尚未了解，并且研究了一些可能的毒性。需要對cd47信號傳導(dǎo)和cd47-sirpα通路的更完整和詳細的理解來開發(fā)更好的用于未來癌癥治療的靶向療法。

cd47序列

小鼠和人的示例性cd47序列如表3所示。對于mrna序列，粗體表示編碼序列，當(dāng)表示連續(xù)外顯子時，以交替下劃線文本隔開。對于小鼠和人蛋白質(zhì)序列，信號肽加下劃線，胞外序列為粗體，胞質(zhì)內(nèi)序列為斜體。對于人源化蛋白質(zhì)序列，非人序列以常規(guī)字體表示，人序列以粗體表示，信號肽加下劃線。如圖所示，同種型的外顯子數(shù)量不同。例如，人cd47基因的同種型1-4分別具有總共8個、9個、10個和11個外顯子，每個同種型的外顯子2-7編碼胞外域和五個跨膜域。

表3

人源化cd47非人動物

提供非人動物，其在非人動物的細胞表面上表達人源化cd47蛋白，所述人源化cd47蛋白是通過對編碼cd47蛋白的非人動物的內(nèi)源基因座進行遺傳修飾來產(chǎn)生。本文描述的合適的例子包括嚙齒動物，具體地講，小鼠。

在一些實施方案中，人源化cd47基因包含來自異源物種(例如人)的遺傳物質(zhì)，其中所述人源化cd47基因編碼cd47蛋白，所述cd47蛋白包含來自異源物種的遺傳物質(zhì)的被編碼部分。在一些實施方案中，本發(fā)明的人源化cd47基因包含異源物種的基因組dna，所述基因組dna編碼在細胞質(zhì)膜表面上表達的cd47蛋白的胞外部分。在一些實施方案中，本發(fā)明的人源化cd47基因包含異源物種的基因組dna，所述基因組dna編碼在細胞質(zhì)膜表面上表達的cd47蛋白的胞外部分和跨膜部分。提供用于制備包含所述人源化cd47基因的非人動物、非人胚胎和細胞的非人動物、胚胎、細胞和靶向構(gòu)建體。

在一些實施方案中，內(nèi)源cd47基因被缺失。在一些實施方案中，內(nèi)源cd47基因被改變，其中內(nèi)源cd47基因的一部分被異源序列(例如全部或部分的人cd47序列)替換。在一些實施方案中，所有或基本上所有的內(nèi)源cd47基因被異源基因(例如人cd47基因)替換。在一些實施方案中，異源cd47基因的一部分插入內(nèi)源非人cd47基因的內(nèi)源cd47基因座處。在一些實施方案中，異源基因為人基因。在一些實施方案中，對內(nèi)源cd47基因的兩個拷貝之一進行修飾或人源化，從而產(chǎn)生相對于人源化cd47基因雜合的非人動物。在其他實施方案中，提供針對人源化cd47基因雜合的非人動物。

本發(fā)明的非人動物包含在內(nèi)源非人cd47基因座上的全部或部分的人cd47基因。因此，此類非人動物可被描述為具有異源cd47基因。內(nèi)源cd47基因座處的被替換的、插入的、修飾的或改變的cd47基因可使用多種方法(包括例如pcr、western印跡、southern印跡、限制性片段長度多態(tài)性(rflp)或等位基因的獲得或丟失測定)來檢測。在一些實施方案中，非人動物相對于人源化cd47基因是雜合的。在其他實施方案中，提供針對人源化cd47基因純合的非人動物。

在多個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd47基因包括具有第二外顯子、第三外顯子、第四外顯子、第五外顯子、第六外顯子和第七外顯子的cd47基因，所述第二外顯子、第三外顯子、第四外顯子、第五外顯子、第六外顯子和第七外顯子各自具有與表3的人cd47基因中呈現(xiàn)的第二外顯子、第三外顯子、第四外顯子、第五外顯子、第六外顯子和第七外顯子至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的序列。

在多個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd47基因包括具有第一外顯子和外顯子7下游的外顯子(例如，同種型2的第八外顯子和第九外顯子)的cd47基因，所述第一外顯子和外顯子7下游的外顯子各自具有與表3的小鼠cd47基因中呈現(xiàn)的各自的外顯子至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的序列。

在多個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd47基因包括具有5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)的cd47基因，所述5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)各自具有與表3的小鼠cd47基因中呈現(xiàn)的5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的序列。

在多個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd47基因包括具有核苷酸編碼序列(例如cdna序列)的cd47基因，所述核苷酸編碼序列與表3的人cd47核苷酸編碼序列中呈現(xiàn)的核苷酸編碼序列至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有胞外部分，所述胞外部分具有與表3中呈現(xiàn)的人cd47蛋白的胞外部分至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有胞外部分，所述胞外部分具有與表3的人cd47蛋白中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-141相同的氨基酸序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有n-末端免疫球蛋白v域，所述n-末端免疫球蛋白v域具有與表3中呈現(xiàn)的人cd47蛋白的n-末端免疫球蛋白v域至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有n-末端免疫球蛋白v域，所述n-末端免疫球蛋白v域具有與表3的人cd47蛋白中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-127相同的氨基酸序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有n-末端免疫球蛋白v域和五個跨膜域，所述n-末端免疫球蛋白v域和五個跨膜域各自具有與表3中呈現(xiàn)的人cd47蛋白的n-末端免疫球蛋白v域和五個跨膜域至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有胞質(zhì)內(nèi)尾部，所述胞質(zhì)內(nèi)尾部具有與表3中呈現(xiàn)的小鼠cd47蛋白的胞質(zhì)內(nèi)尾部至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有與表3的人cd47蛋白中呈現(xiàn)的氨基酸殘基16-292至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有與表3的人cd47蛋白中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-292至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有與表3的人cd47蛋白中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-292(或16-292)相同的氨基酸序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有與表3中呈現(xiàn)的人源化cd47蛋白的氨基酸序列至少50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

在多個實施方案中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的人源化cd47蛋白具有與表3中呈現(xiàn)的人源化cd47蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

提供制備非人動物的組合物和方法，所述非人動物表達人源化cd47蛋白，包括特定的多態(tài)性形式、等位變體(例如單氨基酸差異)或可變剪接同種型，包括用于制備從人啟動子和人調(diào)節(jié)序列表達此類蛋白質(zhì)的非人動物的組合物和方法。在一些實施方案中，還提供用于制備從內(nèi)源啟動子和內(nèi)源調(diào)節(jié)序列表達此類蛋白質(zhì)的非人動物的組合物和方法。所述方法包括將編碼全部或部分的人cd47蛋白的遺傳物質(zhì)插入非人動物基因組中對應(yīng)于內(nèi)源cd47基因的精確位置，由此產(chǎn)生表達全部或部分的人cd47蛋白的人源化cd47基因。在一些實施方案中，所述方法包括將對應(yīng)于人cd47基因的外顯子2-7的基因組dna插入非人動物的內(nèi)源cd47基因中，從而產(chǎn)生編碼cd47蛋白的人源化基因，所述cd47蛋白包含含有由插入的外顯子編碼的氨基酸的人部分。

在適當(dāng)時，編碼全部或部分的人cd47蛋白的遺傳物質(zhì)或多核苷酸序列的編碼區(qū)可經(jīng)修飾以包括被優(yōu)化來在非人動物中表達的密碼子(例如，參見美國專利no.5,670,356和no.5,874,304)。密碼子優(yōu)化序列為合成序列，并且優(yōu)選地編碼與非密碼子優(yōu)化親代多核苷酸所編碼的多肽相同的多肽(或具有與全長多肽基本上相同活性的全長多肽的生物活性片段)。在一些實施方案中，編碼全部或部分的人cd47蛋白的遺傳物質(zhì)的編碼區(qū)可包括用于針對特定細胞類型(例如，嚙齒動物細胞)優(yōu)化密碼子用途的改變的序列。例如，可對待插入非人動物(例如，嚙齒動物)的內(nèi)源cd47基因的與人cd47基因的外顯子2-7對應(yīng)的基因組dna的密碼子進行優(yōu)化以在非人動物的細胞中表達。此序列可描述為密碼子優(yōu)化序列。

人源化cd47基因法采用相對極小的內(nèi)源基因修飾，并在非人動物中產(chǎn)生天然的cd47介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在多個實施方案中，因為cd47序列的基因組序列是在單一片段中修飾并因此通過包括必需的調(diào)節(jié)序列而保持正常的功能性。因此，在此類實施方案中，cd47基因修飾不會影響其他周圍的基因或其他內(nèi)源cd47相互作用基因(例如，血小板反應(yīng)蛋白、sirp、整聯(lián)蛋白等等)。另外，在多個實施方案中，修飾不會影響功能性cd47跨膜蛋白在質(zhì)膜上的組裝，并經(jīng)由結(jié)合和隨后通過不受修飾影響的蛋白質(zhì)胞質(zhì)部分的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來維持正常的效應(yīng)子功能。

