本發(fā)明屬海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種七帶石斑魚精子穩(wěn)定、高效超低溫冷凍保存的方法。

背景技術(shù)：

七帶石斑魚(Epinephelus septemfasciatus)，鱸形目(Perciformes),鱸亞目、鮨科(Serranidae),石斑魚亞科(Epinephelinae),石斑魚屬(Epinephelus)，俗稱：七帶斑、石斑、子魚、真脂、過魚，主要分布于黃海與東海沿岸，是唯一分布在黃海區(qū)域的石斑魚品種。七帶石斑魚屬于大型石斑魚，具有生長快、耐低溫、適應(yīng)能力強、營養(yǎng)物質(zhì)豐富、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點，深受廣大消費者的喜愛，具有較大的經(jīng)濟價值和市場潛力。七帶石斑魚的研究是從2002年開始的，主要集中在人工繁育技術(shù)、胚胎發(fā)育、肌肉營養(yǎng)、疾病等方面，七帶石斑魚苗種規(guī)模化繁育技術(shù)和人工養(yǎng)殖方面的研究性工作報道較少。石斑魚是雌性先熟，雄性后熟并具有性逆轉(zhuǎn)(Sex reversal)特性，雄性親魚獲得較難，優(yōu)質(zhì)精子難以獲得，是石斑魚苗種規(guī)?；a(chǎn)受到限制的一個重要因素。集中批量保存優(yōu)質(zhì)七帶石斑魚精液，在需要時解凍進行人工授精獲得受精卵，從而克服了七帶石斑魚優(yōu)質(zhì)精液供不應(yīng)求的困難。建立七帶石斑魚精子超低溫保存的可靠方法對促進七帶石斑魚苗種規(guī)?；嘤约胺N質(zhì)資源的保護都具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種七帶石斑魚精子穩(wěn)定、高效超低溫冷凍保存的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種七帶石斑魚精子超低溫保存的方法，將七帶石斑魚的精液與抗凍液按體積比5:1-10:1的比例混合，混合后經(jīng)過一步平衡，三步降溫處理后投入到液氮(-196℃)，分裝保存；抗凍液由稀釋液、二甲基亞砜(DMSO)、蔗糖三部分組成；

其中，稀釋液為NaCl 7.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 0.1g/L，NaHCO₃ 0.4g/L；12-15％DMSO(二甲基亞砜)；添加劑：蔗糖30-35g/L。

所述七帶石斑魚的精液與抗凍液在碎冰中(0℃)輕輕震蕩、充分混勻10-30s，，在0-4℃平衡0.5-1min，然后以-10--12℃/min降溫至-80--100℃，然后以-15--20℃/min降溫至-150--160℃，然后以-25--30℃/min降溫至-150--180℃后投入到液氮(-196℃)，分裝保存。

所述抗凍液在使用前放置于0℃冰箱中預(yù)冷過夜，待用。

所述經(jīng)抗凍液混合的七帶石斑魚的精液置于0.5ml麥管或者2-5ml的凍存管中。

將經(jīng)液氮處理分裝保存的七帶石斑魚凍精進行解凍，將其直接放入35-37℃水浴100-110s，然后置于室溫18-20℃放置至完全融化，而后于自然海水中激活。

載玻片滴入100μL海水，然后加入1-2μL激活后凍精，吸打3-5混勻，隨即去3個視野，檢測運動的精子數(shù)量占視野中所有精子數(shù)量的比例，經(jīng)檢測凍精相對復(fù)蘇率高于90％。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1.本發(fā)明冷凍保存過程中采用DMSO作凍劑，保持較好滲透性的同時DMSO的保護效果作用穩(wěn)定；

2.本發(fā)明抗凍液中加入了蔗糖30.0 g/L作為細胞外部保護劑，對精子的質(zhì)膜起到很好的保護作用；

3.本發(fā)明冷凍保存過程中采用0.5ml麥管，或2-5ml凍存管都獲得較好的保存效果，可根據(jù)需求選擇存貯的容器；

4.本發(fā)明技術(shù)方案中降溫前鮮精與抗凍液震蕩混勻10-30s,0-4℃平衡0.5-1min，直接放入程序降溫儀中，節(jié)省了時間，操作簡便易行；同時精子與抗凍液的比例為5:1－10:1比以往1:3－1:1的保存，利于人工授精，同時節(jié)約精液；

5.本發(fā)明冷凍保存過程以分段降溫時，采用以-10℃/min速度降溫，-20℃/min，-30℃/min三部降溫法，適宜的速度是精子可以充分脫水同時又可使冷凍精子安全度過“危險溫度區(qū)”，然后投入液氮，整個保存過程不超過15min；冷凍保存降溫程序精密，重復(fù)性穩(wěn)定性好，好凍精解凍后復(fù)蘇率高，激活后相對復(fù)活率高于90％，與鮮精活力狀態(tài)差異不顯著；

