本發(fā)明涉及野菊多糖促進白術(shù)生長期增加白術(shù)內(nèi)酯含量的積累，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬Atractylodes多年生草本植物白術(shù)A.macrocephala的干燥根莖，主要產(chǎn)于浙江、安徽、湖南、江西等地，其中浙江白術(shù)品質(zhì)上佳，白術(shù)內(nèi)酯類成分為白術(shù)主要的藥效學(xué)成分，對人類胃癌、腸道疾病有明顯防控功效。次生代謝物的低產(chǎn)現(xiàn)象是制約天然產(chǎn)物規(guī)?；瘧?yīng)用的核心問題之一。雖然國內(nèi)外研究者針對次生代謝物低產(chǎn)問題進行了研究，包括優(yōu)良株系選育，培養(yǎng)技術(shù)改造、目標(biāo)組分合成關(guān)鍵酶的合成等，其關(guān)鍵是尋找有效誘導(dǎo)子促進代謝物的生物合成。

野菊多糖是野菊(Chrysanthemum indicum L)主要的活性成分之一，其由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6種單糖組成，具有提高免疫力、降血脂、抗氧化及誘導(dǎo)抗性(專利號：)等功效。但其與次生代謝物的關(guān)系還未見研究報道，研究發(fā)現(xiàn)野菊多糖可以促進白術(shù)植物中白術(shù)內(nèi)酯類成分的代謝累積，提高白術(shù)藥效成分，增加質(zhì)量。本發(fā)明的野菊多糖用于誘導(dǎo)白術(shù)內(nèi)酯倍量增加之用途屬于首次發(fā)現(xiàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提高白術(shù)內(nèi)酯成分積累的新型誘導(dǎo)子，特別是一種野菊多糖促進劑及其制備方法。從而使白術(shù)具有高含量的白術(shù)內(nèi)酯含量、且非浙江地區(qū)種植的白術(shù)同樣具有高含量的道地成分，進而提高白術(shù)的經(jīng)濟效益和市場價值。

本發(fā)明的白術(shù)內(nèi)酯促進劑的制備方法包括以下幾個步驟：

(1)野菊多糖的制備：a、采集野菊并在60℃-70℃烘箱中烘干，粉碎，過80-100目篩；

b、在上述野菊粉末中分別加入野菊粉末質(zhì)量15-20倍的體積量的純水，煎煮2-3次，每次2-3小時，取汁去渣，合并濾液，過濾，得野菊水提物溶液；

c、減壓低溫濃縮野菊水提物溶液至比重為1.1-1.31；

d、濃縮液加1％活性炭脫色2-3次，抽濾，得到脫色后的濃縮液；

e、在濃縮脫色后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液體積6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃靜置過夜；

f、待沉淀析出后，以3000-4500rpm離心上述混合液10-15min，取沉淀，使用冷凍干燥法干燥沉淀，得到野菊粗多糖；

g、在野菊粗多糖中加入粗多糖質(zhì)量75-80倍的體積量的蒸餾水，并加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩20-25min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重復(fù)上述g步驟多次，除去糖蛋白，得純野菊多糖。

野菊多糖也可以通過市場途徑購買得到，純度可以是10％-99％，可據(jù)實際情況配制成適用濃度。

以上野菊多糖輔以常用的藥用賦形劑，制成水劑、粉劑等劑型，噴施與農(nóng)作物植株上，用于提高白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯II和白術(shù)內(nèi)酯III的含量，提高白術(shù)的質(zhì)量。

上述野菊多糖作為誘導(dǎo)子提高白術(shù)藥效成分含量的用途，其特征在于，輔以常用的藥用賦形劑，可制成水劑、粉劑、顆粒劑等劑型，該促進劑施用濃度為1-200g/L，優(yōu)選濃度為1-20g/L。

上述野菊多糖作作為誘導(dǎo)子提高白術(shù)藥效成分含量的用途，其特征在于，通過浸種、灌根和噴施處理，野菊多糖對幼苗苗期的白術(shù)促進其內(nèi)酯類成分的累積形成。

上述野菊多糖作為抗病誘導(dǎo)子在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，其特征在于，該野菊多糖可以從菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum)包括野菊(Chrysanthemum indicum L)、北野菊(C.boreale Mak.)或巖香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)等的全草包括根莖和花中提取得到。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明選擇白術(shù)樣品植物，分別考察野菊多糖對白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯積累的促進作用。結(jié)果顯示：野菊多糖生物制劑能有效地誘導(dǎo)白術(shù)生長期內(nèi)白術(shù)藥效學(xué)物質(zhì)-白術(shù)內(nèi)酯類成分的累積，提高了白術(shù)道地性質(zhì)量，為白術(shù)的優(yōu)質(zhì)優(yōu)產(chǎn)提出了有效手段，顯示出良好的市場前景。本發(fā)明開辟了野菊多糖作為誘導(dǎo)子促進白術(shù)種植中品質(zhì)的提高的新用途，并且成本低廉、使用方便、效果明顯，在中藥農(nóng)業(yè)上具有很好的開發(fā)利用價值，應(yīng)用空間廣闊。