內(nèi)源鼠科cd47基因和人cd47基因的基因組組織的示意圖(未按比例繪制)提供于圖1中。使用包含人cd47基因的外顯子2-7的基因組片段來使內(nèi)源鼠科cd47基因人源化的示例性方法提供于圖2中。如圖所示，通過靶向構(gòu)建體將包含人cd47基因的外顯子2-7的基因組dna插入內(nèi)源鼠科cd47基因的基因座。此基因組dna包括編碼負責(zé)配體結(jié)合的人cd47蛋白的胞外部分和跨膜域(例如，氨基酸殘基16-292)的基因部分。

在內(nèi)源cd47基因座上具有人源化cd47基因的非人動物(例如，小鼠)可通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備。例如，可制備引入具有可選擇標志基因的全部或部分的人cd47基因的靶向載體。圖2示出了包含人cd47基因的外顯子2-7插入的小鼠基因組的內(nèi)源cd47基因座。如圖所示，靶向構(gòu)建體包含含有內(nèi)源鼠科cd47基因的外顯子2上游的序列的5’同源臂(～39kb)，然后是包含人cd47基因的外顯子2-7的基因組dna片段(～23.9kb)、藥物選擇盒(例如，兩側(cè)側(cè)接loxp序列的新霉素抗性基因；～5kb)以及包含內(nèi)源鼠科cd47基因的外顯子7下游的序列的3’同源臂(～99kb)。靶向構(gòu)建體包含自缺失的藥物選擇盒(例如側(cè)接loxp序列的新霉素抗性基因；參見美國專利no.8,697,851、no.8,518,392和no.8,354,389，其全部以引用方式并入本文)。在同源重組時，內(nèi)源鼠科cd47基因的外顯子2-7被靶向載體中包含的序列(即，人cd47基因的外顯子2-7)置換。形成人源化cd47基因產(chǎn)生表達人源化cd47蛋白的細胞或非人動物，所述人源化cd47蛋白包含人cd47基因的外顯子2-7編碼的氨基酸。以發(fā)育依賴的方式移除藥物選擇盒，即從其種系細胞含有上述人源化cd47基因的小鼠衍生的子代將在發(fā)育過程中從分化的細胞脫落可選擇標志物。

本發(fā)明的非人動物可如上文所述或使用本領(lǐng)域已知的方法制備為包含另外的人或人源化基因，通常取決于非人動物的預(yù)期用途。此類另外的人或人源化基因的遺傳物質(zhì)可通過進一步改變具有上述遺傳修飾的細胞(例如，胚胎干細胞)的基因組，或通過本領(lǐng)域已知的繁育技術(shù)利用所需的其他基因修飾品系引入。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物制備為還包含選自sirpα(cd172a)、il-3、m-csf、gm-csf和tpo的一個或多個人或人源化基因。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物可通過將如本文所述的靶向載體引入來自修飾品系的細胞來制備。僅舉一個實例，上述靶向載體可引入rag2缺陷和il-2rγ缺陷小鼠，并且包括四種人細胞因子(rag2^-/-il2rγc^-/-、m-csf^hu、il-3/gm-csf^hu、hsirpα^tg、tpo^hu)。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物制備為還包含人或人源化信號調(diào)節(jié)蛋白α(sirpα)基因。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含如本文所述的人源化cd47基因和來自異源物種(例如，人)的遺傳物質(zhì)，其中所述遺傳物質(zhì)全部或部分編碼選自sirpα(cd172a)、il-3、m-csf、gm-csf和tpo的一個或多個異源蛋白。在某些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含如本文所述的人源化cd47基因和來自異源物種(例如，人)的遺傳物質(zhì)，其中所述遺傳物質(zhì)全部或部分編碼異源(例如，人)sirpα(cd172a)蛋白。在某些實施方案中，本發(fā)明的非人動物還包含sirpα基因，所述sirpα包含內(nèi)源部分和人部分(例如，人sirpα基因的外顯子2-4)，其中所述人部分編碼sirpα蛋白的胞外域(例如，與人sirpα蛋白的殘基28-362對應(yīng)的氨基酸)，內(nèi)源部分編碼內(nèi)源sirpα蛋白的胞內(nèi)域；在一些實施方案中，人部分和內(nèi)源部分可操作地連接至內(nèi)源sirpα啟動子。

例如，如本文所述，包含人源化cd47基因的非人動物還可包含(例如，通過雜交或多基因靶向策略)提交于2010年10月4日的pct/us2010/051339、提交于2013年9月6日的pct/us2013/058448、提交于2013年6月14日的pct/us2013/045788、提交于2014年9月23日的pct/us2014/056910、提交于2014年10月15日的pct/us2014/060568、提交于2014年2月14日的pct/us2012/025040、提交于2012年10月29日的pct/us2012/062379、提交于2014年11月10日的pct/us2014/064806和提交于2014年11月10日的pct/us2014/064810所述的一個或多個修飾；這些專利申請全文以引用的方式并入本文。在某些實施方案中，包含人源化cd47基因的嚙齒動物(即，人cd47基因的外顯子2-7可操作地連接至內(nèi)源嚙齒動物cd47基因的外顯子1和外顯子8(從而任何下游外顯子)，使得人源化cd47基因編碼具有來自人cd47蛋白的胞外部分和來自嚙齒動物cd47蛋白的胞內(nèi)部分的cd47多肽)與包含人源化sirpα基因的嚙齒動物(例如，人sirpα基因的外顯子2-4可操作地連接至內(nèi)源嚙齒動物sirpα基因的外顯子1和5-8，使得人源化sirpα基因編碼具有來自人sirpα蛋白的胞外部分(例如，殘基28-362對應(yīng)的氨基酸)和來自嚙齒動物sirpα蛋白的胞內(nèi)部分的sirpα多肽；參見例如提交于2014年9月23日的pct/us2014/056910，該專利以引用的方式并入本文)雜交。

盡管在文中廣泛地論述人源化cd47基因應(yīng)用于小鼠(即，具有編碼cd47蛋白的cd47基因的小鼠，所述cd47蛋白包括人部分和小鼠部分)的實施方案，但也提供包含人源化cd47基因的其他非人動物。在一些實施方案中，此類非人動物包含可操作地連接至內(nèi)源cd47啟動子的人源化cd47基因。在一些實施方案中，此類非人動物從內(nèi)源基因座表達人源化cd47蛋白，其中所述人源化cd47蛋白包含人cd47蛋白的氨基酸殘基16-292(或19-141或19-127)。此類非人動物包括任何那些可經(jīng)遺傳修飾以表達如文中所述的cd47蛋白的動物，包括例如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔子、豬、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、貂、靈長類動物(例如狨猴、獼猴)等。例如，對于那些適當(dāng)?shù)目山?jīng)遺傳修飾的es細胞不容易獲得的非人動物，采用其他方法來制備包含遺傳修飾的非人動物。此類方法包括例如修飾非es細胞基因組(例如成纖維細胞或誘導(dǎo)的多能細胞)并利用體細胞核轉(zhuǎn)移(scnt)來將遺傳修飾的基因組轉(zhuǎn)移至合適的細胞，例如去核卵母細胞，以及在適于形成胚胎的條件下在非人動物中孕育所述修飾的細胞(例如修飾的卵母細胞)。

用于修飾非人動物基因組(例如豬、牛、嚙齒動物、雞等基因組)的方法包括，例如采用鋅指核酸酶(zfn)或類轉(zhuǎn)錄活化因子效應(yīng)子核酸酶(talen)來修飾基因組以包括人源化cd47基因。

在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物為哺乳動物。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物為小型哺乳動物，例如超家族跳鼠總科或鼠總科的哺乳動物。在一些實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的動物為嚙齒動物。在一些實施方案中，本發(fā)明的嚙齒動物選自小鼠、大鼠和倉鼠。在一些實施方案中，本發(fā)明的嚙齒動物選自超家族鼠總科。在一些實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的動物來自選自下列的家族：麗倉鼠科(例如，類小鼠的倉鼠)、倉鼠科(例如，倉鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、馬島鼠科(攀鼠、巖鼠、具尾大鼠、馬達加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(例如，刺棒睡鼠)和鼴形鼠科(例如，鼴鼠、竹鼠和鼢鼠)。在某些實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的嚙齒動物選自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在某些實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的小鼠是來自鼠科的成員。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物為嚙齒動物。在某些實施方案中，本發(fā)明的嚙齒動物選自小鼠和大鼠。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物為小鼠。

