本發(fā)明涉及稱(chēng)為W8的新型馬鈴薯栽培品種以及由所述馬鈴薯種類(lèi)產(chǎn)生的塊莖、植物、植物部分、組織培養(yǎng)物和種子。本發(fā)明還涉及由馬鈴薯栽培品種W8產(chǎn)生的食物產(chǎn)品，如薯?xiàng)l、薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯片以及馬鈴薯粒。本申請(qǐng)案中列舉的所有公開(kāi)案皆以引用的方式并入本文中。馬鈴薯是全世界第四重要的食物作物并且是目前為止最重要的蔬菜。目前幾乎美國(guó)的每個(gè)州都商業(yè)種植馬鈴薯。在美國(guó)，每年馬鈴薯產(chǎn)量超過(guò)1800萬(wàn)噸并且全世界超過(guò)30000萬(wàn)噸。馬鈴薯的普及性主要來(lái)源于其變通性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。馬鈴薯可在新鮮時(shí)、冷凍或脫水后使用，或可加工成面粉、淀粉或酒精。其含有復(fù)雜的碳水化合物并且富含鈣、煙酸和維生素C。食品工業(yè)中的馬鈴薯質(zhì)量受兩個(gè)關(guān)鍵因素的不利影響：(1)馬鈴薯含有大量天冬酰胺，一種在油炸或烘烤時(shí)會(huì)快速氧化形成丙烯酰胺(一種致癌產(chǎn)物)的非必需游離氨基酸；和(2)馬鈴薯極易發(fā)生酶促褐變和褪色(當(dāng)多酚氧化酶從受傷的馬鈴薯的被破壞的質(zhì)體滲漏時(shí)發(fā)生的不良事件)。在細(xì)胞質(zhì)中，酶氧化苯酚，其接著快速聚合以產(chǎn)生黑色素。塊莖含有大量磷酸化淀粉，其中一些在儲(chǔ)存期間降解以產(chǎn)生葡萄糖和果糖。這些還原糖當(dāng)在超過(guò)120℃的溫度下加熱時(shí)與氨基酸反應(yīng)以形成包括丙烯酰胺的梅納產(chǎn)物(Maillardproducts)。淀粉磷酸化中涉及的兩種酶是水二激酶R1和磷酸化酶-L(R1和PhL)。褐變也作為淀粉部分降解成葡萄糖和果糖的結(jié)果而以非酶促方式觸發(fā)。許多馬鈴薯栽培品種易患晚疫病，其是一種由真菌類(lèi)卵菌綱病原體致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的破壞性疾病。馬鈴薯的晚疫病通過(guò)葉子和莖干上可快速擴(kuò)散并且變得壞死的黑色/褐色病灶鑒別。當(dāng)致病疫霉(P.infestans)在宿主作物上快速生長(zhǎng)和繁殖時(shí)發(fā)生嚴(yán)重晚疫病傳染性。迄今為止，不存在可產(chǎn)生具有低丙烯酰胺含量、增加的黑斑碰傷耐受性、降低的還原糖以及增加的對(duì)晚疫病的抗性的塊莖的馬鈴薯植物種類(lèi)。因此，需要研發(fā)具有降低的毒性化合物含量和增加的對(duì)疾病的抗性，而不使用未知的或外來(lái)核酸的馬鈴薯種類(lèi)。本發(fā)明滿(mǎn)足這種需要。相關(guān)技術(shù)的前述實(shí)例和與其相關(guān)的局限性意圖是說(shuō)明性并且不是排它性的。相關(guān)技術(shù)的其它局限性在所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員閱讀說(shuō)明書(shū)時(shí)將變得顯而易見(jiàn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：結(jié)合系統(tǒng)、工具和方法描述以下實(shí)施例和其各方面，其意圖是例示性，不限制范圍。在各種實(shí)施例中，減少或消除一或多種上述問(wèn)題，而其它實(shí)施例引導(dǎo)其它改良。為此目的，本發(fā)明提供經(jīng)核酸序列轉(zhuǎn)型的新型馬鈴薯種類(lèi)W8，其對(duì)于馬鈴薯植物基因體來(lái)說(shuō)是原生的并且不含外來(lái)DNA、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)DNA、病毒標(biāo)記或載體主鏈序列。實(shí)際上，插入到馬鈴薯種類(lèi)W8的基因體中的DNA對(duì)馬鈴薯來(lái)說(shuō)是原生或?qū)σ吧婉R鈴薯(一種馬鈴薯性相容植物)來(lái)說(shuō)是原生的非編碼聚核苷酸，其使涉及黑點(diǎn)損傷的表達(dá)、天冬酰胺聚集和衰老甜化的基因沉默。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供植物載體，稱(chēng)為pSIM1278，其包含第一沉默盒，所述第一沉默盒含有DNA區(qū)段的兩個(gè)復(fù)本，其按反義定向包含天冬酰胺合成酶-1基因(fAsn1)的片段和多酚氧化酶-5基因的3'-非翻譯序列；和第二沉默盒，其含有DNA區(qū)段的兩個(gè)復(fù)本，其按反義定向包含馬鈴薯磷酸化酶-L(pPhL)基因的片段和馬鈴薯R1基因的片段。pSIM1278載體包含9,512bp主鏈區(qū)域，其支持植物轉(zhuǎn)型作用之前植物DNA的維持并且在植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)型作用時(shí)不轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，和10,148bpDNA插入?yún)^(qū)域，其包含在轉(zhuǎn)型作用時(shí)穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞的基因體中的原生DNA。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供第二植物載體，稱(chēng)為pSIM1678，其包含Rpi-vnt1表達(dá)盒和植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因VInv的沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白質(zhì)編碼區(qū)組成，所述編碼區(qū)由其原生啟動(dòng)子和終止序列調(diào)節(jié)以賦予對(duì)晚疫病的廣泛抗性，而沉默盒由來(lái)自由相對(duì)植物啟動(dòng)子pGbss和pAgp側(cè)接的馬鈴薯VInv基因的序列的反向重復(fù)組成。pSIM1678載體包含9,512bp主鏈區(qū)域，其支持植物轉(zhuǎn)型作用之前植物DNA的維持并且在植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)型作用時(shí)不轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，和9,090bpDNA插入?yún)^(qū)域，其包含在轉(zhuǎn)型作用時(shí)穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞的基因體中的原生DNA。在不同的實(shí)施例中，本發(fā)明提供經(jīng)一或多種本發(fā)明的植物載體轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供馬鈴薯植物種類(lèi)，其包含一或多個(gè)經(jīng)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)型的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，馬鈴薯植物種類(lèi)表達(dá)載體pSIM1278的兩個(gè)沉默盒中的至少一個(gè)并且表達(dá)載體pSIM1678的沉默盒，并且沉默盒的表達(dá)引起植物的塊莖中天冬酰胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因和液泡轉(zhuǎn)化酶基因的下調(diào)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，表達(dá)至少一個(gè)沉默盒的馬鈴薯植物種類(lèi)的塊莖顯示兩種或更多種在相同種類(lèi)的未經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物的塊莖中不存在的理想特性。在本發(fā)明的最優(yōu)選方面中，所述兩種或更多種理想是選自由以下組成的群組：低天冬酰胺聚集、黑點(diǎn)損傷減少、熱誘導(dǎo)丙烯酰胺形成減少以及在儲(chǔ)存期間還原糖的聚集減少。在本發(fā)明的不同方面中，馬鈴薯植物種類(lèi)表達(dá)植物DNA載體pSIM1278的兩個(gè)沉默盒，且表達(dá)載體pSIM1678的沉默盒，并且沉默盒的表達(dá)引起馬鈴薯植物種類(lèi)的塊莖中天冬酰胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因、磷酸化酶-L基因、二激酶R1基因和液泡轉(zhuǎn)化酶基因的下調(diào)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，表達(dá)植物DNA載體pSIM1278的兩個(gè)沉默盒和表達(dá)載體pSIM1678的沉默盒的馬鈴薯植物種類(lèi)的塊莖顯示兩種或更多種在相同種類(lèi)的未經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物的塊莖中不存在的理想特性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述兩種或更多種理想特性是選自由以下組成的群組：低天冬酰胺聚集、黑點(diǎn)損傷減少、在儲(chǔ)存期間還原糖的聚集減少和熱誘導(dǎo)的丙烯酰胺形成減少。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，表達(dá)植物DNA載體pSIM1278的兩個(gè)沉默盒和植物DNA載體pSIM1678的沉默盒的馬鈴薯植物種類(lèi)是褐色布爾班克(RussetBurbank)W8種類(lèi)。在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明的馬鈴薯植物種類(lèi)W8表達(dá)植物DNA載體pSIM1678的晚疫病抗性基因(Rpi-vnt1)。在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明的馬鈴薯植物種類(lèi)W8具有增加的對(duì)晚疫病感染的抗性。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬和物種的一種新型馬鈴薯栽培品種，稱(chēng)為W8。因此，本發(fā)明涉及馬鈴薯栽培品種W8、馬鈴薯栽培品種W8的塊莖、馬鈴薯栽培品種W8的植物、馬鈴薯栽培品種W8的種子、由馬鈴薯栽培品種W8產(chǎn)生的食物產(chǎn)品以及用于產(chǎn)生通過(guò)使馬鈴薯栽培品種W8自花授粉或通過(guò)使馬鈴薯栽培品種W8與另一種馬鈴薯栽培品種雜交而產(chǎn)生的馬鈴薯植物的方法，和通過(guò)馬鈴薯栽培品種W8的突變誘發(fā)或轉(zhuǎn)型作用進(jìn)行的變異體產(chǎn)生。因此，任何使用栽培品種W8的這類(lèi)方法皆是本發(fā)明的實(shí)施例：自花授粉、回交、雜交產(chǎn)生、群交等。所有使用馬鈴薯栽培品種W8作為至少一種親本產(chǎn)生的植物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。有利的是，馬鈴薯栽培品種可用于與其它不同的馬鈴薯植物雜交以產(chǎn)生具有優(yōu)良特征的第一代(F1)馬鈴薯雜交塊莖、種子和植物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供馬鈴薯栽培品種W8的單或多基因轉(zhuǎn)化植物。在一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移的基因可以是顯性或隱性等位基因。在一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移的基因?qū)①x予如除草劑抗性、昆蟲(chóng)抗性、對(duì)細(xì)菌、真菌或病毒疾病的抗性、雄性繁殖力、雄性無(wú)菌性、營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量增強(qiáng)、均勻性以及淀粉和其它碳水化合物的濃度增加、損傷趨勢(shì)降低和淀粉轉(zhuǎn)化成糖的速率降低等特性?；蚩梢允翘烊淮嬖诘鸟R鈴薯基因或通過(guò)遺傳工程改造技術(shù)、回交或突變引入的轉(zhuǎn)基因。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于馬鈴薯栽培品種W8的組織培養(yǎng)物的可再生細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，組織培養(yǎng)物將能夠使具有前述馬鈴薯植物的所有生理學(xué)和形態(tài)特征的植物再生，以及使具有與前述馬鈴薯植物實(shí)質(zhì)上相同的基因型的植物再生。在一些實(shí)施例中，這類(lèi)組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞將是胚芽、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈合組織、花粉、葉子、花藥、雌蕊、子葉、下胚軸、根、根端、花、種子、葉柄、塊莖、芽眼或莖干。再者，本發(fā)明提供由本發(fā)明的組織培養(yǎng)物再生的馬鈴薯植物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供由馬鈴薯植物種類(lèi)褐色布爾班克W8的根瘤制成的食物產(chǎn)品。食物產(chǎn)品優(yōu)選是熱處理產(chǎn)品。甚至更優(yōu)選的是，食物產(chǎn)品是薯?xiàng)l、薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯片或馬鈴薯粒。除上述例示性方面和實(shí)施例以外，其它方面和實(shí)施例將通過(guò)研究以下說(shuō)明變得顯而易見(jiàn)。附圖說(shuō)明圖1描繪pSIM1278轉(zhuǎn)型載體。左側(cè)的載體主鏈區(qū)域的長(zhǎng)度是9,512bp，其在位置10,149bp處開(kāi)始并且在位置19,660bp處結(jié)束。主鏈DNA主要由細(xì)菌DNA組成，其提供植物轉(zhuǎn)型作用之前DNA插入物的支持性維持。包括側(cè)接邊界序列的DNA插入物區(qū)域(右側(cè))的長(zhǎng)度是10,148bp(從1bp到10,148bp)。DNA插入物僅由原生DNA組成并且在轉(zhuǎn)型作用時(shí)穩(wěn)定整合到馬鈴薯基因體中。圖2提供pSIM1278轉(zhuǎn)型載體中插入的DNA插入物中沉默盒的示意圖。每個(gè)沉默盒含有由間隔物間隔的兩個(gè)基因片段的兩個(gè)復(fù)本。在塊莖中具有主要活性的兩個(gè)匯集啟動(dòng)子(指示為Pro)之間以反向重復(fù)形式插入DNA區(qū)段的兩個(gè)復(fù)本，其包含四個(gè)靶向基因(即Asn-1、Ppo-5、Phl和R1)的片段。含有所得沉默盒的植物在塊莖中產(chǎn)生RNA分子的多樣和未聚腺苷酸化陣列，其動(dòng)態(tài)并且強(qiáng)烈地使期望的目標(biāo)基因沉默。RNA分子的尺寸通常小于所使用的兩個(gè)啟動(dòng)子之間的距離，因?yàn)閰R集轉(zhuǎn)錄引起碰撞轉(zhuǎn)錄。圖3描繪本發(fā)明的pSIM1678轉(zhuǎn)型載體。左側(cè)的載體主鏈區(qū)域的長(zhǎng)度是9,512bp，其在位置9,091bp處開(kāi)始并且在位置18,602bp處結(jié)束。主鏈DNA主要由細(xì)菌DNA組成，其提供植物轉(zhuǎn)型作用之前DNA插入物的支持性維持。包括側(cè)接邊界序列的DNA插入?yún)^(qū)(右側(cè))的長(zhǎng)度是9,090bp(從1bp到9,090bp)。DNA插入物僅由原生DNA組成并且在轉(zhuǎn)型作用時(shí)穩(wěn)定整合到馬鈴薯基因體中。圖4提供在pSIM1278轉(zhuǎn)型載體(上部構(gòu)筑體)中插入的DNA插入物中的沉默盒和在pSIM1678轉(zhuǎn)型載體(下部構(gòu)筑體)中插入的DNA插入物中的沉默盒的示意圖。