附圖說明

圖1：白術(shù)中自術(shù)內(nèi)酯I(atractylenolide-I)和白術(shù)內(nèi)酯III(atractylenolide-III)，白術(shù)內(nèi)酯II(atractylenolide-II)的HPLC圖譜；其中a和b為對照組CK；c和d為施用野菊多糖組

以下實驗例用于進一步說明本發(fā)明

實驗例1野菊多糖促進白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯類成分累積的效應(yīng)

本實驗以白術(shù)為對象，研究野菊多糖對白術(shù)內(nèi)酯的影響。

1.1野菊多糖的提取

(1)采集野菊花蕾野菊(Chrysanthemum indicum L.)并在烘箱中烘干，粉碎，過80-100目篩，稱取500g備用；

(2)在上述野菊粉末中分別加入野菊粉末質(zhì)量6-8倍的體積量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小時，取出，過濾，濾渣水浴加熱揮干剩余石油醚，得到脫色后的野菊粉末；

(3)在脫色后的野菊粉末中分別加入野菊粉末質(zhì)量18-20倍的體積量的純水，煎煮2-3次，每次2-3小時，取汁去渣，合并濾液，過濾，得野菊水提物溶液；

(4)減壓低溫濃縮野菊水提物溶液至比重為1.15-1.25：

(5)在濃縮后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液體積6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃靜置過夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm離心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷凍干燥法干燥沉淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖質(zhì)量75-80倍的體積量的蒸餾水，并加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩20-25min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重復(fù)上述(7)步驟8-9次，除去糖蛋白，得純野菊多糖13.56g，硫酸-苯酚法測定純度為99％。

(8)野菊多糖水溶液的配制：取上述野菊多糖適量，分別配制成10mg/ml、2mg/ml和0.4mg/ml的水溶液，密封貯藏，備用。

1.2野菊多糖對白術(shù)內(nèi)酯含量的影響

(1)田間試驗設(shè)計

試驗共設(shè)7個處理：分別配制成10mg/ml的多糖藥劑(ETH)、2mg/ml的多糖藥劑(ETM)和0.4mg/ml的多糖藥劑(ETL)的水溶液，分別采用葉面噴施(ETH葉、ETM葉、ETL葉)和灌根(ETH根、ETM根、ETL根)兩種方法；清水空白對照組(CK)。每處理重復(fù)3次。

(2)實驗樣品采集

試驗田位于浙江農(nóng)林大學(xué)德清試驗基地和浙江農(nóng)林大學(xué)平山試驗基地，試驗時間2013年12月至2014年11月。2012年12月將浸種處理的白術(shù)種子播種在試驗田，試驗期間人工除草、人工摘蕾，不使用其他任何除草劑、滅菌劑。2014年5月開始，每隔10天噴藥一次，共噴3次，同時有無菌水為對照。在白術(shù)采集期2014年10月分別采集實驗基地的樣品，每處理隨機采集5株，洗掙后50℃下烘干，保存于冰箱備用。

(3)樣品中自術(shù)內(nèi)酯類成分的測定

i色譜條件

色譜柱：Sun Fire C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相甲醇(A)和水(B)，梯度洗脫程序為0-14min，73％-89％A；14-15min，89％-95％A；15-22min，95％-100％A；22-26min，100％A。體積流量1mL/min，進樣量20μL，柱溫30℃，白術(shù)內(nèi)酯I、III的檢測波長為220nm，白術(shù)內(nèi)酯II檢測波長為276nm。

白術(shù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的測定即按此程序進行。

ii白術(shù)供試品溶液的制備

將上述備用白術(shù)樣品切片粉碎過200目篩制成白術(shù)粉末，精密稱取0.5g置于10ml容量瓶中，加8ml甲醇超聲提取30分鐘，靜止后用甲醇定容至10ml，搖勻，過有機微孔濾膜(0.45μm)得供試品溶液。

(4)數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

(5)結(jié)果與分析

如圖1顯示野菊多糖水溶液施用后與對照組比較白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯I、II、III含量顯著提高。表1.顯示平山、德清試驗田噴施野菊多糖的處理組的白術(shù)內(nèi)酯含量均高于對照組。其中ETH葉、ETH根和ETL根組達到顯著差異水平。采用灌根處理和葉面噴施的高劑量組藥效最好。