在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物為嚙齒動物，所述嚙齒動物為選自下列的c57bl品系的小鼠：c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola.在某些實施方案中，本發(fā)明的小鼠為選自下列品系的129品系：129p1、129p2、129p3、129x1、129s1(例如129s1/sv、129s1/svim)、129s2、129s4、129s5、129s9/svevh、129/svjae、129s6(129/svevtac)、129s7、129s8、129t1、129t2(參見例如，festing等人,1999,mammaliangenome10:836；auerbach,w.等人,2000,biotechniques29(5):1024-1028,1030,1032)。在某些實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的小鼠是上述129品系和前述c57bl/6品系的混合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的小鼠是上述129品系的混合物，或前述bl/6品系的混合物。在某些實施方案中，如本文所述的混合物的129品系為129s6(129/svevtac)品系。在一些實施方案中，本發(fā)明的小鼠為balb品系，例如balb/c品系。在一些實施方案中，本發(fā)明的小鼠為balb品系和另一種上述品系的混合物。

在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物為大鼠。在某些實施方案中，本發(fā)明的大鼠選自wistar大鼠、lea品系、spraguedawley品系、fischer品系、f344、f6和darkagouti。在某些實施方案中，本文所述的大鼠品系為選自wistar、lea、spraguedawley、fischer、f344、f6和darkagouti的兩個或更多個品系的混合物。

采用具有人源化cd47基因的非人動物的方法

cd47突變體以及轉(zhuǎn)基因非人動物(例如，小型豬)和細胞已有所報道(koshimizuh.等人(2014)plosone,9(2):e89584；lavender,k.j.等人(2014)j.immunol.methods,407:127-134；tena,a.等人(2014)am.j.transplant.doi:10.1111/ajt.12918；lavenderk.j.等人(2013)blood,122(25):4013-4020；tena,a.等人(2012)transplantation94(10s):776；wang,c.等人(2011)celltransplant.20(11-12):1915-1920；johansen,m.l.和brown,e.j.(2007)j.biol.chem.282:24219-24230；wang,h.等人(2007)proc.nat.acad.sci.u.s.a.104:13744-13749；tulasned.等人(2001)blood,98(12):3346-52；oldenborg,p.等人(2000)science288:2051-2054；verdrengh,m.等人(1999)microbesinfect.1(10):745-751；chang,h.p.等人(1999)learnmem.6(5):448-457；wang,x.q.等人(1999)j.cellbiol.147(2):389-400；lindberg,f.p.等人(1996)science274(5288):795-798)。此類動物已用于多個測定，以確定例如cd47表達、功能和調(diào)節(jié)的分子層面。已發(fā)現(xiàn)了重要的物種差異。實際上，非肥胖糖尿/嚴重復(fù)合型免疫缺乏癥(nod/scid)小鼠表達sirpα蛋白，所述sirpα蛋白能夠與人cd47相互作用，因此廣泛用于含有人免疫系統(tǒng)的組分的小鼠模型的開發(fā)(參見例如takenaka,k.等人(2007)nat.immunol.8(120:1313-1323)。這些小鼠中存在的sirpα等位基因不代表其他小鼠品系中存在的sirpα等位基因，一般來講，物種間的cd47和sirpα之間的交叉反應(yīng)很少。另外，已報道小鼠細胞上的cd47具有幾乎完全的移動性，而人細胞上的cd47僅顯示出約30-40％(bruce,l.等人(2003)blood101:4180-4188；mouro-chanteloup,l.等人(2000)voxsanguinis78:p030；mouro-chanteloup,l.等人(2003)blood101:338-344)。因此，nod/scid小鼠并非無限制。例如，雖然在一些遺傳背景中可支持多譜系人造血形成(例如，balb/crag2^-/-il-2rγc^-/-)，但其他細胞類型的穩(wěn)態(tài)仍然是低效的(例如，t和nk細胞；參見例如gimeno,r.等人(2004)blood104:3886-3893；traggiai,e.等人(2004)science304:104-107；legrand,n.等人(2006)blood108:238-245)。另外，還已知cd47與其他細胞表面蛋白相互作用，并提供雙向信號傳導(dǎo)。因此，對于各種生物學(xué)過程例如植入和吞噬作用中cd47依賴性功能的闡述，現(xiàn)有的小鼠代表低效的體內(nèi)系統(tǒng)。另外，對于cd47靶向療法的開發(fā)，現(xiàn)有的小鼠表示亞最佳體內(nèi)系統(tǒng)。

本發(fā)明的非人動物提供表達人cd47的生物材料(例如，細胞)的改進的體內(nèi)系統(tǒng)和來源，其對于多種測定是有用的。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物用于開發(fā)靶向cd47和/或調(diào)節(jié)cd47-sirpα信號傳導(dǎo)的治療劑。在多個實施方案中，本發(fā)明的小鼠用于篩選和開發(fā)結(jié)合人cd47的候選治療劑(例如，抗體)。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物系用于篩選和開發(fā)阻斷人cd47與人sirpα相互作用的治療劑(例如，抗體)。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物用于確定如本文所述的非人動物的細胞表面上人源化cd47的拮抗劑和/或激動劑的結(jié)合曲線。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物用于確定結(jié)合人cd47的一個或多個候選治療性抗體的一個或多個表位。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物用于確定抗cd47抗體的藥動學(xué)曲線。在多個實施方案中，將一種或多種本發(fā)明的非人動物和一種或多種對照或參照非人動物暴露于多種劑量(例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg或更多)的一種或多種候選治療性抗cd47抗體。候選治療性抗體可經(jīng)由任何所需的施用途徑(例如，皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)等)來給藥。在多個時間點(例如0hr、6hr、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或最多30或更多天)從非人動物(人源化和對照組)分離血液?？墒褂玫米匀缥闹兴龅姆侨藙游锏臉颖具M行各種測定以確定施用的候選治療性抗體的藥動學(xué)性質(zhì)，包括但不限于總igg、抗-治療性抗體應(yīng)答、凝集等。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物用于測量阻斷或調(diào)節(jié)cd47信號傳導(dǎo)的治療效果和細胞變化對于基因表達的效應(yīng)。在多個實施方案中，將本發(fā)明的非人動物或從其分離的細胞暴露于與非人動物細胞表面上的人源化cd47蛋白(或cd47蛋白的人部分)結(jié)合的候選治療劑，在隨后一段時間后，分析對腫瘤(或腫瘤細胞)的cd47依賴過程，例如粘附、血管生成、細胞凋亡、發(fā)炎、遷移、吞噬作用、增殖和清除的效應(yīng)。

本發(fā)明的非人動物表達人源化cd47蛋白，因此可產(chǎn)生細胞、細胞系和細胞培養(yǎng)物以用作用于結(jié)合和功能測定的人源化cd47的來源，例如用于cd47拮抗劑或激動劑的結(jié)合和功能的測定，特別是在拮抗劑或激動劑對人sirpα序列或表位具有特異性的情況下。在多個實施方案中，與候選治療性抗體結(jié)合的cd47表位可使用分離自本發(fā)明非人動物的細胞來確定。

來自本發(fā)明的非人動物的細胞可被分離并隨時使用，或可在培養(yǎng)物中維持許多世代。在多個實施方案中，來自本發(fā)明的非人動物的細胞被永生化，并在培養(yǎng)物中無限期(例如，在連續(xù)培養(yǎng)中)維持。

在多個實施方案中，本發(fā)明的細胞和/或非人動物用于存活和/或增殖測定(例如，采用b或t細胞)以篩選和開發(fā)調(diào)節(jié)人cd47信號傳導(dǎo)的候選治療劑。cd47的活化或喪失可在調(diào)節(jié)細胞增殖方面起到重要作用，并且cd47誘導(dǎo)的細胞凋亡可由cd47的胞外域的特異性表位活化所致，因此，可使用本發(fā)明的非人動物的細胞和/或如文中述的非人動物來鑒定、表征和開發(fā)候選cd47調(diào)節(jié)劑(例如，拮抗劑或激動劑)。在一些實施方案中，本發(fā)明的細胞和/或非人動物用于存活或死亡測定中，以確定在存在或不存在cd47的情況下對特定細胞(例如，癌細胞)的增殖和凋亡的效應(yīng)。

在多個實施方案中，本發(fā)明的細胞和/或非人動物用于異源(例如，人)細胞的異種移植，以確定對移植的人細胞的生理(例如，免疫)應(yīng)答中的cd47介導(dǎo)的功能。在一些實施方案中，在本發(fā)明的非人動物中表征結(jié)合或阻斷人cd47的一種或多種功能的候選治療劑。合適的測量包括各種細胞測定、增殖測定、血清免疫球蛋白分析(例如，抗體滴度)、細胞毒性測定以及配體-受體相互作用的表征(免疫沉淀測定)。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物用于表征調(diào)節(jié)針對抗原的免疫應(yīng)答的cd47介導(dǎo)的功能。在一些實施方案中，抗原與瘤相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，抗原與自體免疫疾病或病癥相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，抗原為與需要治療的一個或多個患者所罹患的疾病或病癥相關(guān)聯(lián)的靶標。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物用于移植或過繼轉(zhuǎn)移實驗，以確定化合物或生物劑對調(diào)節(jié)新淋巴細胞及其免疫功能的cd47依賴性調(diào)控的治療潛力。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物移植有人b細胞。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物的細胞用于細胞遷移或鋪展測定，以篩選和開發(fā)調(diào)節(jié)人cd47的候選治療劑。此類過程是多個細胞過程，包括傷口愈合、分化、增殖和存活必須的。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物的細胞用于吞噬作用測定，以確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)cd47依賴性吞噬作用調(diào)節(jié)的治療潛力。