圖5展示關(guān)于兩個(gè)事件(W3和W8)和褐色布爾班克對(duì)照物(WT)的從區(qū)域生長(zhǎng)植物的塊莖分離的總RNA(20μg)的北方印跡分析(Northernblotanalysis)的結(jié)果。印跡與對(duì)Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv轉(zhuǎn)錄物(上部圖)具有特異性的探針雜交。對(duì)內(nèi)部對(duì)照物18srRNA(中間圖)和溴化乙錠染色的總RNA(下部圖)具有特異性的探針用作內(nèi)部和負(fù)載對(duì)照物。每個(gè)印記包括每種樣品的兩個(gè)獨(dú)立生物復(fù)本。W3＝未提交的其它事件。圖6展示關(guān)于兩個(gè)事件(W3和W8)和褐色布爾班克對(duì)照物(WT)的從區(qū)域生長(zhǎng)植物的葉子分離的總RNA(20μg)的北方印跡分析的結(jié)果。印跡與對(duì)Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv轉(zhuǎn)錄物(上部圖)具有特異性的探針雜交。對(duì)內(nèi)部對(duì)照物18srRNA(中間圖)和溴化乙錠染色的總RNA(下部圖)具有特異性的探針用作內(nèi)部和負(fù)載對(duì)照物。每個(gè)印記包括每種樣品的兩個(gè)獨(dú)立生物復(fù)本。W3＝未提交的其它事件。圖7展示關(guān)于兩個(gè)事件(W3和W8)和褐色布爾班克對(duì)照物(WT)的從區(qū)域生長(zhǎng)植物的莖干分離的總RNA(20μg)的北方印跡分析的結(jié)果。印跡與對(duì)Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv轉(zhuǎn)錄物(上部圖)具有特異性的探針雜交。對(duì)內(nèi)部對(duì)照物18srRNA(中間圖)和溴化乙錠染色的總RNA(下部圖)具有特異性的探針用作內(nèi)部和負(fù)載對(duì)照物。每個(gè)印記包括每種樣品的兩個(gè)獨(dú)立生物復(fù)本。W3＝未提交的其它事件。圖8展示關(guān)于兩個(gè)事件(W3和W8)和褐色布爾班克對(duì)照物(WT)的從區(qū)域生長(zhǎng)植物的根分離的總RNA(20μg)的北方印跡分析的結(jié)果。印跡與對(duì)Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv轉(zhuǎn)錄物(上部圖)具有特異性的探針雜交。對(duì)內(nèi)部對(duì)照物18srRNA(中間圖)和溴化乙錠染色的總RNA(下部圖)具有特異性的探針用作內(nèi)部和負(fù)載對(duì)照物。每個(gè)印記包括每種樣品的兩個(gè)獨(dú)立生物復(fù)本。W3＝未提交的其它事件。圖9展示關(guān)于兩個(gè)事件(W3和W8)和褐色布爾班克對(duì)照物(WT)的從區(qū)域生長(zhǎng)植物的花朵分離的總RNA(20μg)的北方印跡分析的結(jié)果。印跡與對(duì)Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv轉(zhuǎn)錄物(上部圖)具有特異性的探針雜交。對(duì)內(nèi)部對(duì)照物18srRNA(中間圖)和溴化乙錠染色的總RNA(下部圖)具有特異性的探針用作內(nèi)部和負(fù)載對(duì)照物。每個(gè)印記包括每種樣品的兩個(gè)獨(dú)立生物復(fù)本。W3＝未提交的其它事件。圖10展示多酚氧化酶活性的三種不同兒茶酚分析的結(jié)果。對(duì)于每種分析，褐色布爾班克對(duì)照物在頂部并且種類(lèi)W8在底部。深褐色表明不存在黑斑損傷減少特性。如圖10中所見(jiàn)，W8具有黑斑損傷減少特性，而對(duì)照物不具有。具體實(shí)施方式在以下說(shuō)明和表格中，使用許多術(shù)語(yǔ)。為了提供對(duì)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)(包括欲給出這類(lèi)術(shù)語(yǔ)的范圍)清楚且更一致的理解，提供以下定義。等位基因。等位基因是與一種特性或特征有關(guān)的基因的一或多種替代形式中的任一種。在二倍體細(xì)胞或生物體中，既定基因的兩個(gè)等位基因占據(jù)一對(duì)同源染色體上的相應(yīng)基因座。氨基酸序列。如本文中所使用，包括寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)和其片段，所述氨基酸序列是從植物分離、對(duì)植物來(lái)說(shuō)是原生或天然存在于植物中，或按合成方式制得，但包含內(nèi)源性對(duì)應(yīng)物的核酸序列。人工操縱。如本文中所使用，“人工操縱”意謂通過(guò)手或通過(guò)機(jī)械手段或重組手段(如通過(guò)遺傳工程改造技術(shù))移動(dòng)、配置、操作或控制植物或植物細(xì)胞，以便產(chǎn)生與未經(jīng)操縱的天然存在的對(duì)應(yīng)物相比具有不同生物、生物化學(xué)、形態(tài)或生理學(xué)表現(xiàn)型及/或基因型的植物或植物細(xì)胞。無(wú)性繁殖。通過(guò)從葉子插條、莖干插條、根插條、塊莖眼、匍匐莖、單個(gè)植物細(xì)胞原生質(zhì)體、愈合組織等產(chǎn)生整個(gè)植物來(lái)產(chǎn)生后代，其不涉及配子的融合。主鏈。雙運(yùn)載體的核酸序列，其不包括意圖轉(zhuǎn)移的DNA插入序列?；亟?。回交是其中飼養(yǎng)員反復(fù)地使雜交后代重新與一個(gè)親本雜交的過(guò)程，例如第一代雜交物F1與F1雜交物的一個(gè)親本基因型。環(huán)腐病(BacterialRingRot)。環(huán)腐病是由細(xì)菌番茄細(xì)菌性潰瘍病菌屬(Clavibactermichiganensessp)引起的疾病。環(huán)腐病的名稱(chēng)來(lái)源于塊莖內(nèi)脈管環(huán)的特征分解。這種環(huán)通常呈現(xiàn)奶黃色到淺褐色，干酪質(zhì)腐爛。在馬鈴薯的外表面上，嚴(yán)重患病塊莖可展示稍微凹陷、脫水和開(kāi)裂區(qū)域。受感染的塊莖的脈管組織中的環(huán)腐病癥狀與上述相比可能不太明顯，僅呈現(xiàn)破損，偶爾呈現(xiàn)黑線或連續(xù)、淡黃色變色。黑斑損傷。在受損塊莖組織中發(fā)現(xiàn)的黑斑是在細(xì)胞損傷后產(chǎn)生的稱(chēng)為黑色素的色素的結(jié)果并且使組織具有褐色、灰色或黑色外觀。黑色素在酚受質(zhì)和適合的酶由于細(xì)胞損傷而彼此接觸時(shí)形成。所述損傷無(wú)需破壞細(xì)胞。然而，受質(zhì)和酶的混合必須發(fā)生，通常在組織受到?jīng)_擊時(shí)。黑斑主要存在于剛好位于脈管環(huán)下方的環(huán)髓組織中，但可足夠大以包括一部分皮層組織。邊界類(lèi)序列?！斑吔珙?lèi)”序列是從所選擇的經(jīng)修飾的植物物種分離，或從與待修飾的植物物種性相容的植物分離，并且發(fā)揮與農(nóng)桿菌的邊界序列類(lèi)似的功能。也就是說(shuō)，本發(fā)明的邊界類(lèi)序列促進(jìn)和有助于其所連接的聚核苷酸的整合。本發(fā)明的DNA插入物優(yōu)選含有邊界類(lèi)序列。DNA插入物的邊界類(lèi)序列的長(zhǎng)度在5-100bp、10-80bp、15-75bp、15-60bp、15-50bp、15-40bp、15-30bp、16-30bp、20-30bp、21-30bp、22-30bp、23-30bp、24-30bp、25-30bp或26-30bp之間。DNA插入物左和右邊界序列是從待修飾的植物的基因體分離和/或?qū)Υ揎椀闹参锏幕蝮w來(lái)說(shuō)是原生。在核苷酸序列中，DNA插入物邊界類(lèi)序列不與任何已知的農(nóng)桿菌衍生T-DNA邊界序列相同。因此，DNA插入物邊界類(lèi)序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)或更多個(gè)與來(lái)自農(nóng)桿菌物種(如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes))的T-DNA邊界序列不同的核苷酸。也就是說(shuō)，本發(fā)明的DNA插入物邊界或邊界類(lèi)序列與來(lái)自農(nóng)桿菌物種(如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌)的T-DNA邊界序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％序列一致性，但不具有100％序列一致性。如本文中所使用，描述性用語(yǔ)“DNA插入物邊界”和“DNA插入物邊界類(lèi)”是可交換的。邊界類(lèi)序列可從植物基因體分離并且經(jīng)修飾或突變以改變功效，其功效能夠?qū)⒑塑账嵝蛄姓系搅硪缓塑账嵝蛄兄小？蓪⑵渌酆塑账嵝蛄刑砑拥交虿⑷氡景l(fā)明的邊界類(lèi)序列內(nèi)。因此，DNA插入物左邊界或DNA插入物右邊界可經(jīng)修飾以具有5'-和3'-多克隆位點(diǎn)，或其它限制位點(diǎn)。DNA插入物邊界序列可經(jīng)修飾以增加來(lái)自伴隨載體的主鏈DNA不整合到植物基因體中的可能性。基本上由……組成?！盎旧嫌赡承┰亟M成”的組合物限于包含這些元素，以及不實(shí)質(zhì)上影響本發(fā)明組合物的基本和新穎特征的元素。因此，只要組合物不影響本發(fā)明的基本和新穎特征，也就是說(shuō)，不含不是來(lái)自所選擇的植物物種或與所選擇的植物物種性相容的植物的外來(lái)DNA，那么所述組合物可視為由措辭“基本上由……組成”表征的本發(fā)明組合物的組分。子葉。子葉是一種種子葉子。子葉含有種子的食物儲(chǔ)存組織。簡(jiǎn)并引物?！昂?jiǎn)并引物”是含有足夠的核苷酸變化的寡核苷酸，其在與具有類(lèi)似但非嚴(yán)格同源性的序列雜交時(shí)可容納堿基錯(cuò)配。雙子葉植物(Dicotyledon/dicot)。一種開(kāi)花植物，其胚芽具有兩個(gè)種子葉子或子葉。雙子葉植物的實(shí)例包括(但不限于)煙草、番茄、馬鈴薯、甘薯、木薯、豆科植物(包括苜蓿和大豆)、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹(shù)、楓樹(shù)、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、菊花和仙人掌。DNA插入物。根據(jù)本發(fā)明，待插入到植物的基因體中的DNA插入物包含對(duì)于所述植物來(lái)說(shuō)是原生的聚核苷酸序列或具有所述植物的原生基因元素。在一個(gè)實(shí)例中，舉例來(lái)說(shuō)，來(lái)自本發(fā)明的馬鈴薯種類(lèi)W8的pSIM1278的DNA插入物是10,148bp非編碼聚核苷酸，其對(duì)于馬鈴薯或野生型馬鈴薯(一種馬鈴薯性相容植物)來(lái)說(shuō)是原生，在轉(zhuǎn)型作用時(shí)穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞的基因體中并且使涉及黑斑損傷的表達(dá)、天冬酰胺聚集和衰老甜化的基因沉默。DNA插入物優(yōu)選包含兩個(gè)表達(dá)盒并且插入到稱(chēng)為pSIM1278轉(zhuǎn)型載體的轉(zhuǎn)型載體中。第一個(gè)盒子包含天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)的片段，在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp啟動(dòng)子與顆粒結(jié)合合成酶基因(Gbss)的Gbss啟動(dòng)子之間以反向重復(fù)形式配置。這些啟動(dòng)子在塊莖中具有主要活性。第二個(gè)盒子的功能是使淀粉相關(guān)基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子沉默。這個(gè)盒子包含淀粉相關(guān)基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子的片段，其可操作地連接到與第一個(gè)盒子相同的Agp和Gbss啟動(dòng)子。第二DNA插入物來(lái)自稱(chēng)為pSIM1678的轉(zhuǎn)型載體，其包含用于植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因VInv的Rpi-vnt1表達(dá)盒和沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白質(zhì)編碼區(qū)組成，所述編碼區(qū)由其原生啟動(dòng)子和終止序列調(diào)節(jié)以賦予對(duì)晚疫病的廣泛抗性，而沉默盒由來(lái)自由相對(duì)植物啟動(dòng)子pGbss和pAgp側(cè)接的馬鈴薯VInv基因的序列的反向重復(fù)組成。這些表達(dá)盒不含外來(lái)DNA，并且僅由來(lái)自所選擇的植物物種或與所選擇的植物物種性相容的植物的DNA組成。胚芽。胚芽是成熟種子內(nèi)所含的不成熟植物。外來(lái)。關(guān)于核酸的“外來(lái)”意指所述核酸來(lái)源于非植物生物，或來(lái)源于物種與待轉(zhuǎn)型的植物不同的植物，或不來(lái)源于不可與待轉(zhuǎn)型的植物雜交的植物，不屬于目標(biāo)植物的物種。根據(jù)本發(fā)明，外來(lái)DNA或RNA表示真菌、細(xì)菌、病毒、哺乳動(dòng)物、魚(yú)或鳥(niǎo)類(lèi)的遺傳組成中天然存在，但不在待轉(zhuǎn)型的植物中天然存在的核酸。因此，外來(lái)核酸是編碼例如并非由經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物天然產(chǎn)生的多肽的核酸。外來(lái)核酸并非必須編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，所需基因內(nèi)植物是不含任何整合到其基因體中的外來(lái)核酸的植物?；?。如本文中所使用，“基因”指編碼區(qū)并且不包括對(duì)所述區(qū)域是5'-或3'-的核苷酸序列。功能性基因是可操作地連接到啟動(dòng)子或終止子的編碼區(qū)?？墒褂棉D(zhuǎn)型作用或多種育種方法將基因引入物質(zhì)的基因體(無(wú)論來(lái)自不同物種或來(lái)自相同物種)?；蜣D(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化)?；蜣D(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化)植物指通過(guò)稱(chēng)為回交的植物育種技術(shù)研發(fā)植物，其中除通過(guò)回交技術(shù)、遺傳工程改造或突變轉(zhuǎn)移到種類(lèi)中的一或多個(gè)基因以外，恢復(fù)種類(lèi)的實(shí)質(zhì)上所有所需形態(tài)和生理學(xué)特征。也可以轉(zhuǎn)移一或多個(gè)基因座。基因重排。指可活體內(nèi)以及活體外自發(fā)進(jìn)行的基因元素的重新關(guān)聯(lián)，其引入基因材料的新組織。舉例來(lái)說(shuō)，不同染色體基因座處的聚核苷酸剪接在一起可在植物發(fā)育和有性再結(jié)合期間活體內(nèi)自發(fā)進(jìn)行。因此，通過(guò)非天然基因修飾技術(shù)進(jìn)行的活體外基因元素的再結(jié)合與也可以通過(guò)活體內(nèi)有性再結(jié)合進(jìn)行的再結(jié)合事件類(lèi)似。金線蟲(chóng)。馬鈴薯球胞囊線蟲(chóng)(Globoderarostochiensis)，通常稱(chēng)為金線蟲(chóng)，是影響馬鈴薯植物的根和塊莖的植物寄生線蟲(chóng)。癥狀包括不良植物生長(zhǎng)、枯萎、水分脅迫和營(yíng)養(yǎng)缺乏。下胚軸。下胚軸是子葉與根之間的胚芽或幼苗的部分。因此，其可視為芽與根之間的過(guò)渡區(qū)?？騼?nèi)。核苷酸三聯(lián)體(密碼子)翻譯成植物細(xì)胞中所需重組蛋白的初生氨基酸序列。