表1.野菊多糖對白術(shù)中內(nèi)酯類成分的影響

注：所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示P＝0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示P＝0.01水平上差異極顯著

下述實施例均能實現(xiàn)以上實驗例的效果

具體實施方式

實施例1：野菊多糖的提取方法

(1)采集北野菊(C.boreale Mak.)花并在烘箱中烘干，粉碎，過100目篩，稱取1kg備用；

(2)在上述野菊粉末中分別加入野菊粉末質(zhì)量6-8倍的體積量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小時，取出，過濾，濾渣水浴加熱揮干剩余石油醚，得到脫色后的野菊粉末；

(3)在脫色后的野菊粉末中分別加入野菊粉末質(zhì)量18-20倍的體積量的純水，煎煮2-3次，每次2-3小時，取汁去渣，合并濾液，過濾，得野菊水提物溶液；

(4)減壓低溫濃縮野菊水提物溶液至比重為1.15-1.25；

(5)在濃縮后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液體積6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃靜置過夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm離心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷凍干燥法干燥沉淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖質(zhì)量75倍的體積量的蒸餾水，并加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩20min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重復(fù)上述(7)步驟8次，除糖蛋白，得純野菊多糖26.76g，經(jīng)采用硫酸-苯酚法測定野菊多糖的純度為98％，備用。

實施例2：水劑的制備

取實施例1中提取得到的野菊多糖，加入適量水配制成含野菊多糖100g/L的水溶液，搖勻，密封儲藏。在白術(shù)生長的苗期噴施與葉面上，結(jié)果與對照組比較，能顯著提高白術(shù)內(nèi)酯含量。

實施例3：粉劑的應(yīng)用

按實施例1法制備得到野菊多糖(純度為98％)，干燥，加工成細粉，密封儲藏。臨用時，配制成含野菊多糖50g/L的水溶液，噴施于白術(shù)葉面上，結(jié)果與對照組比較，能顯著提高白術(shù)內(nèi)酯類成分的含量。

實施例4：水劑的應(yīng)用

重復(fù)實施例1的步驟(1)-(6)得到野菊粗多糖，在野菊粗多糖中加入粗多糖質(zhì)量80倍的體積量的蒸餾水，并加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩25min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重復(fù)操作4遍，除糖蛋白，得野菊多糖38g，經(jīng)采用硫酸-苯酚法測定野菊多糖的純度為50％。加蒸餾水配置成含野菊多糖為1g/L的溶液，搖勻，貯藏備用。在白術(shù)生長的苗期，灌根，結(jié)果與對照組比較，能顯著提高白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯類成分的含量。

實施例5野菊多糖的制備

(1)采集巖香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)全草，并在烘箱中烘干，粉碎，過80目篩，稱取2kg備用；

(2)在上述巖香菊粉末中分別加入粉末質(zhì)量6-8倍的體積量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小時，取出，過濾，濾渣水浴加熱揮干剩余石油醚，得到脫色后的野菊粉末；

(3)在脫色后的巖香菊粉末中分別加入粉末質(zhì)量20倍的體積量的純水，煎煮2-3次，每次2-3小時，取汁去渣，合并濾液，過濾，得野菊水提物溶液；

(4)減壓低溫濃縮野菊水提物溶液至比重為1.10-1.30：

(5)在濃縮后的巖香菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液體積9倍的90％-95％的乙醇，4℃靜置過夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm離心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷凍干燥法干燥沉淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖質(zhì)量50倍的體積量的蒸餾水，并加入與蒸餾水同體積的三氯乙酸：正丁醇(體積比為1∶8-10)，劇烈震蕩20min，靜置，待分層，取下清液，除去上層正丁醇層及中層雜蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重復(fù)上述(7)步驟6次，除糖蛋白，得純巖香菊多糖26.76g，經(jīng)采用硫酸-苯酚法測定野菊多糖的純度為59％，備用。

實施例6

取實施例6中提取得到的野菊多糖，加入適量水配制成含野菊多糖90g/L的溶液，搖勻，密封儲藏。在白術(shù)生長的苗期噴施與葉面上，結(jié)果與對照組比較，能顯著提高白術(shù)內(nèi)酯含量。

還需說明的是：經(jīng)本申請人實驗。以野菊多糖作為誘導(dǎo)子配制的誘導(dǎo)劑顯示出誘導(dǎo)白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯類成分的顯著累積，且與施用劑量及施用方法有關(guān)聯(lián)，因此，施用濃度的下限值可以下降到含野菊多糖0.1g/L，當(dāng)然施用濃度的上限值也可以根據(jù)實際情況上調(diào)。