在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物的細胞用于腫瘤細胞生長(或增殖)測定，以確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)cd47依賴性調(diào)控和/或腫瘤細胞凋亡的治療潛力。

在多個實施方案中，在本發(fā)明的一種或多種非人動物中誘發(fā)炎性疾病或病癥以提供體內(nèi)系統(tǒng)，以確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)炎性疾病或病癥的一個或多個功能的cd47依賴性調(diào)控的治療潛力。在一些實施方案中，炎性疾病或病癥與瘤相關(guān)聯(lián)。

在多個實施方案中，在本發(fā)明的一種或多種非人動物中誘發(fā)抗血管生成病癥，以提供體內(nèi)系統(tǒng)，所述體內(nèi)系統(tǒng)用于確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)抗血管生成病癥的一個或多個功能的cd47依賴性調(diào)控的治療潛力。為確定治療功效而評估的示例性功能包括趨化因子表達、一氧化氮(no)刺激應(yīng)答和血流恢復(fù)。

本發(fā)明的非人動物提供用于分析和測試藥物或疫苗的體內(nèi)系統(tǒng)。在多個實施方案中，可將候選藥物或疫苗遞送至本發(fā)明的一種或多種非人動物中，接著監(jiān)測所述非人動物，以確定一種或多種對所述藥物或疫苗的免疫應(yīng)答、此藥物或疫苗的安全特性，或?qū)膊』虿“Y的效應(yīng)。用于確定安全特性的示例性方法包括測量毒性、最佳劑量濃度、藥物或疫苗的功效和可能的風(fēng)險因素。此類藥物或疫苗可在此類非人動物中進行改進和/或開發(fā)。

本發(fā)明的非人動物提供用于評估靶向cd47的藥物的藥動學(xué)特性的體內(nèi)系統(tǒng)。在多個實施方案中，可將靶向cd47的藥物遞送或施用給本發(fā)明的一種或多種非人動物，接著監(jiān)測所述非人動物(或從其所分離的細胞)或進行一種或多種測定，以確定所述藥物對非人動物的效應(yīng)。藥動學(xué)特性包括但不限于動物將藥物處理成各種代謝物的方式(或一種或多種藥物代謝物，包括毒性代謝物的存在或不存在的檢測)、藥物半衰期、施用后藥物的循環(huán)水平(例如藥物的血清濃度)、抗藥物應(yīng)答(例如抗藥物抗體)、藥物吸收和分布、施用途徑、排泄途徑和/或藥物清除。在一些實施方案中，在本發(fā)明的非人動物中或通過使用本發(fā)明的非人動物來監(jiān)測藥物(例如，cd47調(diào)節(jié)劑)的藥動學(xué)和藥效學(xué)特性。

本發(fā)明的非人動物提供用于評估靶向cd47的藥物的在靶毒性的體內(nèi)系統(tǒng)。在多個實施方案中，可將靶向cd47的藥物遞送或施用給本發(fā)明的一種或多種非人動物，接著監(jiān)測所述非人動物(或從其所分離的細胞)或進行一種或多種測定，以確定所述藥物對非人動物的在靶毒性效應(yīng)。通常，藥物旨在用于調(diào)節(jié)一種或多種它們的靶的功能。僅舉一個實例，cd47調(diào)節(jié)劑旨在用于通過以某種方式與一種或多種細胞表面上的cd47分子相互作用來調(diào)節(jié)cd47介導(dǎo)的功能(例如，cd47誘導(dǎo)的細胞凋亡)。在一些實施方案中，這種調(diào)節(jié)劑可具有放大所需的調(diào)節(jié)劑藥理學(xué)作用的不利效應(yīng)。此類效應(yīng)被稱為在靶效應(yīng)。示例性在靶效應(yīng)包括劑量太高、慢性活化/失活以及不正確組織中的正確作用。在一些實施方案中，使用在本發(fā)明的非人動物中或通過使用本發(fā)明的非人動物所鑒定的靶向cd47的藥物的在靶效來確定先前未知的cd47功能。

本發(fā)明的非人動物提供用于評估靶向cd47的藥物的脫靶毒性的體內(nèi)系統(tǒng)。在多個實施方案中，可將靶向cd47的藥物遞送或施用給本發(fā)明的一種或多種非人動物，接著監(jiān)測所述非人動物(或從其所分離的細胞)或進行一種或多種測定，以確定所述藥物對非人動物的脫靶毒性效應(yīng)。當(dāng)藥物與非預(yù)期靶標相互作用(例如對共同表位的交叉反應(yīng)性)時，可發(fā)生脫靶效應(yīng)。此類相互作用可發(fā)生在預(yù)期或非預(yù)期組織中。只是給出一個例子，藥物的鏡像異構(gòu)體(對映異構(gòu)體)可導(dǎo)致脫靶毒性效應(yīng)。另外，藥物可能不適合與不同的受體亞型相互作用或不旨在活化不同的受體亞型。例性脫靶效應(yīng)包括不正確的活化/抑制不正確的靶標，而與其中發(fā)現(xiàn)不正確靶標的組織無關(guān)。在一些實施方案中，靶向cd47的藥物的脫靶效應(yīng)是通過將藥物施用給本發(fā)明的非人動物的效應(yīng)與施用給一種或多種參照非人動物的效應(yīng)進行比較來確定。

在一些實施方案中，進行測定包括確定對施用藥物的非人動物的表型(例如，體重改變)和/或基因型的影響。在一些實施方案中，進行測定包括確定cd47調(diào)節(jié)劑(例如，拮抗劑或激動劑)的批間差異性。在一些實施方案中，進行測定包括確定施用給本發(fā)明非人動物和參照非人動物的靶向cd47的藥物的效應(yīng)之間的差異。在多個實施方案中，參照非人動物可具有如文中所述的修飾、與本文所述的修飾不同的修飾(例如，具有破壞、缺失或另外非功能性cd47基因的修飾)或不具有修飾(即，野生型非人動物)。

可在非人動物(或在從其所分離的細胞中和/或使用從其所分離的細胞)中測量以評估靶向cd47的藥物的藥動學(xué)特性、在靶毒性和/或脫靶毒性的示例性參數(shù)包括但不限于凝集、自噬、細胞分裂、細胞死亡、補體介導(dǎo)的溶血、dna完整性、藥物-特異性抗體滴度、藥物代謝、基因表達陣列、血細胞比容水平、血尿、代謝活性、粒線體活性、氧化應(yīng)激、吞噬作用、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)分泌、應(yīng)激反應(yīng)、靶組織藥物濃度、非靶組織藥物濃度、轉(zhuǎn)錄活性等。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物用于確定cd47調(diào)節(jié)劑的藥學(xué)有效劑量。

本發(fā)明的非人動物系提供用于開發(fā)和表征用于癌癥的候選治療劑的體內(nèi)系統(tǒng)。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物可植入腫瘤，接著施用一種或多種候選治療劑。在一些實施方案中，候選治療劑可包括多特異性抗體(例如雙特異性抗體)或抗體混合物；在一些實施方案中，候選治療劑系包括聯(lián)合療法，例如依序或同時給藥的單特異性抗體的施用。允許腫瘤有足夠的時間建立在非人動物內(nèi)的一或多個位置上?？稍谑┯煤蜻x治療劑之前和之后測定腫瘤細胞增殖、生長等。也可根據(jù)需要在非人動物中測量候選治療劑的細胞毒性。

本發(fā)明的非人動物提供了闡明通過過繼轉(zhuǎn)移相互作用的人細胞間機制的改進的體內(nèi)系統(tǒng)。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物可移植腫瘤異種移植物，然后再次移植腫瘤浸潤淋巴細胞可通過過繼轉(zhuǎn)移來移植到非人動物，以確定根除實性腫瘤或其他惡性腫瘤的有效性。由于唯一存在人cd47，而不與非人動物的內(nèi)源cd47競爭，此類實驗可通過人細胞進行?；蛘撸祟悓嶒灴砂ㄊ褂脕碜詎od/scid或brg(balb/crag2^-/-il-2rγc^-/-)背景的小鼠細胞。另外，用于異種移植的療法和藥物可在此類非人動物中改進和/或開發(fā)。