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涵蓋在閱讀框架中連接到第二核酸的第一核酸，其中第一核苷酸序列是基因并且第二核苷酸是啟動(dòng)子或類(lèi)似調(diào)節(jié)元件。整合。指來(lái)自所選擇的植物物種，或來(lái)自與所選擇的植物相同的物種的植物，或來(lái)自與所選擇的植物物種性相容的植物的核酸序列插入刀所選擇的植物物種的細(xì)胞的基因體中?！罢稀敝竷H原生基因元素并入植物細(xì)胞基因體。為了整合原生基因元件，如通過(guò)同源重組，本發(fā)明可“使用”非天然DNA作為這類(lèi)過(guò)程中的步驟。因此，本發(fā)明區(qū)分“使用”特定DNA分子與將特定DNA分子“整合”到植物細(xì)胞基因體。引入。如本文中所使用，指通過(guò)包括感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)型或轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法將核酸序列插入細(xì)胞中。經(jīng)分離?！敖?jīng)分離”指任何以物理方式從其正常、原生環(huán)境分離的核酸或化合物。經(jīng)分離的材料可保持在含有例如溶劑、緩沖液、離子或其它組分的適合的溶液中，并且可呈純化或未純化形式。晚疫病。由卵菌綱致病疫霉引起的馬鈴薯疾病并且也稱(chēng)為‘馬鈴薯晚疫病’，其可感染和毀壞馬鈴薯植物的葉子、莖干、果實(shí)和塊莖。前導(dǎo)子。在基因之前(或5'-)的經(jīng)轉(zhuǎn)錄但未經(jīng)翻譯的序列?；蜃；蜃峁┮换蚨喾N特性，如雄性無(wú)菌性、除草劑耐受性、昆蟲(chóng)抗性、疾病抗性、糯性淀粉、改良的脂肪酸代謝、改良的植酸代謝、改良的碳水化合物代謝和改良的蛋白質(zhì)代謝。特性可例如由通過(guò)回交、天然或誘導(dǎo)的突變引入到種類(lèi)的基因體中的天然存在的基因或通過(guò)基因轉(zhuǎn)型技術(shù)引入的轉(zhuǎn)基因提供?；蜃砂换蚨鄠€(gè)在單個(gè)染色體位置整合的等位基因。商品產(chǎn)量。商品產(chǎn)量是所收集的直徑在2與4英寸之間的所有塊莖的重量。按cwt(二十分之一噸)測(cè)量商品產(chǎn)量，其中cwt＝100磅。單子葉植物(Monocotyledon/monocot)。一種開(kāi)花植物，其胚芽具有一個(gè)子葉或種子葉子。單子葉植物的實(shí)例包括(但不限于)草坪草、玉米、大米、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾、百合、洋蔥和棕櫚。原生?！霸被蛟柑烊淮嬖谟凇?lái)源于或?qū)儆诖D(zhuǎn)型的植物的基因體的核酸。因此，從待轉(zhuǎn)型的植物或植物物種的基因組分離或從與待轉(zhuǎn)型的植物物種性相容或可雜交的植物或物種分離的核酸、基因、聚核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子是所述植物物種“原生”的，即原產(chǎn)的。換句話說(shuō)，原生遺傳成分表示植物培育者可獲得的用于通過(guò)傳統(tǒng)植物育種改良植物的全部遺傳材料。根據(jù)本發(fā)明，原生核酸的任何變異體也視為“原生”。在這方面中，“原生”核酸還可以從植物或其性相容物種分離并且經(jīng)修飾或突變，使得所得變異體在核苷酸序列方面與從植物分離的未經(jīng)修飾的原生核酸具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％相似性。原生核酸變異體的核苷酸序列還可以具有小于約60％、小于約55％或小于約50％相似性。從植物分離的“原生”核酸還可以編碼從核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯的天然存在的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的變異體。因此，原生核酸可編碼在氨基酸序列方面與分離核酸的植物中表達(dá)的未經(jīng)修飾的原生蛋白質(zhì)具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％相似性的蛋白質(zhì)。原生基因元件?！霸蛟笨刹⑷牒驼系礁鶕?jù)本發(fā)明的所選擇的植物物種基因體中。從屬于所選擇的植物物種的植物或從與所選擇的植物物種性相容的植物分離原生基因元件。舉例來(lái)說(shuō)，并入所培育的馬鈴薯(potato/Solanumtuberosum)中的原生DNA可來(lái)源于馬鈴薯的任何基因型或與馬鈴薯性相容的野生型馬鈴薯物種(例如馬鈴薯野生種(Solanumdemissum))的基因型。天然存在的核酸。在所選擇的植物物種的基因體內(nèi)發(fā)現(xiàn)天然存在的核酸并且可以是DNA分子或RNA分子。植物物種的基因體中通常存在的限制位點(diǎn)的序列可工程改造成外源性DNA分子，如載體或寡核苷酸，即使限制位點(diǎn)未以物理方式從基因體分離。因此，本發(fā)明允許合成產(chǎn)生核苷酸序列，如限制酶識(shí)別序列，只要所述序列天然存在于所選擇的植物物種的基因體或與待轉(zhuǎn)型的所選擇的植物物種性相容的植物中即可?？刹僮鞯剡B接。以使得在組合中在植物細(xì)胞中發(fā)揮適當(dāng)功能的方式組合兩個(gè)或更多個(gè)分子。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)啟動(dòng)子控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子可操作地連接于結(jié)構(gòu)基因。植物。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“植物”包括(但不限于)被子植物和裸子植物，如馬鈴薯、番茄、煙草、苜蓿、萵苣、胡蘿卜、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉米、草皮草、小麥、大米、大麥、高粱、燕麥、橡樹(shù)、桉樹(shù)、胡桃和棕櫚。因此，植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。如本文中所使用，詞語(yǔ)“植物”還涵蓋植物細(xì)胞、種子、植物后代、繁殖體(無(wú)論以有性或無(wú)性方式產(chǎn)生)，和這些物質(zhì)中的任一個(gè)的后代，如插條或種子。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、愈合組織、胚芽、分生組織區(qū)、愈合組織、葉、根、嫩枝、配子體、孢子體、花粉、種子和花粉粒。植物可處于成熟期的多個(gè)階段，并且可以在液體或固體培養(yǎng)物中，或在罐、溫室或曠野中的土壤或適合培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。植物中所引入的前導(dǎo)子、尾部序列或基因序列的表達(dá)可以是暫時(shí)性或永久性的?！八x擇的植物物種”可以是(但不限于)這些“植物”中的任一個(gè)的物種。植物部分。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“植物部分”(或馬鈴薯植物，或其一部分)包括(但不限于)原生質(zhì)體、樹(shù)葉、、莖干、根、根端、花藥、雌蕊、種子、胚芽、花粉、胚珠、子葉、下胚軸、花、塊莖、芽眼、組織、葉柄、細(xì)胞、分生組織細(xì)胞等。植物物種。屬于多種官方命名植物物種的植物群，其至少顯示一些性相容。植物轉(zhuǎn)型和細(xì)胞培養(yǎng)物。大體上指用于對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾并且轉(zhuǎn)移到適合的植物培養(yǎng)基中以用于維持、進(jìn)一步生長(zhǎng)和/或進(jìn)一步發(fā)育的過(guò)程。精確育種。指通過(guò)將核酸(如原生基因和調(diào)節(jié)元件，其是從所選擇的植物物種分離，或來(lái)自與所選擇的植物相同的物種中的另一種植物，或來(lái)自與所選擇的植物物種性相容的物種)穩(wěn)定引入個(gè)別植物細(xì)胞中，并且隨后使這些經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞再生成完全植物來(lái)改良植物。因?yàn)椴淮嬖谖粗幕蛲鈦?lái)核酸永久性并入植物基因體中，本發(fā)明的技術(shù)利用也可以通過(guò)常規(guī)植物育種獲得的相同基因材料。后代。如本文中所使用，包括由兩種馬鈴薯植物的雜交產(chǎn)生的F1馬鈴薯植物，其中至少一種植物包括馬鈴薯栽培品種W8并且后代更包括(但不限于)與輪回親本的后續(xù)F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9和W8代雜交物。定量特性基因座(QTL)。定量特性基因座(QTL)指在一定程度上控制可以數(shù)值方式表示的通常連續(xù)分布的特性的基因基因座。重組型。如本文中所使用，廣泛描述可用于基因克隆、DNA測(cè)序和產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多種技術(shù)。如本文中所使用，所述術(shù)語(yǔ)還描述在基因轉(zhuǎn)移到植物宿主系統(tǒng)的細(xì)胞中之后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。再生。再生指植物從組織培養(yǎng)物發(fā)育。調(diào)節(jié)序列。指標(biāo)準(zhǔn)并且為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的序列，其可包括于表達(dá)載體中以增加和/或最大化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或植物系統(tǒng)中所得RNA的轉(zhuǎn)譯。這些序列包括(但不限于)啟動(dòng)子、肽輸出信號(hào)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。修飾核酸構(gòu)筑體以增加植物中的表達(dá)含量的方法也是所屬領(lǐng)域中一般已知的(參見(jiàn)例如羅格(Rogers)等人,260生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)3731-38,1985；科爾內(nèi)霍(Cornejo)等人,23植物分子生物學(xué)(PlantMol.Biol.)567:81,1993)。在工程改造植物系統(tǒng)以影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄率時(shí)，多種所屬領(lǐng)域中已知的因素可具有影響，包括調(diào)節(jié)序列(如正性或負(fù)性作用序列)、強(qiáng)化子和沉默子以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明假設(shè)這些因素中的至少一個(gè)可用于工程改造植物以表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)。本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列是原生基因元件，即從待修飾的所選擇的植物物種分離?？蛇x標(biāo)記。“可選標(biāo)記”通常是編碼可提供對(duì)抗生素、除草劑或毒性化合物的某種抗性的蛋白質(zhì)的基因，并且用于鑒別轉(zhuǎn)型事件?？蛇x標(biāo)記的實(shí)例包括編碼鏈霉素(streptomycin)抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(spt)基因、將甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成果糖-6磷酸的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(pmi)基因；編碼卡那霉素(kanamycin)和遺傳霉素(geneticin)抗性的新霉素(neomycin)磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)基因、編碼對(duì)潮霉素(hygromycin)的抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt或aphiv)基因、編碼對(duì)磺酰脲型除草劑的抗性的乙酰乳酸合成酶(als)基因、編碼對(duì)發(fā)揮作用以抑制谷氨酰胺合成酶的作用的除草劑(例如草丁膦(phosphinothricin)或巴斯特(basta))的抗性的基因(例如bar基因)，或所屬領(lǐng)域中已知的其它類(lèi)似基因。有義抑制。通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物中所有或一部分內(nèi)源性基因的一或多個(gè)其它復(fù)本的表達(dá)使所述內(nèi)源性基因的表達(dá)降低。比重。如本文中所使用，“比重”是密度的表示并且是馬鈴薯質(zhì)量的測(cè)量值。塊莖的比重與干物質(zhì)或總固體的淀粉含量和百分比之間存在高相關(guān)性。更高的比重有助于所處理的產(chǎn)物的更高的回收率和更好的質(zhì)量。T-DNA類(lèi)?！癟-DNA類(lèi)”序列是從所選擇的植物物種分離或來(lái)自與所選擇的植物物種性相容的植物的核酸，并且其與農(nóng)桿菌物種T-DNA共有至少75％、80％、85％、90％或95％但非100％序列一致性。T-DNA類(lèi)序列可含有一或多個(gè)邊界或邊界類(lèi)序列，其各自能夠?qū)⒑塑账嵝蛄姓系搅硪粋€(gè)聚核苷酸中?？偖a(chǎn)量。總產(chǎn)量指所有收集的塊莖的總重量。尾部序列。在基因之后(或3'-)經(jīng)轉(zhuǎn)錄但未經(jīng)翻譯的序列。經(jīng)轉(zhuǎn)錄的DNA。包含基因和與所述基因相關(guān)聯(lián)的非翻譯前導(dǎo)子和尾部序列的DNA，其通過(guò)前述啟動(dòng)子的作用轉(zhuǎn)錄成單個(gè)mRNA。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。用于將DNA穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞的基因體中的過(guò)程?！胺€(wěn)定”指細(xì)胞基因體中和由細(xì)胞基因體進(jìn)行的聚核苷酸的永久性或非暫時(shí)性保留和/或表達(dá)。因此，穩(wěn)定整合的聚核苷酸是經(jīng)轉(zhuǎn)型的細(xì)胞基因體內(nèi)的固定物并且可通過(guò)細(xì)胞或所得經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物的連續(xù)后代來(lái)復(fù)制和繁殖。轉(zhuǎn)型可以在天然或人工條件下使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的多種方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)型可憑借任何用于將核酸序列插入原核或真核宿主細(xì)胞中的已知方法，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)型方案、病毒感染、觸須、電穿孔、熱休克、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、聚乙二醇處理、微注射和粒子轟擊。轉(zhuǎn)基因。將插入到宿主基因體中的基因，其包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)。在本發(fā)明的情形下，從宿主基因體分離包含轉(zhuǎn)基因的元件。轉(zhuǎn)基因植物。經(jīng)遺傳修飾的植物，其含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因。變異體。如本文中所使用，“變異體”應(yīng)理解成意指偏離具體基因或蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)或既定核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“同種型”、“同型”和“類(lèi)似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“變異體”形式。