6.本發(fā)明冷凍精子從液氮中取出后，采用35℃-37℃解凍，可使精子快速度過重結(jié)晶區(qū)，同時又避免了局部溫度過高導(dǎo)致的損傷。

具體實施方式

以下具體實施例用于詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并非僅限于這些例子。實施例1

1)2013年8月份正值七帶石斑魚生殖生殖期，于萊州東方海洋親魚車間，親魚養(yǎng)殖車間，將雄魚從養(yǎng)殖池中撈出，放置于海綿上，蒸餾水沖洗生殖孔三次，紙巾擦凈，輕輕從后向前擠壓腹部獲得2尾雄魚的新鮮精液2ml，存于干凈的離心管中，避光，顯微鏡檢測活力高于85-90％，置于冰盒中回實驗室進行冷凍保存，置于冰盒中進行冷凍保存；

2)抗凍液配制，由稀釋液、抗凍劑、添加劑和蒸餾水組成，配置后置于0℃冰箱預(yù)冷，待用；其中，稀釋液為：NaCl 7.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 0.1g/L，NaHCO₃ 0.35g/L；10％DMSO(二甲基亞砜)；添加劑：蔗糖30g/L。

抗凍液的配置過程：首先用蒸餾水配置稀釋液，秤取NaCl 7.5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，Na₂HPO₄·2H₂O 0.1g，NaHCO₃ 0.35g，蔗糖30g然后定容 至1L備用；然后凍存精液前取88ml稀釋液，加入12mlDMSO，即可配置成抗凍保護液使用。

3)將上述鮮精與抗凍液以體積8:1(鮮精：抗凍液)的比例混合，而后在碎冰中(0℃)輕輕震蕩、充分混勻20s，分裝至0.5ml麥管中，同時程序降溫儀開啟，預(yù)冷至0℃；

4)將凍存管置于降溫儀中以-10℃/min降溫速率降溫至-80℃，然后以-15℃/min降溫速率降溫至-150℃，然后以-15℃/min降溫速率降溫至-150℃，將所有的凍存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一順序放入凍存盒然后放入液氮容器中長期貯存(-196℃)；

5)將上述冷凍保存2周后精液進行解凍，任意選取3個凍存管解凍，解凍前將凍存盒先置于盛有液氮的保溫盒中，然后將凍存管快速從盒中取出放入35-37℃水浴鍋中，輕輕搖動100s，然后置于室溫18-20℃放置于振蕩器震蕩30s至完全融解；

6)將上述融解后精液用自然海水激活，激活后取1-2μL凍精滴加在滴有100μL海水的載玻片上，然后吸打3-5混勻，在顯微鏡檢測，經(jīng)檢測凍精相對復(fù)蘇率高于90％，同時在顯微鏡隨即去3個視野，檢測運動的精子數(shù)量占視野中所有精子數(shù)量的比例，在顯微鏡檢測凍精活力80-90％，且80％以上的凍精均作快速的直線運動。

實施例2

1)2014年9月份正值七帶石斑魚生殖期，于萊州東方海洋親魚車間，將雄魚從養(yǎng)殖池中撈出，放置于海綿上，蒸餾水沖洗生殖孔三次，紙巾擦凈，輕輕從后向前擠壓腹部獲得鮮精。共采集七帶石斑魚3尾，共計鮮精12ml，顯微鏡檢測活力85-90％，置于冰盒中回實驗室進行冷凍保存，置于冰盒中進行冷凍保存。

2)抗凍液配制，由稀釋液、抗凍劑、添加劑和蒸餾水組成，配置后置于0℃冰箱預(yù)冷，待用；其中，稀釋液為：NaCl 7.5g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 0.1g/L，NaHCO₃ 0.4g/L，15％DMSO(二甲基亞砜)；添加劑：蔗糖30g/L。

抗凍液的配置過程：首先用蒸餾水配置稀釋液，秤取NaCl 7.5g，Na₂HPO₄·2H₂O 0.1g，NaHCO₃ 0.4g，蔗糖30g然后定容至1L備用；然后凍存精液前取88ml稀釋液，加入12mlDMSO，即可配置成抗凍保護液使用。

3)將上述鮮精與抗凍液以體積8:1(鮮精：抗凍液)的比例混合，而后在碎冰中(0℃)輕輕震蕩、充分混勻20s，分裝至2ml凍存管中，同時程序降溫儀開啟，預(yù)冷至0℃；

4)將凍存管置于降溫儀中以-10℃/min降溫速率降溫至-80℃，然后以-15℃/min降溫速率降溫至-150℃，然后以-15℃/min降溫速率降溫至-150℃，將所有的凍存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一順序放入凍存盒然后放入液氮容器中長期貯存(-196℃)；

5)將上述冷凍保存1年后精液進行解凍，任意選取3個凍存管解凍， 解凍前將凍存盒先置于盛有液氮的保溫盒中，然后將凍存管快速從盒中取出放入35-37℃水浴鍋中，輕輕搖動100s，然后置于室溫18-20℃放置于振蕩器震蕩30s至完全融解；

6)將上述融解后精液用自然海水激活，激活后取1-2μL凍精滴加在滴有100μL海水的載玻片上，然后吸打3-5混勻，在顯微鏡檢測，隨即去3個視野，檢測運動的精子數(shù)量占視野中所有精子數(shù)量的比例，在顯微鏡檢測凍精活力80-90％，且80％以上的凍精均作快速的直線運動。