本發(fā)明的非人動物提供用于通過植入維持和開發(fā)人造血干細胞的改進的體內(nèi)系統(tǒng)。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物提供非人動物內(nèi)人干細胞的改進的開發(fā)和維持。在多個實施方案中，在非人動物的血液、骨髓、脾和胸腺中觀察到分化的人b和t細胞群體的增加。在多個實施方案中，在非人動物的血液、骨髓、脾和胸腺細胞中觀察到最佳t和nk細胞穩(wěn)態(tài)。在多個實施方案中，與一種或多種參照非人動物相比，本發(fā)明的非人動物顯示出紅細胞(rbc)的水平或量增加。

本發(fā)明的非人動物可用于評估靶向人細胞的治療性藥物的功效。在多個實施方案中，本發(fā)明的非人動物移植有人細胞，并且將靶向此類人細胞的候選藥物施用給此類非人動物。然后通過在施用藥物后監(jiān)測非人動物中的人細胞來確定藥物的治療功效?？稍诜侨藙游镏袦y試的藥物包括小分子化合物，即分子量小于1500kd、1200kd、1000kd或800道爾頓的化合物，以及大分子化合物(例如蛋白質(zhì)，如抗體)，其通過靶向人細胞(例如結(jié)合和/或作用其上)而對治療人疾病和病癥具有預(yù)期的治療效果。

在一些實施方案中，藥物為抗癌藥物，并且人細胞為癌細胞，其可為原發(fā)癌的細胞或由原發(fā)癌所建立的細胞系的細胞。在這些實施方案中，本發(fā)明的非人動物移植有人癌細胞，并將抗癌藥物給予所述非人動物。藥物的功效可通過評估非人動物中的人癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移是否因施用該藥物而受到抑制來加以確定。

在具體實施方案中，抗癌藥物為抗體分子，其與人癌細胞上的抗原結(jié)合。在特定實施方案中，抗癌藥物為雙特異性抗體，其與人癌細胞上的抗原結(jié)合，并且與其他人細胞，例如人免疫系統(tǒng)的細胞(或“人免疫細胞”)例如b細胞和t細胞上的抗原結(jié)合。

在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物被植入人免疫細胞或分化成人免疫細胞的細胞。將人癌細胞移植到此類植入人免疫細胞的非人動物，并施用抗癌藥物，諸如結(jié)合人癌細胞上的抗原和人免疫細胞(例如，t細胞)上的抗原的雙特異性抗體。雙特異性抗體的治療功效可根據(jù)其抑制非人動物中人癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移的能力來評估。在具體實施方案中，本發(fā)明的非人動物被植入人cd34⁺造血祖細胞，所述人cd34+造血祖細胞產(chǎn)生人免疫細胞(包括t細胞、b細胞、nk細胞等等)。將人b細胞淋巴瘤細胞(例如，raji細胞)移植到此類植入人免疫細胞的非人動物，然后施用結(jié)合腫瘤抗原(例如，正常b細胞和某些b細胞惡性腫瘤上的抗原諸如cd20)和t細胞受體的cd3亞基的雙特異性抗體，以測試雙特異性抗體抑制非人動物中的腫瘤生長的能力。

實施例

提供以下實施例是為了向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員描述如何制備和使用本發(fā)明的方法和組合物，而非旨在限制發(fā)明人所認為的其發(fā)明的范圍。除非另外指明，否則所給出的溫度為攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。

實施例1.內(nèi)源分化簇47(cd47)基因的人源化

本實施例說明使編碼非人哺乳動物例如嚙齒動物(例如，小鼠)中的分化簇47(cd47)的內(nèi)源基因人源化的示例性方法。描述于本實施例中的方法可使用如所述的任何人序列或人序列的組合(或序列片段)而用于將非人動物的內(nèi)源cd47基因人源化。在該實施例中，將細菌人工染色體(bac)克隆rp11-69a17中存在的人cd47基因用于使小鼠的內(nèi)源cd47基因人源化。

使用技術(shù)構(gòu)建用于使編碼內(nèi)源cd47基因的胞外n-末端igv域和五個跨膜域的遺傳物質(zhì)人源化的靶向載體(參見例如，美國專利no.6,586,251和valenzuela等人(2003)high-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis,naturebiotech.21(6):652-659；這些文獻以引用的方式并入本文)。

簡而言之，對小鼠細菌人工染色體(bac)克隆rp23-230l20(invitrogen)進行修飾，以缺失包含內(nèi)源cd47基因的外顯子2-7的序列，并且使用人bac克隆rp11-69a17(invitrogen)來插入人cd47基因的外顯子2-7，其編碼人cd47多肽的氨基酸16-292。包含同種型2的外顯子1、8和9以及5’和3’非翻譯區(qū)(utr)對應(yīng)的基因組dna的內(nèi)源dna被保留。bac克隆rp11-69a17中包含的人cd47序列的序列分析確認了全部cd47外顯子和剪接信號。序列分析顯示該序列匹配參照基因組和cd47轉(zhuǎn)錄物nm_001777.3和nm_198793.2。通過細菌細胞中的同源重組使內(nèi)源cd47基因的外顯子2-7對應(yīng)的基因組dna(～30.8kb)置換bac克隆rp23-230l20，以插入包含～23.9kb與來自bac克隆rp11-69a17的人cd47基因的外顯子2-7對應(yīng)的基因組人dna和側(cè)接重組酶識別位點的自缺失新霉素盒對應(yīng)的～4995bp的dna片段(loxp-hub1-em7-neo-pa-mprm1-crei-loxp；參見美國專利no.8,697,851、8,518,392和8,354,389，這些專利以引用的方式并入本文)。自缺失新霉素盒加入包含人cd47基因的外顯子2-7的～23.9kb人dna片段的末端(圖2)。靶向載體從5’至3’包含含有～39kb來自bac克隆rp23-230l20的小鼠基因組dna、～29.3kb來自bac克隆rp11-69a17的人基因組dna(包含人cd47基因的外顯子2-7)的5’同源臂、側(cè)接loxp位點的自缺失新霉素盒以及～98.8kb來自bac克隆rp23-230l20的小鼠基因組dna。在細菌細胞中與上述靶向載體的同源重組之后，形成修飾的rp23-230l20bac克隆，產(chǎn)生包含小鼠5’utr、小鼠外顯子1、人外顯子2-7、小鼠外顯子8-9和小鼠3’utr的人源化cd47基因。人源化cd47的四個設(shè)計的可變剪接同種型的蛋白質(zhì)序列提供于表3中，其分別示出了所得的小鼠和人dna編碼的小鼠和人氨基酸。

上述修飾的bac克隆用于電穿孔f1h4(50％129/s6/svev/tac，50％c57bl/6ntac；auerbach,w.等人(2000)biotechniques29(5):1024-8,1030,1032)小鼠胚胎干(es)細胞，形成包含從外顯子2-7人源化的內(nèi)源cd47基因的修飾的es細胞。通過檢測人cd47序列(例如，外顯子2-7)的存在和確認小鼠cd47序列(例如，外顯子1、8和9和/或外顯子2-7)的喪失和/或保留的測定(valenzuela等人，出處同上)來鑒定包含人源化cd47基因的正向靶向的es細胞。表4示出用于確認如上所述的內(nèi)源cd47基因的人源化的引物和探針(圖3)。橫跨上游插入點的核苷酸序列包括以下序列，其示出了鄰接連接至插入點處存在的人cd47序列的插入點上游的內(nèi)源小鼠序列(包含在下面的括號內(nèi)，asisi限制性位點為斜體)：(gcagacatgattacttcagagctttcaaagctagatactgtaccttgcatattccaacac)attttaagattttccatcctagtggaaagatatgatttgattcatcctatttactttgtatattaaagtacagtagaacctgccactttt(seqidno:33)。位于自缺失新霉素盒的5’末端的橫跨下游插入點的核苷酸序列包括以下序列，其示出了人cd47基因組序列與插入點下游的盒序列鄰接(包含在下面的括號內(nèi)，loxp序列為斜體)：ggatccattttaagtaatagaataggatttttaattgttccagtgtttctgtgatagagctgtcctgcacagacctgttt(ctcgagatgcatggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcggg)(seqidno:34)。位于新霉素盒的3’末端的橫跨下游插入點的核苷酸序列包括以下序列，其示出了盒序列與內(nèi)源cd47基因的外顯子7的小鼠基因組序列3’鄰接(包含在下面的括號內(nèi)，loxp序列為斜體)：catgtctggagctagtaactataacggtcctaaggtagcgactagc(attagtatggaaggtccgtccactgtccaggttcctcttgcggagctctttgtctctctggactctgtatacactgcttg)(seqidno:35)。在新霉素盒缺失(剩余76bp)之后橫跨下游插入點的核苷酸序列包括以下序列，其示出了人和小鼠基因組序列與剩余的盒序列l(wèi)oxp序列并置(包含在下面的括號內(nèi)，loxp序列為斜體)：ggatccattttaagtaatagaataggatttttaattgttccagtgtttctgtgatagagctgtcctgcacagacctgttt(ctcgaggctagtaactataacggtcctaaggtagcgactagc)attagtatggaaggtccgtccactgtccaggttcctcttgcggagctctttgtctctctggactctgtatacactgcttgcat(seqidno:36)。