通過(guò)添加、移除或取代一或多個(gè)氨基酸或改變核苷酸序列而改變的氨基酸序列可以視為“變異體”序列。變異體可具有“保守性”變化，其中經(jīng)取代的氨基酸具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，例如用異白氨酸置換白氨酸。變異體可具有“非保守性”變化，例如用色氨酸置換甘氨酸。類(lèi)似微小變化還可以包括氨基酸缺失或插入或其兩者。測(cè)定哪個(gè)氨基酸殘基可經(jīng)取代、插入或缺失的指導(dǎo)可使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的計(jì)算機(jī)程序(例如載體NTI程序組(VectorNTISuite)(馬里蘭州因弗馬斯公司(InforMax,MD))軟件)發(fā)現(xiàn)。藤本植物成熟。藤本植物成熟指植物持續(xù)使用碳水化合物和光合作用的能力。藤本植物成熟按照1到5的等級(jí)打分，其中1＝死亡的藤本植物并且5＝綠色、仍開(kāi)花的藤本植物。將理想特性插入馬鈴薯植物的基因體中存在具體困難，因?yàn)轳R鈴薯是四倍體植物、高異型接合并且對(duì)近交衰退敏感。因此，在使用常規(guī)育種進(jìn)行處理期間，極難以有效產(chǎn)生可產(chǎn)生較少丙烯酰胺和較少有害梅納反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)殖基因馬鈴薯植物，所述梅納反應(yīng)產(chǎn)物包括N-亞硝基-N-(3-酮-1,2-丁二醇)-3'-硝基酪胺酸(王(Wang)等人,毒理學(xué)文獻(xiàn)(ArchToxicol)70:10-5,1995)、5-羥基甲基-2-糠醛(揚(yáng)佐夫斯基(Janzowski)等人,食品與化學(xué)品毒理學(xué)(FoodChemToxicol)38:801-9,2000)和其它具有突變誘發(fā)特性的梅納反應(yīng)產(chǎn)物(柴本(Shibamoto),臨床與生物學(xué)研究進(jìn)展(ProgClinBiolRes)304:359-76,1989)。已測(cè)試若干種方法并且正在進(jìn)行研究以通過(guò)過(guò)程變化、右旋糖較少以及添加劑(如天冬酰胺酶、檸檬酸)和競(jìng)爭(zhēng)氨基酸來(lái)減少丙烯酰胺。整個(gè)馬鈴薯工業(yè)中用于實(shí)施過(guò)程變化的所需資源費(fèi)用將花費(fèi)數(shù)百萬(wàn)美元。除費(fèi)用以外，這些過(guò)程變化具有顯著缺陷，包括與添加劑(如天冬酰胺酶或檸檬酸)有關(guān)的潛在不良味道。通常，薯?xiàng)l制造商在炸薯?xiàng)l加工期間添加右旋糖以產(chǎn)生所需金褐色，但右旋糖也通過(guò)梅納反應(yīng)而增加丙烯酰胺的形成。在過(guò)程中僅省略右旋糖科顯著減少丙烯酰胺；然而，那么必須以另一種方式產(chǎn)生標(biāo)志性金褐色(如通過(guò)添加顏料，如胭脂樹(shù)橙)。使用替代性顏料，引起不存在通過(guò)這些褐變反應(yīng)產(chǎn)生的典型味道。使用添加劑以減少反應(yīng)物(如天冬酰胺)的另一項(xiàng)挑戰(zhàn)是在冷凍儲(chǔ)存期間發(fā)生的水分遷移，其中引起天冬酰胺返回表面和丙烯酰胺增加。最終，在馬鈴薯受損之后發(fā)生的黑化影響炸薯?xiàng)l和薯片加工中的質(zhì)量和回收率。損壞或損傷的馬鈴薯必須在加工之前修整或丟棄，引起質(zhì)量問(wèn)題或經(jīng)濟(jì)缺失。本發(fā)明的“原生技術(shù)”通過(guò)降低多酚氧化酶-5(PPO-5)(其引起黑斑損傷)的表達(dá)、天冬酰胺合成酶-1(Asn-1)(其引起天冬酰胺聚集，天冬酰胺是丙烯酰胺形成中的前驅(qū)體，其可降低液泡轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)，所述液泡轉(zhuǎn)化酶將蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖)的表達(dá)和/或磷酸化酶-L和激酶-R1(其是與還原糖的聚集相關(guān)的酶，所述還原糖通常與氨基酸(如天冬酰胺)反應(yīng)，并且形成毒性梅納產(chǎn)物，包括丙烯酰胺)的表達(dá)來(lái)解決馬鈴薯工業(yè)中改良馬鈴薯的農(nóng)藝特征和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的需要。塊莖中這些基因的部分或完全沉默可降低產(chǎn)生丙烯酰胺的可能性。使用本發(fā)明的原生技術(shù)允許通過(guò)使僅具有“原生”基因材料(即從馬鈴薯植物或與馬鈴薯植物性相容的植物獲得的基因材料，其僅含有非編碼調(diào)節(jié)區(qū)域)的馬鈴薯轉(zhuǎn)型，而不將任何外來(lái)基因材料整合到植物基因體中來(lái)將所需特性并入有商業(yè)價(jià)值的馬鈴薯植物種類(lèi)的基因體中。所需特性包括對(duì)撞擊引起的黑斑損傷的高耐受性、對(duì)晚疫病感染的抗性增加、丙烯酰胺前驅(qū)體天冬酰胺的形成減少和還原糖的聚集較少，從而使毒性梅納產(chǎn)物(包括丙烯酰胺)的聚集減少，改良的質(zhì)量和食物顏色控制。將這些理想特性并入現(xiàn)有馬鈴薯種類(lèi)中無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)育種實(shí)現(xiàn)，因?yàn)轳R鈴薯是四倍體植物、高異型接合并且對(duì)近交衰退敏感。本發(fā)明中使用的非編碼馬鈴薯植物DNA插入物序列對(duì)于馬鈴薯植物基因體來(lái)說(shuō)是原生并且不含任何農(nóng)桿菌DNA。DNA插入物中一個(gè)的優(yōu)選包含兩個(gè)表達(dá)盒并且插入到稱(chēng)為pSIM1278轉(zhuǎn)型載體的轉(zhuǎn)型載體中。第一個(gè)盒子包含天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)的片段，在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp啟動(dòng)子與顆粒結(jié)合合成酶基因(Gbss)的Gbss啟動(dòng)子之間以反向重復(fù)形式配置。這些啟動(dòng)子在塊莖中具有主要活性。第二個(gè)盒子的功能是使淀粉相關(guān)基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子沉默。這個(gè)盒子包含淀粉相關(guān)基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子的片段，其可操作地連接到與第一個(gè)盒子相同的Agp和Gbss啟動(dòng)子。這些表達(dá)盒不含外來(lái)DNA，并且僅由來(lái)自所選擇的植物物種或與所選擇的植物物種性相容的植物的DNA組成。第二DNA插入物來(lái)自稱(chēng)為pSIM1678的轉(zhuǎn)型載體，其包含用于植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因VInv的Rpi-vnt1表達(dá)盒和沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白質(zhì)編碼區(qū)組成，所述編碼區(qū)由其原生啟動(dòng)子和終止序列調(diào)節(jié)以賦予對(duì)晚疫病的廣泛抗性，而沉默盒由來(lái)自由相對(duì)植物啟動(dòng)子pGbss和pAgp側(cè)接的馬鈴薯VInv基因的序列的反向重復(fù)組成。第一個(gè)盒子的功能是賦予對(duì)晚疫病的抗性，而第二個(gè)盒字的功能是使液泡轉(zhuǎn)化酶基因沉默，減少葡萄糖和果糖。本發(fā)明中使用的有商業(yè)價(jià)值的馬鈴薯植物變種是褐色布爾班克。LutherBurbank在1870年代早期研發(fā)這一種類(lèi)。植物是精力旺盛的并且在整個(gè)季節(jié)持續(xù)藤本植物生長(zhǎng)。莖干較厚，顯著成角度并且有細(xì)斑。小葉的寬度是長(zhǎng)到中等并且顏色是淺綠色到中等綠色?；ǘ漭^少、呈白色并且不能繁殖。栽培品種對(duì)常見(jiàn)瘡痂病具有耐受性，并且易患鐮刀菌萎蔫病(Fusariumwilts)和黃萎病(Verticilliumwilts)、卷葉和網(wǎng)狀壞死、馬鈴薯病毒Y和晚疫病。植物需要高和均勻的土壤水分和受控氮繁殖的以產(chǎn)生不含結(jié)節(jié)、尖端和兩頭集中的塊莖。當(dāng)植物經(jīng)歷壓力時(shí)，塊莖中產(chǎn)生膠狀端和糖端。所產(chǎn)生的塊莖是大型褐色皮膚和白色肉質(zhì)，顯示良好的長(zhǎng)期儲(chǔ)存特征，并且代表極佳烘烤和加工質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。RussettBurbank種類(lèi)具有較高的產(chǎn)生黑斑損傷的敏感性并且還具有高游離天冬酰胺含量和高衰老甜化潛力(美國(guó)馬鈴薯研究雜志(Am.J.PotatoRes)(1966)43:305-314)。所述種類(lèi)是無(wú)菌的并且在西北部和中西部廣泛生長(zhǎng)，尤其用于制備薯?xiàng)l。本發(fā)明提供具有顯著市場(chǎng)價(jià)值的馬鈴薯種類(lèi)，也就是褐色布爾班克，其經(jīng)轉(zhuǎn)型載體pSIM1278轉(zhuǎn)型，接著經(jīng)第二轉(zhuǎn)型載體pSIM1678轉(zhuǎn)型，使用聚合酶鏈反應(yīng)而非標(biāo)記物鑒別，并且成功繁殖。還提供由本發(fā)明的馬鈴薯植物種類(lèi)W8的塊莖制成的食物產(chǎn)品。由經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment/OECD)，馬鈴薯栽培品種W8具有以下獨(dú)特植物種類(lèi)標(biāo)識(shí)符：用原生DNA進(jìn)行的靶向基因沉默降低馬鈴薯植物種類(lèi)W8的塊莖中靶向基因的RNA轉(zhuǎn)錄物含量。馬鈴薯栽培品種W8含有表達(dá)盒，其通過(guò)多種機(jī)制降低塊莖中還原糖的含量。通過(guò)用pSIM1278進(jìn)行的轉(zhuǎn)型作用，引入淀粉相關(guān)基因(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子的沉默盒，同時(shí)用pSIM1678進(jìn)行的轉(zhuǎn)型作用引入轉(zhuǎn)化酶基因的沉默盒(VInv；葉(Ye)等人,2010)?？偠灾@些特性通過(guò)減緩淀粉和蔗糖轉(zhuǎn)化成還原糖(葡萄糖和果糖)來(lái)發(fā)揮功能。因此，本發(fā)明的馬鈴薯植物種類(lèi)W8的塊莖合并有極合乎需要的特性，包括降低的游離酰胺氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺的比率，所述游離酰胺氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺與油炸或烘烤時(shí)丙烯酰胺形成減少有關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的馬鈴薯種類(lèi)W8的特征在于游離天冬酰胺含量降低兩倍到超過(guò)四倍，與黑斑損傷相關(guān)的褪色減少并且對(duì)晚疫病的抗性增加。此外，本發(fā)明的馬鈴薯種類(lèi)W8顯示淀粉在儲(chǔ)存期間降解成還原糖葡萄糖和果糖的延遲。淀粉到糖轉(zhuǎn)化的減少進(jìn)一步減少衰老甜化和丙烯酰胺形成并且限制熱誘導(dǎo)的褐變。因此，本發(fā)明的馬鈴薯種類(lèi)W8在馬鈴薯工業(yè)和食品市場(chǎng)中極有價(jià)值，因?yàn)槠鋲K莖在熱加工時(shí)產(chǎn)生顯著更少的丙烯酰胺并且不攜帶任何潛在有害外來(lái)基因。實(shí)例本發(fā)明使用原生技術(shù)將原生非編碼DNA整合到所選擇的馬鈴薯植物種類(lèi)的基因體中，以便研發(fā)新的基因內(nèi)馬鈴薯植物種類(lèi)。所述方法包括特性鑒別、載體設(shè)計(jì)、載體并入農(nóng)桿菌中、選擇受體馬鈴薯種類(lèi)、植物轉(zhuǎn)型、證明不存在開(kāi)放閱讀框架以及確保新馬鈴薯植物種類(lèi)僅含有原生DNA。本發(fā)明的馬鈴薯栽培品種W8與其未經(jīng)轉(zhuǎn)型的對(duì)應(yīng)物相比具有降低的形成丙烯酰胺的可能性、降低的蔗糖量以及更高的對(duì)黑斑損傷的抗性。此外，本發(fā)明的馬鈴薯栽培品種W8具有增加的對(duì)晚疫病的抗性。實(shí)例1.pSIM1278轉(zhuǎn)型載體本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)型載體pSIM1278來(lái)源于pSIM106，其通過(guò)接合0.4-kb馬鈴薯植物DNA片段(以GenBank寄存編號(hào)AY566555寄存)與pCAMBIA1301(澳大利亞堪培拉的坎比亞公司(CAMBIA,Canberra,Australia))的5.9-kbSacII-SphI片段產(chǎn)生，其攜帶來(lái)自質(zhì)體pVS1和pBR322的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，以及用于對(duì)卡那霉素的細(xì)菌抗性的nptIII基因。將前面是Ubi-3啟動(dòng)子(加巴里諾(Garbarino)和貝爾納普(Belknap),1994)并且后面是Ubi-3終止子的包含農(nóng)桿菌ipt基因的表達(dá)盒以2.6-kbSacII片段形式引入載體主鏈中(羅門(mén)斯(Rommens)等人,2004)。將攜帶兩個(gè)沉默盒的原生10-kbDNA區(qū)段插入pSIM106的DNA插入物中，產(chǎn)生pSIM1278。這一載體用于所有轉(zhuǎn)型。pSIM1278載體圖展示于圖1中。載體主鏈區(qū)域是9,512bp，其在位置10,149處開(kāi)始并且在位置19,660bp處結(jié)束。主鏈DNA主要由細(xì)菌DNA組成并且提供植物轉(zhuǎn)型作用之前DNA插入物的支持性維持。主鏈部分不轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。主鏈的多種元件描述于表1中。pCAMBIA載體的通式結(jié)構(gòu)圖可見(jiàn)于http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html。表1實(shí)例2.pSIM1278植物DNA插入物和其開(kāi)放閱讀框架(ORF)pSIM1278中使用的pSIM1278DNA插入物區(qū)域(包括側(cè)接邊界序列)的長(zhǎng)度是10,148bp，從1bp到10,148bp。pSIM1278DNA插入物僅由原生DNA組成并且穩(wěn)定整合到馬鈴薯基因體中。pSIM1278DNA插入物或其功能性部分是整合到本發(fā)明的馬鈴薯植物種類(lèi)中的載體pSIM1278的唯一基因材料。pSIM1278DNA插入物描述于圖2和以下表2中。LB和RB序列(都是25bp)經(jīng)合成設(shè)計(jì)以與來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊界類(lèi)似并且發(fā)揮類(lèi)似功能。修改GenBank寄存編號(hào)AY566555以闡明用于邊界區(qū)域的DNA的來(lái)源。在查瓦拉(Chawla)等人,2012中，描述為基因元件5和10的ASN1稱(chēng)為StAst1。表2表2中描述的用于產(chǎn)生本發(fā)明的馬鈴薯品系W8的DNA插入物不使相鄰基因活化并且不會(huì)不利地影響馬鈴薯植物種類(lèi)W8的表現(xiàn)型。此外，本發(fā)明的馬鈴薯植物種類(lèi)W8不會(huì)產(chǎn)生與由DNA插入物編碼的開(kāi)放閱讀框架相關(guān)的新型蛋白質(zhì)。實(shí)例3.pSIM1678轉(zhuǎn)型載體本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)型載體pSIM1678是使用與實(shí)例1中關(guān)于pSIM1278所描述相同的方法轉(zhuǎn)型。pSIM1678載體圖展示于圖3中。載體主鏈區(qū)域是9,512bp，其在位置9,091處開(kāi)始并且在位置18,602bp處結(jié)束。主鏈DNA主要由細(xì)菌DNA組成并且提供植物轉(zhuǎn)型作用之前DNA插入物的支持性維持。主鏈部分不轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。主鏈的多種元件描述于表1中。盡管表1中展示的編號(hào)系統(tǒng)是基于pSIM1278，但主鏈序列可關(guān)于pSIM1678一致。實(shí)例4.pSIM1678植物DNA插入物和其開(kāi)放閱讀框架(ORF)pSIM1678中使用的pSIM1678DNA插入物區(qū)域(包括側(cè)接邊界序列)的長(zhǎng)度是9,090bp(從1bp到9,090bp)。pSIM1678DNA插入物僅由原生DNA組成并且穩(wěn)定整合到馬鈴薯基因體中。pSIM1678DNA插入物或其功能性部分是整合到本發(fā)明的馬鈴薯植物種類(lèi)中的載體pSIM1678的唯一基因材料。pSIM1678DNA插入物描述于圖3和以下表3中。在表3中，LB和RB序列(都是25bp)經(jīng)合成設(shè)計(jì)以與來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊界類(lèi)似并且發(fā)揮類(lèi)似功能。修改GenBank寄存編號(hào)AY566555以闡明用于邊界區(qū)域的DNA的來(lái)源。表3實(shí)例5.農(nóng)桿菌菌株和轉(zhuǎn)染通過(guò)精確刪除過(guò)毒性質(zhì)體pTiBo542的轉(zhuǎn)移DNA來(lái)產(chǎn)生C58衍生的農(nóng)桿菌菌株AGL1(拉佐(Lazo)等人1991)。經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物在含有抗生素特美汀(timentin)(其防止農(nóng)桿菌存活)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且因此選擇不含農(nóng)桿菌的植物。在選擇之后，植物不含抗生素和農(nóng)桿菌，其中馬鈴薯衍生的表達(dá)盒插入到植物的基因體中。儲(chǔ)備植物保持在40ml半強(qiáng)度M516(非泰克公司(Phytotechnology))培養(yǎng)基的洋紅色盒子中，所述培養(yǎng)基含有3％蔗糖和2g/l結(jié)冷膠(gelzan)(傳播介質(zhì))。從四周齡植物切割四到六毫米的馬鈴薯節(jié)間區(qū)段，用攜帶pSIM1278的農(nóng)桿菌AGL1菌株感染，并且轉(zhuǎn)移到含有3％蔗糖和2g/l結(jié)冷膠的組織培養(yǎng)基(共同培養(yǎng)基)中。在兩天之后，將受感染的外植體轉(zhuǎn)移到含有3％蔗糖、2g/l結(jié)冷膠、300mg/l特美汀和1.2ml植物保護(hù)培養(yǎng)基(非泰克公司)的M404(非泰克公司)培養(yǎng)基中以消除農(nóng)桿菌(不含激素的培養(yǎng)基)。通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)液-酵母提取物(NBY培養(yǎng)基)上，在28℃下，在不存在外生長(zhǎng)的情況下培育經(jīng)轉(zhuǎn)型的事件的莖干和/或葉子片段2第周(重復(fù)兩次)來(lái)獲得植物不含農(nóng)桿菌的證據(jù)。僅在不存在活的農(nóng)桿菌時(shí)在場(chǎng)地中輸送和種植經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物。所述方法的細(xì)節(jié)在其它地方描述(瑞秋(Richael)等人2008)。盡管農(nóng)桿菌在右邊界(RB)位點(diǎn)處有效裂解，但其通常不能通過(guò)也在左邊界(LB)位點(diǎn)處切割來(lái)從其質(zhì)體載體完全釋放DNA插入物(格爾文(Gelvin)2003)。因此，一些受感染的植物細(xì)胞接收DNA插入物本身以及其它含有主鏈標(biāo)記基因異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(ipt)(對(duì)于植物激素細(xì)胞分裂素)的質(zhì)體主鏈序列，所述主鏈標(biāo)記基因通常調(diào)節(jié)植物中的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程。過(guò)表達(dá)由于細(xì)胞分裂素過(guò)度產(chǎn)生而引起表現(xiàn)型發(fā)育不良、葉子異?；虿荒苌?，其用于針對(duì)含有主鏈DNA的植物進(jìn)行選擇(瑞秋等人2008)。每隔兩周，將受感染的外植體轉(zhuǎn)移到不含任何合成激素的新鮮培養(yǎng)基中并且在珀西瓦爾(Percival)生長(zhǎng)箱中，在16小時(shí)光周期下，在24o℃下培育，其中其開(kāi)始形成嫩枝。許多嫩枝表達(dá)ipt基因并且顯示細(xì)胞分裂素過(guò)度產(chǎn)生表現(xiàn)型；丟棄這些嫩枝并且不考慮進(jìn)一步分析。PCR基因分型表明約0.3到1.5％其余嫩枝含有至少一部分DNA插入物，同時(shí)不含ipt基因。褐色布爾班克W8事件含有來(lái)源于具有不同質(zhì)體的兩個(gè)單獨(dú)轉(zhuǎn)型的插入物。第一插入物，質(zhì)體pSIM1278，含有由經(jīng)設(shè)計(jì)以使塊莖中多達(dá)四種馬鈴薯基因(Asn1、Ppo5、R1和PhL)沉默的反向重復(fù)組成的兩個(gè)盒子。類(lèi)似地，第二質(zhì)體，pSIM1678，含有由用于使塊莖中的VInv基因沉默的反向重復(fù)組成的盒子，同時(shí)還在其原生馬鈴薯啟動(dòng)子下含有Rpi-vnt1基因的復(fù)本。與用于產(chǎn)生事件W8的由pSIM1278和pSIM1678進(jìn)行的褐色布爾班克的轉(zhuǎn)型相關(guān)的插入物的基因和結(jié)構(gòu)表征表明兩種轉(zhuǎn)型都產(chǎn)生每個(gè)質(zhì)體的單個(gè)整合位點(diǎn)。來(lái)源于pSIM1278的轉(zhuǎn)型作用的DNA的結(jié)構(gòu)相對(duì)于原始插入物的結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)是復(fù)雜的。所插入的DNA似乎在轉(zhuǎn)型期間經(jīng)歷重排，產(chǎn)生由Asn1/Ppo5沉默盒的串聯(lián)重復(fù)，接著幾乎整個(gè)pSIM1278構(gòu)筑體以及含有pR1/pPhl沉默盒的復(fù)制品的反向重復(fù)和具有介入Phl序列的Gbss啟動(dòng)子的串聯(lián)復(fù)制組成的結(jié)構(gòu)。盡管這一結(jié)構(gòu)比預(yù)期更復(fù)雜，但所復(fù)制的沉默盒是完整的并且仍受組織特異性啟動(dòng)子控制。所述結(jié)構(gòu)不會(huì)不利地影響產(chǎn)物的安全性或特性功效。W8還含有駐留在整合的單個(gè)基因座處的來(lái)自pSIM1678的DNA的單個(gè)復(fù)本。pSIM1678的DNA插入物含有幾乎完整的具有330-bp缺失的DNA插入物，其移除整個(gè)T-DNA左邊界和Rpi-vnt1啟動(dòng)子的137-bp。啟動(dòng)子中的這種小型缺失不影響基因提供晚疫病抗性的能力。并且，已使用RT-PCR證明與Rpi-vnt1基因相關(guān)的RNA表達(dá)。實(shí)例6.不存在載體骨架DNA的證據(jù)使用以下方法證明所研發(fā)用于市售目的的事件中不存在質(zhì)體的主鏈部分：1)如果植物具有與質(zhì)體主鏈中的陰性可選異戊烯基異構(gòu)酶(ipt)標(biāo)記基因相關(guān)的表現(xiàn)型，那么將其丟棄；2)用蛋白質(zhì)印跡雜交確認(rèn)不存在主鏈DNA；3)使用PCR確認(rèn)不存在主鏈DNA的片段?？偲饋?lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)印跡和PCR分析證實(shí)褐色布爾班克W8事件不含來(lái)自轉(zhuǎn)型中使用的質(zhì)體的主鏈。實(shí)例7.所插入的DNA的穩(wěn)定性細(xì)菌T-DNA在插入植物之后并非始終穩(wěn)定。所評(píng)估的不穩(wěn)定性比率(0.5-5.9×10-4)與減數(shù)分裂相關(guān)(穆勒(Müller)等人1987；康納(Conner)等人1998)，其與馬鈴薯無(wú)關(guān)，因?yàn)轳R鈴薯以無(wú)性繁殖方式繁殖。因此，預(yù)期DNA插入是穩(wěn)定的。使用塊莖而非種子定義后代，因?yàn)閴K莖是商業(yè)上種植的。使用分子和表現(xiàn)型分析評(píng)估基因穩(wěn)定性。使用通過(guò)三代W8馬鈴薯(G0-G3)分離的基因組DNA的蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)插入物的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，而通過(guò)在第二代田間種植的塊莖中測(cè)量多酚氧化酶活性來(lái)評(píng)估表現(xiàn)型穩(wěn)定性。這一方法展示在向馬鈴薯的切割表面施用兒茶酚之后的PPO沉默的視覺(jué)證據(jù)。進(jìn)行這些研究以確保W8中的所需基因變化在多個(gè)克隆循環(huán)中保持穩(wěn)定，同時(shí)保持特性。通過(guò)使用蛋白質(zhì)印跡比較三個(gè)連續(xù)克隆世代(G1、G2和G3)與原始轉(zhuǎn)型體(G0)來(lái)評(píng)估DNA插入物的穩(wěn)定性。預(yù)期穩(wěn)定的DNA插入物在植物的多個(gè)世代中保持相同結(jié)構(gòu)并且因此產(chǎn)生相同消化模式。為了測(cè)試W8事件中插入物的穩(wěn)定性，使用與來(lái)自pSIM1278和pSIM1678的插入物的區(qū)域雜交的兩個(gè)探針(GBS1和AGP)和對(duì)pSIM1678插入物具有特異性的兩個(gè)探針(INV和VNT1)比較其消化模式。因?yàn)榕c這些探針雜交的DNA序列包含于馬鈴薯基因體中以及DNA插入物內(nèi)，預(yù)期蛋白質(zhì)印跡中存在內(nèi)源性和插入物特異性色帶。所有基因組DNA樣品由限制酶EcoRV消化并且與對(duì)AGP或GBS1具有特異性的探針雜交。選擇EcoRV用于這些研究，因?yàn)槠湓趦煞N插入物內(nèi)消化以提供獨(dú)特顯帶模式，具有pSIM1278插入物中具有所預(yù)測(cè)的尺寸的內(nèi)部色帶(例如2.3kb)。對(duì)于兩種探針，W8的所有樣品之間的顯帶模式是彼此相同的。也在W8中發(fā)現(xiàn)在褐色布爾班克對(duì)照物中存在的多個(gè)色帶，但W8還含有對(duì)應(yīng)于pSIM1278和pSIM1678插入物的色帶。這些色帶在所分析的W8的所有世代之間類(lèi)似地不變，表明兩種插入物的基因穩(wěn)定性。使用對(duì)pSIM1678插入物具有特異性的兩個(gè)探針進(jìn)行第二分析。對(duì)于這一分析，基因組DNA樣品用限制酶XbaI消化并且與VNT1和INV探針雜交。選擇XbaI作為用于這些研究的限制酶，因?yàn)槠鋬?nèi)部消化pSIM1678并且產(chǎn)生具有已知尺寸的色帶(例如對(duì)于INV探針，4.6kb)。而且，檢測(cè)到內(nèi)源性和插入物特異性色帶，其中所分析的三個(gè)世代之間的色帶圖案不變。基因和表現(xiàn)型分析表明由pSIM1278和pSIM1678的轉(zhuǎn)型作用產(chǎn)生的插入物在三個(gè)世代內(nèi)穩(wěn)定。鑒于所證明的三個(gè)世代內(nèi)的穩(wěn)定性，可能在后續(xù)無(wú)性繁殖循環(huán)期間保持穩(wěn)定性。實(shí)例8.基因沉默的功效和組織特異性通過(guò)引入含有來(lái)源于靶向沉默的基因和啟動(dòng)子的序列的反向重復(fù)來(lái)實(shí)現(xiàn)沉默。盡管存在許多涉及雙股RNA介導(dǎo)的沉默的平行路徑，但認(rèn)為這些反向重復(fù)的轉(zhuǎn)錄是由涉及病毒防御的細(xì)胞機(jī)制處理(富薩羅(Fusaro)等人2006)。W8馬鈴薯含有三個(gè)獨(dú)特的盒子，所述盒含有來(lái)自總共五種不同馬鈴薯基因的序列。pSIM1278構(gòu)筑體由兩個(gè)基因沉默盒組成(參見(jiàn)圖4，上部構(gòu)筑體)。一個(gè)盒子含有來(lái)自?xún)煞N基因(天冬酰胺合成酶-1(Asn1)和多酚氧化酶-5(Ppo5))的序列的反向重復(fù)。第二個(gè)盒子包括來(lái)自淀粉相關(guān)基因R1(531-bp)和磷酸化酶-L(PhL)(508-bp)的啟動(dòng)子的序列。最終盒子通過(guò)pSIM1678構(gòu)筑體引入，其包括反向重復(fù)，所述反向重復(fù)含有來(lái)自液泡轉(zhuǎn)化酶(VInv)基因的序列(參見(jiàn)圖4，下部構(gòu)筑體)。所有三個(gè)沉默盒由來(lái)自馬鈴薯的Agp和Gbss基因的充分表征和組織特異性啟動(dòng)子的相同集合調(diào)節(jié)，其與光合活性組織和根相比在塊莖中具有高活性(中田(Nakata)等人1994；維瑟(Visser)等人1991)。因此，預(yù)期表達(dá)和基因沉默在塊莖中最有效并且主要受限于塊莖。通過(guò)北方印跡分析來(lái)表征所有五種目標(biāo)基因的表達(dá)，以便測(cè)定來(lái)自每個(gè)盒子的基因沉默的效用。在塊莖中觀察到Asn1、Ppo5和VInv的穩(wěn)定沉默，而R1的沉默不太有效(圖5)。PhL的沉默視為無(wú)效，因?yàn)槲丛趯?duì)照物與W8樣品之間觀察到可測(cè)量的差異。在其它具有相同pSIM1278構(gòu)筑體的事件中，觀察到塊莖中用于PhL和R1的啟動(dòng)子的部分沉默(科林奇(Collinge)和克拉克(Clark)2013)。前述研究顯示Ppo基因沉默可使相關(guān)蛋白質(zhì)的量降低到西方印跡分析不可檢測(cè)的含量(略倫特(Llorente)等人2011)。類(lèi)似地，R1基因的沉默將減少約160kDa蛋白質(zhì)的聚集，所述蛋白質(zhì)至少部分結(jié)合于淀粉顆粒(羅貝斯(Lorberth)等人1998)。在其它植物組織中評(píng)估目標(biāo)基因表達(dá)以測(cè)定基因沉默的特異性。對(duì)從來(lái)自W8和褐色布爾班克對(duì)照物的葉子、莖干、根和花朵分離的RNA類(lèi)似地進(jìn)行北方印跡分析。如圖6、7和8中所示，與褐色布爾班克對(duì)照物相比，葉子、莖干或根中不存在目標(biāo)基因的沉默。除對(duì)應(yīng)于VInv基因(其在所有葉子和莖干樣品(包括對(duì)照物)中弱表達(dá))的轉(zhuǎn)錄物以外，所有轉(zhuǎn)錄物可容易地檢測(cè)。除塊莖以外僅有的觀察到其中一些目標(biāo)沉默的組織是在花朵樣品中。這些樣品表明與褐色布爾班克對(duì)照物相比，W8中Asn1轉(zhuǎn)錄物的一些沉默，其可歸因于所述組織中的一些泄露表達(dá)(圖9)。引入褐色布爾班克中以產(chǎn)生W8事件的三個(gè)基因沉默盒中的兩個(gè)極有效地使其用于RNAi介導(dǎo)的沉默的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物沉默。這兩個(gè)構(gòu)筑體有效地使W8的塊莖中的Asn1、Ppo5和VInv沉默。對(duì)塊莖的沉默特異性表明極少數(shù)(如果存在)由RNAi機(jī)制產(chǎn)生的siRNA傳播到其它組織或其含量不足以引起這些組織中的RNAi反應(yīng)。塊莖外部沉默的唯一證據(jù)是在花朵中，其中觀察到較低含量的Asn1，但變化量值與塊莖中相比顯著較低。用PhL和R1進(jìn)行的啟動(dòng)子沉默策略具有最小作用，其與其它含有相同pSIM1278構(gòu)筑體的事件一致(科林奇和克拉克2013)。如所預(yù)期，進(jìn)一步證實(shí)與Asn1、Ppo5和VInv相關(guān)的降低的RNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。