然后使用方法，采用正向es細胞克隆來移植雌性小鼠(參見例如，美國專利no.7,294,754和poueymirou等人f0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedescellsallowingimmediatephenotypicanalyses,2007,naturebiotech.25(1):91-99)，產(chǎn)生包含人cd47基因的外顯子2-7插入小鼠的內(nèi)源cd47基因的一窩幼鼠。使用檢測到人cd47基因序列存在的等位基因測定改型(valenzuela等人，出處同上)，通過從剪尾分離的dna的基因型分析，再次確認和鑒定具有人源化內(nèi)源cd47基因的外顯子2-7的小鼠。將幼鼠進行基因分型并選擇針對人源化cd47基因構(gòu)建體雜合的動物隊列進行表征。

表4

實施例2.通過小鼠紅細胞表達人源化cd47多肽。

本實施例展示了，根據(jù)實施例1的經(jīng)修飾為包含人源化cd47基因的非人動物(例如，嚙齒動物)可用于篩選cd47調(diào)節(jié)劑(例如，抗cd47抗體)并確定多種特性例如藥動學(xué)和安全特性。在本實施例中，在從根據(jù)實施例1制備的嚙齒動物分離的小鼠紅細胞(rbc)上篩選多個抗cd47抗體，該嚙齒動物表達如本文所述的人源化cd47多肽。

簡而言之，將2ml來自人源化cd47小鼠的全血(n＝2)轉(zhuǎn)移至15ml試管，并在4℃下以200×g離心10分鐘。吸出血漿和血塊黃層，然后加入15mlpbs，輕輕地混合細胞。在4℃下以200×g再次離心混合物五分鐘。吸出上清液，再洗滌細胞兩次。將沉淀的rbc重懸于最終體積10mlpbs中。在4℃下以200×g最后一次離心重懸的rbc10分鐘。預(yù)計堆積的rbc的體積為0.5ml，并用pbs(0.5ml堆積的rbc/100mlpbs)稀釋至0.5％的濃度。使用cellometerautot4(1.5×10⁷/ml；nexcelombioscience)測定rbc的實際濃度。

向96孔v底平板的每個孔加入八十(80)μl0.5％小鼠rbc。向每個孔加入抗cd47抗體(20μl,33nm)。輕敲平板混合并在冰上溫育30分鐘。然后用染色緩沖液(含2％fbs的pbs)洗滌平板兩次。向每個孔加入10μg/ml的濃度的二級抗體fab-488(alexafluor488綴合的affinipure小鼠抗人igg，f(ab’)2片段特異性，jacksonimmunoresearch)。在冰上再次溫育平板30分鐘，然后使用染色緩沖液洗滌一次。將每個孔中的細胞重懸于200μl染色緩沖液中，并濾過96孔過濾板。使用bdaccuri^tmc6系統(tǒng)(bdbiosciences)分析平板中的細胞。示例性結(jié)果在圖4中示出。每個測試抗體的高于同種型對照的平均熒光強度(mfi)如表5所示。

表5

higg4s：具有效應(yīng)子功能減小的修飾fc區(qū)的人igg4

如圖4所示，所有抗cd47抗體結(jié)合來自人源化cd47小鼠的rbc?？偠灾緦嵤├故玖?，(1)工程化為包含如本文所述的人源化cd47基因的非人動物(例如，嚙齒動物)表達非人動物的細胞(例如，rbc)表面上的人源化cd47多肽，并且(2)此類細胞用于篩選cd47調(diào)節(jié)劑(例如，cd47抗體)并且確定此類調(diào)節(jié)劑的藥動學(xué)曲線。

實施例3.表達人源化cd47多肽的小鼠紅細胞的血凝。

本實施例還展示了，根據(jù)實施例1的經(jīng)修飾為包含人源化cd47基因的非人動物(例如，嚙齒動物)可用于各種測定(例如，血凝測定)，以篩選cd47調(diào)節(jié)劑(例如，抗cd47抗體)并確定多種特性例如藥動學(xué)和安全特性。在本實施例中，在表達如本文所述的人源化cd47多肽的小鼠紅細胞(rbc)上篩選若干個抗cd47抗體，以確定促進血凝的抗體濃度。

簡而言之，如實施例2所述制備來自野生型和人源化cd47小鼠的rbc(n＝2)。向96孔v底平板的孔1-12加入二十(20)μl抗cd47抗體(5倍連續(xù)稀釋)，然后向平板的全部孔加入80μl0.5％小鼠rbc。輕敲平板混合并在室溫(24-27℃)下溫育30分鐘。目測觀察凝集終點(即，rbc沉降到陰性樣品的底部，而rbc凝集在陽性樣品中)。示例性結(jié)果在圖5中示出，方框描述了顯示出血凝的孔。

如圖5所示，僅凝集素導(dǎo)致野生型小鼠中的凝集。然而，除凝集素之外，兩種抗cd47抗體(abe和abc)也導(dǎo)致來自根據(jù)實施例1制備的兩種人源化cd47嚙齒動物的rbc中的凝集。這兩種抗體從11nm的濃度開始誘導(dǎo)凝集?？偠灾緦嵤├故玖?，工程化為包含本文所述的人源化cd47基因的非人動物(例如，嚙齒動物)可用于評估cd47調(diào)節(jié)劑(例如，cd47抗體)的一個或多個特性(例如，血凝)。

實施例4.人源化cd47嚙齒動物中cd47調(diào)節(jié)劑的藥動學(xué)清除。

本實施例展示了評估非人動物(例如，嚙齒動物)中cd47調(diào)節(jié)劑(例如，抗cd47抗體)的藥動學(xué)清除的方法，所述非人動物被修飾為包含根據(jù)實施例1的人源化cd47基因。在本實施例中，給野生型和人源化cd47嚙齒動物(例如，小鼠)施用抗cd47抗體，并使用elisa測定確定抗體的血清水平。

簡而言之，給人源化cd47的野生型(n＝5)或小鼠純合子(n＝5；如上所述)施用四種抗cd47抗體(abf、abg、abhandabi)和igg4s同種型對照抗體(igg4s)。小鼠的遺傳背景為75％cd57bl/6和25％129sv。在五種人源化cd47嚙齒動物中測試每個抗體。所有抗體以50mg/kg的劑量皮下施用。在施用抗體之前一天(第0天)收集一次前滲血。在6小時、1天、2天、3天、4天、7天、10天和14天收集注射后滲血。分離來自滲血的血清級分，并使其經(jīng)受使用elisa免疫測定進行的總?cè)丝贵w分析。

簡而言之，將山羊抗人igg多克隆抗體(jacksonimmunoresearch)涂覆于96孔板上，以捕獲血清中的測試人抗體，然后使用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗人igg多克隆抗體(jacksonimmunoresearch)和tmb底物(bdpharmingen)檢測結(jié)合到平板的抗體。血清樣品進行六劑量連續(xù)稀釋，各自抗體的參照標準進行12劑量連續(xù)稀釋。根據(jù)使用graphpadprism軟件生成的參照標準曲線計算血清中的藥物抗體濃度。示例性結(jié)果在圖6和表6中示出。

數(shù)據(jù)顯示，施用給如本文所述的野生型和人源化小鼠的抗體具有很好的耐受性?？偠灾緦嵤├故玖?，本發(fā)明的非人動物可用于評估靶向cd47的藥物(例如，抗cd47抗體)的一個或多個藥動學(xué)特性例如循環(huán)藥物水平。此外，本文所述的非人動物可用于通過測定施用后的不利影響評估靶向cd47的藥物的毒性。

表6

實施例5.人源化cd47/sirpα嚙齒動物中cd47調(diào)節(jié)劑的藥動學(xué)曲線。

本實施例展示了評估非人動物(例如，嚙齒動物)中cd47調(diào)節(jié)劑(例如，抗cd47抗體)的藥動學(xué)清除的方法，所述非人動物被修飾為包含人源化cd47(根據(jù)實施例1)和sirpα基因。具體地講，本文所述的人源化cd47嚙齒動物被修飾為還包含含有內(nèi)源部分和人部分的人源化sirpα基因，所述人部分編碼人sirpα蛋白的胞外域(例如，人sirpα蛋白的氨基酸28-362)，所述內(nèi)源部分編碼內(nèi)源sirpα蛋白的胞內(nèi)域(例如，編碼鼠科sirpα蛋白的跨膜和胞內(nèi)部分的氨基酸)，如提交于2014年9月23日的pct/us14/56910所述，該專利以引用的方式并入本文。雙人源化cd47/sirpα小鼠通過人源化sirpα小鼠與人源化cd47小鼠的交配制備。在本實施例中，給雙人源化cd47/sirpα嚙齒動物(例如，小鼠)施用各種抗cd47抗體，并測定其對應(yīng)的藥動學(xué)曲線。

簡而言之，給人源化cd47和sirpα基因的野生型(n＝5)和小鼠純合子組(cd47^hu/^husirpα^hu/hu；每組n＝5)施用選擇抗cd47抗體和igg4同種型對照抗體(higg4s)。小鼠的遺傳背景為75％cd57bl/6和25％129sv。所有抗體以50mg/kg的單次皮下劑量施用。在施用抗體之前一天(第0天)收集一次前滲血。在6小時、1天、2天、3天、4天、7天和10天收集注射后滲血。分離來自滲血的血清級分，并使其經(jīng)受使用elisa免疫測定(如上所述)進行的總?cè)丝贵w分析。另外，在6小時、1天、2天、3天、4天、7天和10天測定血細胞比容水平，并根據(jù)需要進行尿液測試(在6小時和尿液顏色偏離黃色時)，以確定紅細胞計數(shù)。示例性結(jié)果在圖7-9中示出。

如圖7和8所示，所有抗cd47抗體顯示出cd47^hu/husirpα^hu/hu小鼠中的靶標介導(dǎo)清除，具體地講，很多抗cd47抗體顯示出類似的藥動學(xué)曲線。另外，一種抗cd47抗體(abf)的單價型式顯示出比其二價等同物更高的生物利用率(圖8)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在人源化cd47和雙人源化動物(即，cd47^hu/husirpα^hu/hu小鼠)的多個實驗中，抗體具有類似的藥動學(xué)曲線。

abj對血細胞比容水平的影響小于其他測試抗cd47抗體(abf、abg、abi等)，并且在cd47^hu/husirpα^hu/hu小鼠中，與對照(higg4s)相比，血細胞比容水平產(chǎn)生可比較的變化。第2-4天的血細胞比容測定顯示出從正常范圍下降最大(～38.5-45.1％)，其包括施用abf、g和i的組。具體地講，與其他測試抗體相比，abf的單價形式顯示出對血細胞比容的延遲降低影響。發(fā)明人推測，多個處理組之間血細胞比容水平的差異可歸因于各種抗體識別的表位的差異。另外，投予選擇抗cd47抗體的小鼠在6小時顯示出血紅素的尿液試紙測試陽性。例如，abj和abf處理組各自具有一只小鼠在第1天顯示出血紅素陽性，而所有其他時間點為陰性。任何處理組均未觀察到顯著的體重下降(>20％)。

總而言之，本實施例展示了，本發(fā)明的非人動物提供了用于評估一種或多種靶向cd47的藥物(例如，一種或多種抗cd47抗體)的藥動學(xué)特性和/或曲線例如循環(huán)藥物水平的體內(nèi)系統(tǒng)。此外，如本文所述的被工程化為還包含其他人源化基因(例如，人源化sirpα)的非人動物可用于評估一種或多種靶向cd47藥物的靶標介導(dǎo)清除。

等同物

在如此地描述了本發(fā)明的至少一個實施方案的若干方面后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，各種改變、修改和改進對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是容易進行的。此類改變、修改和改進旨在是本公開內(nèi)容的一部分，并且旨在處于本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。因此，上述描述和附圖僅僅作為舉例的方式，并且本發(fā)明通過下面的權(quán)利要求進行詳細描述。

在權(quán)利要求中使用序數(shù)術(shù)語如"第一"、"第二"、"第三"等來修飾權(quán)利要求元素，其本身并不意味著一個權(quán)利要求要素相對于另一個要素的任何優(yōu)先性、優(yōu)先級或順序或者其中執(zhí)行方法行為的時間順序，而是僅用作區(qū)分具有某一名稱的一個權(quán)利要求元素與具有同一名稱的另一個元素(但使用序數(shù)術(shù)語)的標記，以區(qū)分權(quán)利要求元素。

除非明確地指出相反，否則本文說明書和權(quán)利要求中所使用的冠詞"一個"和"一種"在說明書和權(quán)利要求中應(yīng)被理解為包括多個指代物。在組的一個或多個成員之間包括"或"的權(quán)利要求或描述應(yīng)當(dāng)被視為是滿足以下情況，即組成員中的一個、多于一個或全部存在于、被應(yīng)用于給定的產(chǎn)品或方法中，或以其他方式與給定的產(chǎn)品或方法相關(guān)，除非指出相反或根據(jù)上下文明顯不同。本發(fā)明包括這樣的實施方案，其中組中的一個確切成員存在于、被應(yīng)用于給定的產(chǎn)品或方法中，或以其他方式與給定的產(chǎn)品或方法相關(guān)。本發(fā)明還包括這樣的實施方案，其中多于一個組成員或全部組成員存在于、被應(yīng)用于給定的產(chǎn)品或方法中，或以其他方式與給定的產(chǎn)品或方法相關(guān)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括涵蓋所有的變型、組合和置換，其中來自一條或多條所列權(quán)利要求的一個或多個限制、要素、子句、描述性用語被引入從屬于同一基礎(chǔ)權(quán)利要求的另一個權(quán)利要求(或者相關(guān)的任何其他權(quán)利要求)中，除非另外指出或除非對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說明顯會引起矛盾或不一致。當(dāng)要素以列表的形式(例如以馬庫什組或類似形式)呈現(xiàn)時，應(yīng)當(dāng)理解這些要素的每個亞組也被公開，并且任何要素可從該組中去除。應(yīng)當(dāng)理解，通常，當(dāng)本發(fā)明或本發(fā)明的方面被稱為包含特定的要素、特征等時，本發(fā)明的某些實施方案或本發(fā)明的方面由此類要素、特征等組成或基本上由它們組成。為了簡化的目的，這些實施方案并不是在每種情況下都明確用本文陳述的那么多用詞來具體描述。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的任何實施方案或方面可明確地從權(quán)利要求排除，不管在說明書中是否描述了此類具體排除。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可歸因于本文中所述的測定或其他方法中獲得的值的典型標準偏差或誤差。

本文引用的用以描述本發(fā)明背景以及用以提供與其實施有關(guān)的其他細節(jié)的出版物、網(wǎng)站和其他參考材料均據(jù)此以引用方式并入。

序列表

<110>regeneronpharmaceutical`s,inc.

<120>具有人源化分化簇47基因的非人動物

<130>32584(10108wo01)