此外，組成和農(nóng)藝資料未顯示任何將與顯著脫靶作用或不希望的沉默相關(guān)的出人意料的表現(xiàn)型。舉例來(lái)說(shuō)，塊莖中Asn1強(qiáng)沉默限制氨基酸天冬酰胺的聚集，而葉子或莖干中Asn1的沉默可不利地影響生長(zhǎng)和發(fā)育，這是不希望看到的。因此，RNAi反應(yīng)是有效和特異性的并且未表明使這些馬鈴薯基因沉默將影響雜草化或其它植物-害蟲(chóng)特征。實(shí)例9.馬鈴薯栽培品種W8表征概述馬鈴薯變種W8通過(guò)增加對(duì)晚疫病的抗性、降低可引起黑斑損傷的酶的表達(dá)和降低丙烯酰胺(通過(guò)降低反應(yīng)物(即天冬酰胺和還原糖)的濃度)來(lái)解決馬鈴薯工業(yè)中改良質(zhì)量的需求。馬鈴薯變種W8用對(duì)馬鈴薯植物基因體來(lái)說(shuō)原生并且不含外來(lái)DNA、農(nóng)桿菌DNA、病毒標(biāo)記物或載體主鏈序列的核酸序列轉(zhuǎn)型。此外，進(jìn)行農(nóng)藝研究以確保除與所述特性相關(guān)的特征以外，事件與常規(guī)對(duì)照物相同地生長(zhǎng)。農(nóng)藝特征保持農(nóng)藝試驗(yàn)以確認(rèn)當(dāng)在代表美國(guó)用于馬鈴薯生產(chǎn)的主要區(qū)域的多個(gè)地區(qū)生長(zhǎng)時(shí)，褐色布爾班克變種W8與對(duì)照物褐色布爾班克相比具有等效表現(xiàn)型。在2012年和2013年生長(zhǎng)的W8和對(duì)照物的農(nóng)藝特征、產(chǎn)量和定級(jí)特征的評(píng)估的概述展示于表4和5中。總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果證實(shí)關(guān)于這些特征，W8與對(duì)照物之間不存在主要差異。在以下表4和5中，第1欄展示特征，第2欄展示種類(lèi)，第3欄展示所測(cè)試的植物的數(shù)目，第4欄展示特征的LS平均值，第5欄展示p值(粗體和下劃線指示統(tǒng)計(jì)顯著差異)，第6欄展示標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，第7欄展示90％置信區(qū)間(CI)并且第8欄展示常規(guī)種類(lèi)的平均值范圍(CVR)。在表5中，比較油炸塊莖條的顏色與USDA蒙賽爾比色卡(USDAMunsellcolorchart)。高糖是當(dāng)與用于法式油炸馬鈴薯的蒙賽爾比色卡相比時(shí)，在最暗側(cè)上具有3號(hào)或更暗的主要顏色的油炸條的塊莖的百分比。糖端是在測(cè)試3號(hào)或更暗的顏色時(shí)，關(guān)于條帶的整個(gè)寬度，在條帶的最暗側(cè)上具有1/4英寸長(zhǎng)度或更長(zhǎng)的末端的油炸條的塊莖的百分比(USDAAMS1969)。Fry0-Fry4是當(dāng)比較最暗側(cè)的主要顏色與用于法式油炸馬鈴薯的蒙賽爾比色卡時(shí)，具有分別測(cè)定為0-4的顏色讀數(shù)的油炸條的塊莖的百分比。因此，所報(bào)導(dǎo)的數(shù)字是蒙賽爾圖表上評(píng)分0、1、2、3或4的油炸物的百分比。評(píng)分越低顏色越好，0是最佳的。表4表5基于表4和5中呈現(xiàn)的關(guān)于馬鈴薯栽培品種W8的資料，總體上可得出除早期出現(xiàn)百分比和糖端百分比以外，未經(jīng)轉(zhuǎn)型的褐色布爾班克種類(lèi)與馬鈴薯栽培品種W8之間不存在農(nóng)藝特征、產(chǎn)量和評(píng)級(jí)以及生態(tài)相互作用方面的主要差異。因此，基于多年資料，褐色布爾班克種類(lèi)W8不存在由雜草化或植物害蟲(chóng)可能性引起的環(huán)境的持久性的顯著風(fēng)險(xiǎn)。晚疫病抗性許多馬鈴薯栽培品種易患晚疫病，其為一種由真菌類(lèi)卵菌綱病原體致病疫霉引起的破壞性疾病。馬鈴薯的晚疫病通過(guò)葉子和莖干上可快速擴(kuò)散并且變得壞死的黑色/褐色病灶鑒別。當(dāng)致病疫霉在宿主作物上快速生長(zhǎng)和繁殖時(shí)發(fā)生嚴(yán)重晚疫病傳染性。已將稱(chēng)為Rpi-vnt1的馬鈴薯晚疫病抗性基因添加到W8中，成功地賦予晚疫病抗性。為了證明晚疫病抗性的功效，通過(guò)接種褐色布爾班克種類(lèi)W8和對(duì)照物褐色布爾班克的簇葉和塊莖來(lái)進(jìn)行研究。在試驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)，進(jìn)行每個(gè)位點(diǎn)的評(píng)級(jí)并且概述于以下表6和7中。對(duì)馬鈴薯晚疫病的葉面抗性的結(jié)果展示于表6中。每個(gè)菌株位點(diǎn)視在所述區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的菌株而具有不同菌株接種物，其包括US-8、US-22或US-23。表6，第1欄展示種類(lèi)，第2欄展示葉面晚疫病感染LS平均百分比，第3欄展示p值，其中W8與對(duì)照物之間的顯著差異標(biāo)有粗體和下劃線，并且第4欄展示常規(guī)種類(lèi)范圍，其是常規(guī)種類(lèi)的平均值范圍。表6種類(lèi)葉面晚疫病感染平均百分比P值CVR對(duì)照物58.3<0.000118.8-100W80.50..如表6中所示，與褐色布爾班克對(duì)照物相比，檢測(cè)到W8的葉面晚疫病感染百分比的顯著降低，其支持馬鈴薯晚疫病抗性基因賦予W8中對(duì)晚疫病的抗性和在簇葉中有效的結(jié)論。以下表7展示W(wǎng)8和對(duì)照物的塊莖晚疫病感染率的結(jié)果，如通過(guò)感染百分比測(cè)定。表7，第1欄展示晚疫病分離物，第2欄展示種類(lèi)，第3欄展示晚疫病塊莖感染平均百分比并且第4欄展示P值，其中W8與對(duì)照物褐色布爾班克之間的顯著差異標(biāo)有粗體和下劃線。表7分離物種類(lèi)晚疫病塊莖感染平均百分比P值US-22對(duì)照物100.0.US-22W851.0<0.0001US-8對(duì)照物67.0US-8W821.1<0.0001如表7中所示，對(duì)于US-22和US-8分離物，與對(duì)照物相比，檢測(cè)到W8的塊莖中晚疫病感染百分比的顯著降低。黑斑損傷耐受性黑斑損傷是一種影響受損塊莖的變色，其代表馬鈴薯工業(yè)中最重要的質(zhì)量問(wèn)題之一。所述病狀是多酚氧化酶(Ppo)從破損的質(zhì)體泄漏到細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)果。在細(xì)胞質(zhì)中，酶使多酚氧化，其接著形成黑色沉淀物。pSIM1278DNA插入物的兩個(gè)沉默盒中的一個(gè)含有來(lái)自馬鈴薯野生種的在調(diào)節(jié)元件之間以反向重復(fù)形式安置的Ppo5基因的片段的兩個(gè)復(fù)本。這一反向重復(fù)的表達(dá)觸發(fā)馬鈴薯Ppo5基因的沉默并且顯著降低黑斑損傷的發(fā)生率。以?xún)煞N關(guān)于黑斑損傷耐受性的方式分析馬鈴薯栽培品種W8對(duì)照物褐色布爾班克種類(lèi)的塊莖，其易于發(fā)生黑斑損傷。塊莖變色是由多酚氧化酶的活性引起，其使包括兒茶酚的苯酚氧化以產(chǎn)生快速聚合以產(chǎn)生顏料的化合物。一種測(cè)試黑斑損傷耐受性的間接方法是基于將1ml兒茶酚(25mM于50mMMOPS中，pH6.5)抽吸到塊莖的切割表面上并且監(jiān)測(cè)深褐色沉淀物的Ppo依賴(lài)性產(chǎn)生。在20分鐘之后評(píng)估深褐色沉淀物的Ppo依賴(lài)性產(chǎn)生。馬鈴薯栽培品種W8的兒茶酚分析的結(jié)果展示于圖10中。如圖10中所見(jiàn)，褐色布爾班克對(duì)照物變成深褐色表明黑斑損傷，而馬鈴薯栽培品種W8未變成深褐色表明W8與未經(jīng)轉(zhuǎn)型的褐色布爾班克對(duì)照物相比對(duì)黑斑損傷的抗性更高，并且支持降低的黑斑特性的功效。第二種分析損傷耐受性的方法是用酶促分析來(lái)測(cè)量PPO活性。隨時(shí)間推移通過(guò)測(cè)量Α474nm·ΔA474nm·min-1來(lái)監(jiān)測(cè)L-DOPA轉(zhuǎn)化成多巴色素的轉(zhuǎn)化率，其轉(zhuǎn)換成μmol·min-1·mg塊莖干重-1。如表8中所示，酶促分析表明當(dāng)與褐色布爾班克對(duì)照物相比時(shí)，W8具有PPO活性的90％降低(0.025μmol·min-1·mg塊莖干重-1)。W8塊莖中降低的活性通過(guò)Ppo5基因的沉默與減少的黑斑相關(guān)聯(lián)。表8天冬酰胺和丙烯酰胺含量在收集時(shí)，馬鈴薯栽培品種W8的塊莖與對(duì)照物相比含有較少的游離天冬酰胺，但含有較多天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸，如表9中所示。W8的游離天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的平均值皆在耐受區(qū)間和組合文獻(xiàn)范圍內(nèi)，并且因此視為在馬鈴薯的正常范圍內(nèi)。表9，第1欄展示氨基酸(mg/100g)，第2欄展示種類(lèi)，第3欄展示LS平均值，第4欄展示P值，其中W8與對(duì)照物褐色布爾班克之間的顯著差異標(biāo)有粗體和下劃線，第5欄展示所測(cè)試的植物數(shù)目，第6欄展示范圍，第7欄展示耐受區(qū)間范圍(TI)，第8欄展示組合文獻(xiàn)范圍(CLR)，由戴維斯(Davies)(1977),謝普德(Shepherd)等人(2010)和利辛斯卡(Lisinska)和列辛斯基(Leszczynski)(1989)獲得。表9降低的天冬酰胺、果糖和葡萄糖含量引起經(jīng)加工的馬鈴薯產(chǎn)物中丙烯酰胺的整體降低，因?yàn)槠涫潜０沸纬芍械姆磻?yīng)物。為了證明減少丙烯酰胺的功效，在采集時(shí)和在正常(46℉)和冷藏(38℉)儲(chǔ)存溫度下儲(chǔ)存3、6和9個(gè)月之后分析W8和對(duì)照物褐色布爾班克的田間種植塊莖，其中結(jié)果展示于表10和11中。在測(cè)試丙烯酰胺之前，將W8和對(duì)照物褐色布爾班克制成薯?xiàng)l。表10展示在采集時(shí)和在46℉下儲(chǔ)存之后的薯?xiàng)l丙烯酰胺含量(十億分率；ppb)，并且表11展示在采集時(shí)和在38℉下儲(chǔ)存之后的薯?xiàng)l丙烯酰胺含量(十億分率；ppb)。表10和11，第1欄展示在進(jìn)行測(cè)試時(shí)的時(shí)序，第2欄展示化合物，第3欄展示種類(lèi)，第4欄展示丙烯酰胺含量LS平均值(ppb)，第5欄展示P值，其中W8與對(duì)照物之間的顯著差異標(biāo)有粗體和下劃線，第6欄展示在相同儲(chǔ)存時(shí)間時(shí)，與對(duì)照物相比丙烯酰胺的降低百分比，第7欄展示所測(cè)試的塊莖數(shù)目，第8欄展示丙烯酰胺范圍(ppb)并且第9欄展示耐受區(qū)間(TI)。表10表11如表10中所示，在采集時(shí)，由W8塊莖制成的薯?xiàng)l中所含的丙烯酰胺比對(duì)照物褐色布爾班克少85％。當(dāng)馬鈴薯在46℉下儲(chǔ)存九個(gè)月時(shí)，W8中的丙烯酰胺含量比對(duì)照物褐色布爾班克低78％至83.7％。如表11中所示，在38℉下儲(chǔ)存6到9個(gè)月之后，W8薯?xiàng)l中的丙烯酰胺含量始終顯著低于對(duì)照物。還原糖和轉(zhuǎn)化酶沉默馬鈴薯栽培品種W8含有表達(dá)盒，其通過(guò)多種機(jī)制降低塊莖中還原糖的含量。通過(guò)pSIM1278的轉(zhuǎn)型作用，引入用于淀粉相關(guān)基因(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動(dòng)子的沉默盒，而pSIM1678的轉(zhuǎn)型作用引入用于轉(zhuǎn)化酶基因的沉默盒(葉(Ye)等人2010)?？偠灾?，這些特性通過(guò)減緩淀粉和蔗糖轉(zhuǎn)化成還原糖(葡萄糖和果糖)來(lái)發(fā)揮功能。當(dāng)在采集之后一個(gè)月分析時(shí)，盡管R1和PhL的沉默引起還原糖含量降低(科林奇和克拉克2013)，但主要的還原糖降低似乎與轉(zhuǎn)化酶沉默相關(guān)。使R1、PhL和VInv沉默的整體優(yōu)勢(shì)包括改良的質(zhì)量，尤其與顏色對(duì)照物相關(guān)，并且因此有助于大部分薯?xiàng)l或晶片消費(fèi)者要求的所需金褐色。而且，還原糖與氨基酸(如天冬酰胺)反應(yīng)以產(chǎn)生梅納產(chǎn)物，包括丙烯酰胺。pSIM1678中的VInv基因沉默盒引起液泡轉(zhuǎn)化酶含量降低，液泡轉(zhuǎn)化酶是將蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖的酶。當(dāng)馬鈴薯中轉(zhuǎn)化酶的含量降低時(shí)，還原糖葡萄糖和果糖在儲(chǔ)存期間保持低含量而蔗糖增加，尤其當(dāng)保持在低于薯?xiàng)l的典型儲(chǔ)存溫度46-48℉下時(shí)。在測(cè)試轉(zhuǎn)化酶活性之前，塊莖在39℉下儲(chǔ)存一個(gè)月。使用W8和褐色布爾班克對(duì)照物中的每一個(gè)的三個(gè)復(fù)本進(jìn)行分析并且通過(guò)葡萄糖聚集來(lái)測(cè)量活性(單位：nmol/min/gm塊莖)。如表12中所示，與對(duì)照物褐色布爾班克相比，W8具有冷凍儲(chǔ)存的塊莖中的液泡轉(zhuǎn)化酶活性降低85％。W8塊莖中降低的液泡轉(zhuǎn)化酶活性與由VInv基因和較低含量的還原糖葡萄糖和果糖引起的RNA聚集減少相關(guān)，如表13和14中所示。表12需要長(zhǎng)期冷凍儲(chǔ)存以保持高質(zhì)量馬鈴薯的充分供應(yīng)，以便在整年內(nèi)加工成薯?xiàng)l和薯片，但也引起冷凍誘導(dǎo)的甜化(CIS)。CIS引起在高溫下加工的馬鈴薯產(chǎn)物中不合需要的副作用，包括味道改變、不合需要的黑色和丙烯酰胺量升高。液泡酸轉(zhuǎn)化酶(VInv)是一種在CIS過(guò)程中極其重要的酶，其增加在極低溫度下儲(chǔ)存的塊莖中葡萄糖和果糖的量(茨倫納(Zrenner)等人1996)。W8具有VInv基因的抑制表達(dá)，并且因此在冷凍儲(chǔ)存時(shí)具有降低的葡萄糖和果糖含量且與褐色布爾班克對(duì)照物相比具有較少CIS。為了說(shuō)明引起降低的還原糖的特性的功效，在采集時(shí)以及在正常(46℉)和冷凍(38℉)儲(chǔ)存溫度下分析W8和未經(jīng)轉(zhuǎn)型的對(duì)照物的田間種植塊莖。在采集時(shí)并且接著在儲(chǔ)存3、6和9個(gè)月之后測(cè)試W8中的還原糖葡萄糖加果糖以及非還原糖蔗糖。使用兩種不同儲(chǔ)存溫度，46°F，其通常用于指定用于冷凍薯?xiàng)l的褐色布爾班克馬鈴薯，和38°F，由使VInv沉默而實(shí)現(xiàn)的較低溫度，可能在不存在高還原糖含量的情況下實(shí)現(xiàn)更好的質(zhì)量。在采集時(shí)和在所有儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn)和溫度下，W8塊莖與對(duì)照物相比含有較低含量的還原糖果糖和葡萄糖，如表13和14中所示。W8在采集時(shí)的所有糖值皆在耐受區(qū)間內(nèi)，表明與對(duì)照物在組成上等效。表13展示在采集時(shí)和在46℉下儲(chǔ)存3、6或9個(gè)月之后，果糖加葡萄糖和蔗糖的馬鈴薯糖含量，并且表14展示當(dāng)在38℉下儲(chǔ)存6或9個(gè)月時(shí)，果糖加葡萄糖和蔗糖的馬鈴薯糖含量。表13和14，第1欄展示在進(jìn)行測(cè)試時(shí)的時(shí)序，第2欄展示種類(lèi)，第3欄展示糖含量LS平均值(mg/100g)，第4欄展示P值，其中W8與對(duì)照物之間的顯著差異標(biāo)有粗體和下劃線，第5欄展示所測(cè)試的塊莖數(shù)目，第6欄展示糖范圍(mg/100g)并且第7欄展示耐受區(qū)間(TI)。表13表14如表13和14中所示，在38°F和46°F下，在采集時(shí)和在多個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn)之后，所有W8塊莖與對(duì)照樣品相比含有更多的蔗糖。使W8中VInv基因沉默的最終結(jié)果是較低含量的還原糖和較高含量的蔗糖。