<140>

<141>

<150>62/087,992

<151>2014-12-05

<160>36

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>5591

<212>dna

<213>小家鼠

<400>1

gcctacaccgggagagcagggaggaggagttggactgaggttgggcggctccgaggtcca60

gggcgagcttggccagagggagtagagagcagcggggctgcgcagggacgcgtgccgtga120

gttccggtgagcgtgtgtgtcccatgctcccgtctttcaggccggcccaggacacgaagc180

cggaagagagctggctggagggacgggggccgtgagcagagagtgcaacccgcgcagccc240

cggggacaggctgattcttggcgctctccgccggagcctgcccagggctgggtgtgaggc300

tggcgtcacgtcaacgagcagaggcggccaggcggggcggagtgcgcgtgcgcggggcgg360

cgagcacgcgcgcgcgcgcacccccgggcagcctgggcggccgctcctgcctgtcactgc420

tgcggcgctgctggtcggtcgtttcccttgaaggcagcagcggaggcggcggctgctcca480

gacacctgcggcggcgaccccccggcggcgcggagatgtggcccttggcggcggcgctgt540

tgctgggctcctgctgctgcggttcagctcaactactgtttagtaacgtcaactccatag600

agttcacttcatgcaatgaaactgtggtcatcccttgcatcgtccgtaatgtggaggcgc660

aaagcaccgaagaaatgtttgtgaagtggaagttgaacaaatcgtatattttcatctatg720

atggaaataaaaatagcactactacagatcaaaactttaccagtgcaaaaatctcagtct780

cagacttaatcaatggcattgcctctttgaaaatggataagcgcgatgccatggtgggaa840

actacacttgcgaagtgacagagttatccagagaaggcaaaacagttatagagctgaaaa900

accgcacggccttcaacactgaccaaggatcagcctgttcttacgaggaggagaaaggag960

gttgcaaattagtttcgtggttttctccaaatgaaaagatcctcattgttattttcccaa1020

ttttggctatactcctgttctggggaaagtttggtattttaacactcaaatataaatcca1080

gccatacgaataagagaatcattctgctgctcgttgccgggctggtgctcacagtcatcg1140

tggttgttggagccatccttctcatcccaggagaaaagcccgtgaagaatgcttctggac1200

ttggcctcattgtaatctctacggggatattaatactacttcagtacaatgtgtttatga1260

cagcttttggaatgacctctttcaccattgccatattgatcactcaagtgctgggctacg1320

tccttgctttggtcgggctgtgtctctgcatcatggcatgtgagccagtgcacggccccc1380

ttttgatttcaggtttggggatcatagctctagcagaactacttggattagtttatatga1440

agtttgtcgaataggtgaagggaagtgacggactgtaacttggaagtcagaaatggaaga1500

atacagttgtctaagcaccaggtcttcacgactcacagctggaaggaacagacaacagta1560

actgacttccatccaggaaaacatgtcacataaatgattactaagtttatattcaaagca1620

gctgtactttacataataaaaaaaatatgatgtgctgtgtaaccaattggaatcccattt1680

ttctattgtttctactcaactaggggcaaacgtttcaggggcaacttccaagaatgatgc1740

ttgttagatcctagagtctctgaacactgagtttaaattgattccgagtgagactcgcca1800

agcactaacctgagggttagttacccagagatacctatgaaaaacagtggtatccagcaa1860

gccttagtaaactcaggttgccagcagctttgccacttccgctgctagctgaataacaag1920

actgccacttctgggtcatagtgatagagactgaagtagaaaaacgaatgtggttgggca1980

aatcccgtgtggcccctctgtgtgctatgatattgatggcactggtgtcttcattcttgg2040

gggttgccatcattcacacacacccctttgacatacagtgcaccccagttttgaatacat2100

tttttttgcaccctgtcccgttctgctactttgatttgcgttatgatatatatatatata2160

tataataccttttctcctctttaaacatggtcctgtgacacaatagtcagttgcagaaag2220

gagccagacttattcgcaaagcactgtgctcaaactcttcagaaaaaaaggaaaaaaaaa2280

aaaagctatagttgtaacatatgtattccagacctctggtttaaaggcaaaagaaaaaaa2340

atctacagtgtttcttctcatgttttctgatcggaggcatgacaaagcaagactgaaatc2400

tgaactgtgtctcctgcatggcaacacgtgtctccgtcaggccctcgcaaggcccgggga2460

gggggttctacgcctcttgtctctttgttgcatgctgaacactcatcgccttcctactgt2520

atcctgcctcctgcagcctccctcttcctcctcctcttcctcttcctcctcttcctcctc2580

ctcctcctcttcctccaagtttgaaaggtcaaacaaaactaccacattccctacccagtt2640

agaagaaaaccaccgtcctgacagttgtgatcgcatggagtacttttagattattagcac2700

ctgtttttacctcgtttgtgggcgtgtttgtatgtgcacatgtatgaagtcggcacatgc2760

accttctgtatgggcagaggcgtggcatctacagaagagcagatgccaactttgtgcttt2820

tagtgaatacattaaaaaaaaaaaaccaacggtccttattgagtggaattctatttgatg2880

caaatatttgagctctttaagactttaaaactagataatgtgccaagcttttaggactgc2940

tcaccagtgccctctgaagaaacaccagtactttttcctgtttgtgtaataaaggcatat3000

ttgtatttgtgtttgcatcactaatggttatttcttcttagtccactgaatgtttccatg3060

tgcctctcgtatgccaaactttttgtcatctttcatgtggggaccaaatggtttgtctgt3120

ggcaaacctaaacctatgacctgctgaggcctctcagaaaactgaccacagtaccaagat3180

agtacttcgcaaagaaaagtaggttccctccctggttttgtagctgtcgccaatattagc3240

gtaattccaaggagctgaacgcctttatataaatctgatggcacctgatgcttttagttc3300

tgaaaatatttacactcggatcatgttgttgatgacttaaacaaagttttgatgaagaga3360

gcaaaaaaaaagcaggtggatttggaacagtttcagggttttttttgttttttgtttttt3420

gtttttgtttttttttttttatttttgtttttctgttctctgttagaaaagtcaggtgtt3480

ctctgtcaggctatctttatagtcaattttttttacgaactaaagtagtaccttttaata3540

tgtagtcaacgcccctctgctcggggttcagttttgggtcttaaccagctgtcatgttct3600

ctatgctgcctgccacttgaggcactgagtgccctagacagtcccatcggtggtagccag3660

ggaaacgaaagacgaactcaactcttgctcctaataatcaactctctgtatgaaggatgg3720

cagcattaagagtcctcctgcctgggcattattgggccagttcaccctctttaaatcaaa3780

cccgcagtggctcccagttctcgtcccatcagatttaaattgctaacagtatggggggca3840

ccacgcatctgttttgtcccacaatgcgcttttctctcccaaatcccgatttctgctgtc3900

atagcctctattcaatttttatttattgtctgccctccacttatacaatcgtagagagca3960

atgccatttgtcactttctgcaacagttttttgagcctttatggctgaatcccatttttc4020

ttctctttcaaactgtttgctccattgctcctcccgcacggctgtccgtacagtcatccc4080

atccatctgggggcctctttcatctctcacccttcctggtgcttcgtggatctctgctta4140

cctctgtgggtttttttttttttttttgacttattcttctcactggactttaagattact4200

tccacagcgaaagtgctgcctcccttttctgcccgcagtgttctgcgtactttagatact4260

actcagtgctgacatttgatggcaaaagttgcctgcacttaaatttctctttttaatagg4320

gtgaactagagttggagtttttttctcttttttctcttttctctctctctctctctctct4380

ctctctctctctctctctctctccctccctccctccctccctccctccctccctctctct4440

ctctttttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttcttt4500

ttttgacaaatctcacaggctttgagaattataaaaggtgacagttcacctgaaaatcac4560

aggtctggtctgtttaaattgttgagaaatatccgattaaaagtcttgtggctgtgtcct4620

aataggctctctttcaggacgttgtagtcaatagagtggctgaaccatacttgagtttat4680

aaagctcaaaaactgatgcacccactctgctattatcgtgttagtaagagttcagctgta4740

tatcattgtctaggtttatcttgtcctacagtgggtattcaaatatggccaccagaggat4800

atgtgtaaatataagcacctgtatttgcctgttgttgagaactggagggaaaacaaaaaa4860

tgtctggcaaccctttgcctttttaaccgtaattaattgacagtttatttagagataaga4920

gttttcaaaaatctcttaactgccacaacccacagagggtcttgttttgccatcttcagt4980

ggctcacagatatgatccaagttaacttgaaagagatgagcagtacccaggaaattgtcc5040

tgcctttaactctggctgtccttaattatgactgtttaatgctgaattttccatccgtct5100

agtgtttgagggtaaagaaaagccttttttaaataagtatttctgtaaaacggcatcggt5160

gggatcttctgtgttgctatcacgggtgaaagagggaaacatttcttatttttattaagc5220

agagcattatttacagaaagccattgttgagaattagttcccacatcatataaatatcca5280

ttaaccattctaaattgtaagagaactccagtgttgctatgcacaaggaactctcctggg5340

ggcctttttttgcatagcaattaaaggtatgctatttgtcagtagccattttttgcagtg5400

atttaaagaccaaagttgttttacagctgtgttacccttaaaggttttttttttatgtat5460

taaatcaatttatcactgtttgaagctttgaatacctgcaatctttgccaagatactttt5520

ttatttaaaaaaataactgtgtaaatattaccctgtaatattatatatacttaataaaac5580

attttaagcta5591

<210>2

<211>312

<212>prt

<213>小家鼠

<400>2

mettrpproleualaalaalaleuleuleuglysercyscyscysgly

151015

seralaglnleuleupheserasnvalasnserilegluphethrser

202530

cysasngluthrvalvalileprocysilevalargasnvalgluala

354045

glnserthrgluglumetphevallystrplysleuasnlyssertyr

505560

ilepheiletyraspglyasnlysasnserthrthrthraspglnasn

65707580

phethrseralalysileservalseraspleuileasnglyileala

859095

serleulysmetasplysargaspalametvalglyasntyrthrcys

100105110

gluvalthrgluleuserarggluglylysthrvalilegluleulys

115120125

asnargthralapheasnthraspglnglyseralacyssertyrglu

130135140

gluglulysglyglycyslysleuvalsertrppheserproasnglu

145150155160

lysileleuilevalilepheproileleualaileleuleuphetrp

165170175

glylyspheglyileleuthrleulystyrlysserserhisthrasn

180185190

lysargileileleuleuleuvalalaglyleuvalleuthrvalile

195200205

valvalvalglyalaileleuleuileproglyglulysprovallys

210215220

asnalaserglyleuglyleuilevalileserthrglyileleuile

225230235240

leuleuglntyrasnvalphemetthralapheglymetthrserphe

245250255

thrilealaileleuilethrglnvalleuglytyrvalleualaleu

260265270

valglyleucysleucysilemetalacysgluprovalhisglypro

275280285

leuleuileserglyleuglyileilealaleualagluleuleugly

290295300

leuvaltyrmetlysphevalglu

305310

<210>3

<211>5560

<212>dna

<213>小家鼠

<400>3