在采集時(shí)和在長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月的整個(gè)存儲(chǔ)周期內(nèi)觀察到這些變化。W8中的還原糖隨儲(chǔ)存時(shí)間而增加，但始終保持低于褐色布爾班克對(duì)照物。當(dāng)在38°F下儲(chǔ)存時(shí)，與對(duì)照物相比，在W8中觀察到顯著更低含量的還原糖，表明對(duì)W8可實(shí)行更低的溫度儲(chǔ)存。在所有情況下，還原糖的顯著降低與較高含量的蔗糖偶合。預(yù)期較低的溫度儲(chǔ)存引起呼吸損耗較少，但也將降低由疾病引起的損失。褐色布爾班克馬鈴薯栽培品種W8通過(guò)增加對(duì)晚疫病的抗性、降低可引起黑斑的酶的表達(dá)、通過(guò)降低天冬酰胺和降低還原糖含量來(lái)減少丙烯酰胺來(lái)解決馬鈴薯工業(yè)中改良質(zhì)量的需要。本發(fā)明的其它實(shí)施例產(chǎn)生可組合上文提及的有利特征的馬鈴薯種類(lèi)的研究大部分是憑經(jīng)驗(yàn)的。這種研究需要投入大量時(shí)間、勞動(dòng)力和金錢(qián)。從溫室到市售用途，馬鈴薯栽培品種的研發(fā)通?？珊馁M(fèi)長(zhǎng)達(dá)八年或更長(zhǎng)時(shí)間。育種從謹(jǐn)慎選擇優(yōu)良親本開(kāi)始，以將最重要的特征并入后代。因?yàn)樗兴杼匦酝ǔ２粫?huì)僅在一次雜交后呈現(xiàn)，育種必須是累積的。現(xiàn)有育種技術(shù)繼續(xù)使用親本純系的受控授粉作用。通常，在明膠膠囊中收集花粉以供稍后用于對(duì)雌性親本授粉。在溫室中播種雜交種子并且從數(shù)千個(gè)個(gè)別幼苗收集和保留塊莖。第二年，在田間種植來(lái)自每個(gè)所得幼苗的一到四個(gè)塊莖，其中非常注意避免病毒和疾病的傳播。由這種第一年幼苗作物，保留在選擇過(guò)程中存活的來(lái)自每個(gè)雜交個(gè)體的若干“種子”塊莖以用于后一年的種植。在第二年之后，收集樣品以用于密度測(cè)量和油炸測(cè)試，以便測(cè)定塊莖對(duì)市售使用的合適性。接著，在第三年，以擴(kuò)增量種植在這點(diǎn)上在選擇過(guò)程中存活的植物，以用于更全面的油炸測(cè)試和密度測(cè)定系列。在研發(fā)的第四年階段，存活選擇在若干狀態(tài)下經(jīng)歷田間試驗(yàn)以測(cè)定其對(duì)不同生長(zhǎng)條件的適應(yīng)性。最終，將具有優(yōu)良質(zhì)量的種類(lèi)轉(zhuǎn)移到其它農(nóng)場(chǎng)并且種子增加到市售規(guī)模。通常，到這時(shí)，已經(jīng)嘗試投資八年或更長(zhǎng)時(shí)間的種植、采集和測(cè)試以研發(fā)新的和改良的馬鈴薯栽培品種。隨著允許編碼特異性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因的分離和表征的分子生物技術(shù)出現(xiàn)，植物生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對(duì)工程改造植物的基因體以含有和表達(dá)外來(lái)基因或其它基因，或原生基因的經(jīng)修飾版本或內(nèi)源性基因(可能由不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))以便以特異性方式改變植物的特性產(chǎn)生強(qiáng)烈興趣。這類(lèi)外來(lái)其它和/或經(jīng)修飾基因在本文中統(tǒng)稱(chēng)為“轉(zhuǎn)基因”。在最近十五到二十年，已研發(fā)若干種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，并且在特定實(shí)施例中，本發(fā)明也涉及所要求的種類(lèi)或品系的經(jīng)轉(zhuǎn)型版本。植物轉(zhuǎn)型涉及將在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體的構(gòu)筑。這類(lèi)載體包含DNA，其包含受調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)控制或可操作地連接于調(diào)節(jié)元件的基因。表達(dá)載體可含有一或多個(gè)這類(lèi)可操作地連接的基因/調(diào)節(jié)元件組合。載體可呈質(zhì)體形式，并且單獨(dú)或與其它質(zhì)體組合使用，使用如下文所述的轉(zhuǎn)型方法將轉(zhuǎn)基因并入馬鈴薯植物的基因材料，以便提供經(jīng)轉(zhuǎn)型的馬鈴薯植物。傳統(tǒng)植物育種通常依賴(lài)于植物染色體的隨機(jī)再結(jié)合，以產(chǎn)生具有新的和改良的特征的種類(lèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)、眾所周知的技術(shù)，將包含基因和調(diào)節(jié)元件的基因“表達(dá)盒”插入農(nóng)桿菌分離的轉(zhuǎn)移DNA(“T-DNA”)的邊界內(nèi)并且整合到植物基因組中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA物質(zhì)的轉(zhuǎn)移通常包含以下標(biāo)準(zhǔn)程序：(1)基因元件的活體外再結(jié)合，其中至少一個(gè)基因元件是外來(lái)來(lái)源，以便產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)型作用的選擇的表達(dá)盒，(2)將這一表達(dá)盒(通常與至少一個(gè)含有外來(lái)DNA的其它表達(dá)盒)一起插入雙運(yùn)載體的T-DNA區(qū)域，所述T-DNA區(qū)域通常由數(shù)百個(gè)由T-DNA邊界序列側(cè)接的農(nóng)桿菌DNA的堿基對(duì)組成，(3)將位于T-DNA邊界之間的序列(通常伴有來(lái)自農(nóng)桿菌的一些或全部其它雙運(yùn)載體序列)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，和(4)選擇顯示所需特性的經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞，如產(chǎn)量增加、活力改良、對(duì)疾病和昆蟲(chóng)的抗性增強(qiáng)或更大的在應(yīng)力下的存活能力。因此，遺傳工程改造方法依賴(lài)于外來(lái)、非原生核酸(包括調(diào)節(jié)元件，如啟動(dòng)子和終止子)和涉及新特性的表達(dá)或充當(dāng)用于轉(zhuǎn)型體的鑒別和選擇的標(biāo)記物(來(lái)自病毒、細(xì)菌和植物)的基因的引入。標(biāo)記物基因通常來(lái)源于細(xì)菌來(lái)源并且提供抗生素或除草劑抗性。經(jīng)典育種方法是費(fèi)力和耗時(shí)的，并且新種類(lèi)通常僅顯示相對(duì)適度的改良。在“反義”技術(shù)中，顛倒原生基因的序列以使轉(zhuǎn)基因植物中基因的表達(dá)沉默。然而，反向DNA通常含有插入在啟動(dòng)子與終止子之間的新的和未表征的開(kāi)放閱讀框架，其編碼可能不合需要的外來(lái)氨基酸序列，因?yàn)槠涓蓴_植物發(fā)育和/或降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。用于馬鈴薯轉(zhuǎn)型的表達(dá)載體：標(biāo)記基因表達(dá)載體包括至少一種基因標(biāo)記物，其可操作地連接于調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)，所屬調(diào)節(jié)元件允許通過(guò)陰性選擇(即，抑制不含有可選標(biāo)記基因的細(xì)胞的生長(zhǎng))或陽(yáng)性選擇(即，篩選由基因標(biāo)記物編碼的產(chǎn)物)回收含有所述標(biāo)記物的經(jīng)轉(zhuǎn)型細(xì)胞。許多用于植物轉(zhuǎn)型的常用可選標(biāo)記基因是轉(zhuǎn)型技術(shù)中眾所周知的，并且包括例如編碼可以代謝方式使選擇性化學(xué)試劑(其可以是抗生素或除草劑)解毒的酶的基因，或編碼對(duì)抑制劑不敏感的改變的目標(biāo)的基因。所屬領(lǐng)域中也已知少數(shù)陽(yáng)性選擇方法。一種用于植物轉(zhuǎn)型的常用可選標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)基因，其受植物調(diào)節(jié)信號(hào)控制，提供對(duì)卡那霉素(kanamycin)的抗性。弗雷利(Fraley)等人,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),80:4803(1983)。另一種常用可選標(biāo)記基因是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其提供對(duì)抗生素潮霉素的抗性。范登艾爾澤(VandenElzen)等人,植物分子生物學(xué)(PlantMol.Biol.),5:299(1985)。提供對(duì)抗生素的抗性的細(xì)菌來(lái)源的其它可選標(biāo)記基因包括健大霉素(gentamycin)乙酰基轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和氨基糖苷-3'-腺苷轉(zhuǎn)移酶(博萊霉素(bleomycin)抗性決定子)。海福德(Hayford)等人,植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)86:1216(1988)，瓊斯(Jones)等人,分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.),210:86(1987)，斯瓦伯(Svab)等人,植物分子生物學(xué)14:197(1990)，希爾(Hille)等人,植物分子生物學(xué)7:171(1986)。其它可選標(biāo)記基因提供對(duì)除草劑(如草甘膦(glyphosate)、草銨膦(glufosinate)或溴苯腈(bromoxynil))的抗性?？汽?Comai)等人,自然(Nature)317:741-744(1985)，戈登-卡姆(Gordon-Kamm)等人,植物細(xì)胞(PlantCell)2:603-618(1990)和斯德克(Stalker)等人,科學(xué)(Science)242:419-423(1988)。非細(xì)菌來(lái)源的用于植物轉(zhuǎn)型的可選標(biāo)記基因包括例如小鼠二氫葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶和植物乙酰乳酸合成酶。艾科茨(Eichholtz)等人,體細(xì)胞分子遺傳學(xué)(SomaticCellMol.Genet.)13:67(1987)，沙阿(Shah)等人,科學(xué)233:478(1986)，查爾斯特(Charest)等人,植物細(xì)胞報(bào)告(PlantCellRep.)8:643(1990)。另一種用于植物轉(zhuǎn)型的標(biāo)記物基因需要篩選假設(shè)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞，而非用于對(duì)毒性物質(zhì)(如抗生素)的抗性的經(jīng)轉(zhuǎn)型細(xì)胞的直接遺傳選擇。這些基因尤其適用于定量或觀察特異性組織中基因的表達(dá)的空間模式并且通常稱(chēng)為報(bào)導(dǎo)子基因，因?yàn)槠淇膳c用于基因表達(dá)的研究的基因或基因調(diào)節(jié)序列融合。用于篩選假設(shè)轉(zhuǎn)型細(xì)胞的常用基因包括β-葡糖苷酸酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、英光素酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。杰佛森(Jefferson,R.A.),植物分子生物學(xué)報(bào)導(dǎo)5:387(1987)，泰里(Teeri)等人,歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBOJ.)8:343(1989)，孔茨(Koncz)等人,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊84:131(1987)，德布勞克(DeBlock)等人，歐洲分子生物學(xué)雜志3:1681(1984)。用于觀察GUS活性的活體內(nèi)方法無(wú)需破壞可使用的植物組織。分子探針公司(MolecularProbes)公開(kāi)案2908，IMAGENEGREEN,第1-4頁(yè)(1993)和奈爾維(Naleway)等人,細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.CellBiol.)115:151a(1991)。然而，由于低敏感性、高熒光背景和與使用螢光素酶基因作為可選標(biāo)記相關(guān)的局限性，未證明這些用于觀察GUS活性的活體內(nèi)方法適用于回收經(jīng)轉(zhuǎn)型的細(xì)胞。最近，已使用編碼綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein/GFP)的基因作為用于原核和真核細(xì)胞中的基因表達(dá)的標(biāo)記物。查爾菲(Chalfie)等人,科學(xué)263:802(1994)?？墒褂肎FP和GFP的突變體作為可篩選標(biāo)記物。用于馬鈴薯轉(zhuǎn)型的表達(dá)載體：?jiǎn)?dòng)子表達(dá)載體中包括的基因必須由包含調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)的核苷酸序列驅(qū)動(dòng)。若干類(lèi)型的啟動(dòng)子以及其它可單獨(dú)或與啟動(dòng)子組合使用的調(diào)節(jié)元件在轉(zhuǎn)型技術(shù)中是眾所周知的。如本文中所使用，“啟動(dòng)子”包括對(duì)來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始并且涉及RNA聚合酶和其它用于起始轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合的DNA上游區(qū)域的參考?！爸参飭?dòng)子”是能夠引起植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在研發(fā)控制下的啟動(dòng)子的實(shí)例包括優(yōu)先起始某些組織中的轉(zhuǎn)錄(如葉子、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織)的啟動(dòng)子。這類(lèi)啟動(dòng)子稱(chēng)為“組織優(yōu)選”。僅起始某一組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子稱(chēng)為“組織特異性”?！凹?xì)胞類(lèi)型”特異性啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)一或多種器官中某些細(xì)胞類(lèi)型(例如根或葉中的維管細(xì)胞)中的表達(dá)。“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子是受環(huán)境控制的啟動(dòng)子?？梢酝ㄟ^(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件或存在光。組織特異性、組織優(yōu)選、細(xì)胞類(lèi)型特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組成“非組成性”啟動(dòng)子類(lèi)別。“組成性”啟動(dòng)子是在大部分環(huán)境條件下具有活性的啟動(dòng)子。A.誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接于用于馬鈴薯中的表達(dá)的基因。任選地，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接于編碼信號(hào)序列的核苷酸序列，所述信號(hào)序列可操作地連接于用于馬鈴薯中的表達(dá)的基因。在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子情況下，轉(zhuǎn)錄率回應(yīng)于誘導(dǎo)劑而增加。本發(fā)明可使用任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。參見(jiàn)沃德(Ward)等人,植物分子生物學(xué)22:361-366(1993)。例示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括(但不限于)來(lái)自ACEI系統(tǒng)的對(duì)銅起反應(yīng)的啟動(dòng)子(米特(Mett)等人,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊90:4567-4571(1993))；來(lái)自玉米的對(duì)苯磺酰胺除草劑安全劑起反應(yīng)的In2基因(赫胥(Hershey)等人,分子基因遺傳學(xué)(Mol.GenGenetics)227:229-237(1991)和加茨(Gatz)等人,分子基因遺傳學(xué)243:32-38(1994))或來(lái)自Tn10的Tet抑制劑(加茨等人,分子基因遺傳學(xué)227:229-237(1991))。尤其優(yōu)選誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是對(duì)誘導(dǎo)劑起反應(yīng)的啟動(dòng)子，其中植物通常不對(duì)所述誘導(dǎo)劑起反應(yīng)。例示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是來(lái)自類(lèi)固醇激基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性是由糖皮類(lèi)固醇激素誘導(dǎo)。斯赫納(Schena)等人,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊88:0421(1991)。B.組成型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子可操作地連接于用于馬鈴薯中的表達(dá)的基因或組成型啟動(dòng)子可操作地連接于編碼信號(hào)序列的核苷酸序列，所述信號(hào)序列可操作地連接于用于馬鈴薯中的表達(dá)的基因。本發(fā)明中可使用許多不同的組成型啟動(dòng)子。例示性組成型啟動(dòng)子包括(但不限于)來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子，如來(lái)自CaMV的35S啟動(dòng)子(奧德?tīng)?Odell)等人,自然313:810-812(1985))和來(lái)自如大米肌動(dòng)蛋白的基因的啟動(dòng)子(麥克爾羅伊(McElroy)等人,植物細(xì)胞2:163-171(1990))；泛素(克里斯滕森(Christensen)等人,植物分子生物學(xué)12:619-632(1989)和克里斯滕森等人,植物分子生物學(xué)18:675-689(1992))；pEMU(拉斯特(Last)等人,理論應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor.Appl.Genet.)81:581-588(1991))；MAS(費(fèi)爾滕(Velten)等人,歐洲分子生物學(xué)雜志3：2723-2730(1984))和玉米H3組蛋白(勒珀蒂(Lepetit)等人,分子基因遺傳學(xué)231:276-285(1992)和安塔索瓦(Atanassova)等人,植物雜志(PlantJournal)2(3):291-300(1992))。ALS啟動(dòng)子，對(duì)于甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)ALS3結(jié)構(gòu)基因位于5'的Xba1/Ncol片段(或與所述Xba1/Ncol片段類(lèi)似的核苷酸序列)，代表尤其適用的組成型啟動(dòng)子。參見(jiàn)PCT申請(qǐng)案WO96/30530。C.組織特異性或組織優(yōu)選啟動(dòng)子組織特異性啟動(dòng)子可操作地連接于用于馬鈴薯中的表達(dá)的基因。任選地，組織特異性啟動(dòng)子可操作地連接于編碼信號(hào)序列的核苷酸序列，所述信號(hào)序列可操作地連接于用于馬鈴薯中的表達(dá)的基因。可操作地連接于組織特異性啟動(dòng)子的經(jīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)型的植物獨(dú)占地或優(yōu)選地在特定組織中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。本發(fā)明中可使用任何組織特異性或組織優(yōu)選啟動(dòng)子。例示性組織特異性或組織優(yōu)選啟動(dòng)子包括(但不限于)根優(yōu)選啟動(dòng)子，如來(lái)自菜豆蛋白基因的啟動(dòng)子(穆雷(Murai)等人,科學(xué)23:476-482(1983)和森古普塔-格帕蘭(Sengupta-Gopalan)等人,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊82:3320-3324(1985))；葉子特異性和光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如來(lái)自cab或核酮糖二磷酸羧化酶的啟動(dòng)子(辛普森(Simpson)等人,歐洲分子生物學(xué)雜志4(11):2723-2729(1985)和蒂姆科(Timko)等人,自然318:579-582(1985))；花藥特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自LAT52的啟動(dòng)子(特維爾(Twell)等人,分子基因遺傳學(xué)217:240-245(1989))；花粉特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自Zm13的啟動(dòng)子(格雷羅(Guerrero)等人,分子基因遺傳學(xué)244:161-168(1993))或小孢子優(yōu)選啟動(dòng)子，如來(lái)自apg的啟動(dòng)子(特維爾等人,有性植物繁殖(Sex.PlantReprod.)6:217-224(1993))。用于使蛋白質(zhì)靶向亞細(xì)胞隔室的信號(hào)序列借助于使編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作地連接于編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的基因的5'和/或3'區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)將由轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)傳遞到亞細(xì)胞隔室(如葉綠體、液泡、過(guò)氧化體、乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞壁或線粒體)或分泌到非原質(zhì)體(apoplast)中?？稍诘鞍踪|(zhì)合成和處理期間測(cè)定結(jié)構(gòu)基因的5'和/或3'端的靶向序列，其中最終分隔經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)。存在信號(hào)序列可將多肽引導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或亞細(xì)胞隔室或分泌到非原質(zhì)體中。許多信號(hào)序列是所屬領(lǐng)域中已知的。參見(jiàn)例如貝克爾(Becker)等人,植物分子生物學(xué)20:49(1992)；克羅斯(Close,P.S.),碩士論文(Master'sThesis),愛(ài)荷華州立大學(xué)(IowaStateUniversity)(1993)；克諾克斯(Knox,C.)等人,植物分子生物學(xué)9:3-17(1987)；萊內(nèi)爾(Lerner)等人,植物生理學(xué)91:124-129(1989)；方特斯(Frontes)等人，植物細(xì)胞3:483-496(1991)；松岡(Matsuoka)等人,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊88:834(1991)；古爾德(Gould)等人,細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)108:1657(1989)；克里森(Creissen)等人,植物雜志(PlantJ.)2:129(1991)；卡爾德隆(Kalderon)等人,細(xì)胞(Cell)39:499-509(1984)；斯特非爾(Steifel)等人,植物細(xì)胞2:785-793(1990)。外來(lái)蛋白質(zhì)基因和農(nóng)藝基因在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物情況下，可產(chǎn)生市售量的外來(lái)蛋白質(zhì)。因此，用于經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物的選擇和繁殖的技術(shù)(其在所屬領(lǐng)域中良好理解)產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，其以常規(guī)方式收集，并且接著可從相關(guān)組織或整個(gè)生物提取外來(lái)蛋白質(zhì)。從植物生物的蛋白質(zhì)提取可通過(guò)已知方法實(shí)現(xiàn)，其由例如亨利(Heney)和奧爾(Orr),分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)114:92-6(1981)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，提供用于外來(lái)蛋白質(zhì)的商業(yè)制備的轉(zhuǎn)基因植物是馬鈴薯植物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，相關(guān)生物是種子或塊莖。對(duì)于展示較高表達(dá)量的相對(duì)較少數(shù)目的轉(zhuǎn)基因植物，可產(chǎn)生基因圖，主要通過(guò)常規(guī)RFLP、PCR和SSR分析，其鑒別所整合的DNA分子的大致染色體位置。對(duì)于這方面的例示性方法，參見(jiàn)格里克(Glick)和湯普森(Thompson),植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)CRC擠壓中的方法(MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnologyCRCPress),波卡拉頓(BocaRaton)269:284(1993)。關(guān)于染色體位置的圖信息適用于標(biāo)的轉(zhuǎn)基因植物的所有權(quán)保護(hù)。如果進(jìn)行未經(jīng)授權(quán)的繁殖并且與其它胚質(zhì)雜交，可比較整合區(qū)域的圖與可疑植物的類(lèi)似圖，以便測(cè)定可疑植物是否與標(biāo)的植物具有共同起源。圖比較將涉及雜交、RFLP、PCR、SSR和測(cè)序，其皆是常規(guī)技術(shù)。類(lèi)似地，借助于本發(fā)明，可在經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物中表達(dá)農(nóng)藝基因。更具體地說(shuō)，植物可經(jīng)基因工程改造以表達(dá)具有農(nóng)藝?yán)娴亩喾N表現(xiàn)型。與這方面有關(guān)的例示性基因包括(但不限于)以下分類(lèi)的基因：1.提供對(duì)害蟲(chóng)或疾病的抗性并且編碼以下各者的基因：A.植物疾病抗性基因。植物防御通常由植物中的疾病抗性基因(R)的產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)的無(wú)毒性(Avr)基因的產(chǎn)物之間的特異性相互相用活化。植物種類(lèi)可用克隆的抗性基因轉(zhuǎn)型以工程改造對(duì)特定病原體菌株具有抗性的植物。參見(jiàn)例如瓊斯等人,科學(xué)266:789(1994)(用于對(duì)黃枝孢霉(Cladosporiumfulvum)的抗性的番茄Cf-9基因的克隆)；馬丁(Martin)等人,科學(xué)262:1432(1993)(用于對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病(Pseudomonassyringaepv.tomato)的抗性的番茄Pto基因編碼蛋白質(zhì)激酶)；米德諾斯(Mindrinos)等人,細(xì)胞78:1089(1994)(用于對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性的芥菜屬RSP2基因)。B.提供對(duì)害蟲(chóng)(如大豆異皮線蟲(chóng)(soybeancystnematode))的抗性的基因。參見(jiàn)例如PCT申請(qǐng)案WO96/30517；PCT申請(qǐng)案WO93/19181。C.蘇力菌(Bacillusthuringiensis)蛋白質(zhì)，其衍生物或其模型化合成多肽。參見(jiàn)例如蓋澤(Geiser)等人,基因(Gene)48:109(1986)，其披露Btδ-內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼δ-內(nèi)毒素基因的DNA分子可從弗吉尼亞州馬納薩斯的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia)購(gòu)買(mǎi)，例如以ATCC寄存編號(hào)40098、67136、31995和31998。D.凝集素。參見(jiàn)例如范達(dá)美(VanDamme)等人,植物分子生物學(xué)(PlantMolec.Biol.)24:25(1994)，其披露若干君子蘭(Cliviaminiata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列。E.維生素結(jié)合蛋白質(zhì)，如抗生物素蛋白。參見(jiàn)PCT申請(qǐng)案US93/06487，其教示抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同系物作為針對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的殺幼蟲(chóng)劑的用途。F.酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見(jiàn)例如亞伯(Abe)等人,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)262:16793(1987)(大米半胱氨酸蛋白酶抑制劑的核苷酸序列)、胡伯(Huub)等人,植物分子生物學(xué)21:985(1993)(編碼煙草蛋白酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)、薩米塔尼(Sumitani)等人,生物科學(xué)生物技術(shù)生物化學(xué)(Biosci.Biotech.Biochem.)57:1243(1993)(海洋放線菌(Streptomycesnitrosporeus)α-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)和美國(guó)專(zhuān)利案第5,494,813號(hào)(希弗(Hepher)和阿特金森(Atkinson),1996年2月27日頒布)。G.昆蟲(chóng)特異性激素或信息素，如蛻皮類(lèi)固酸或保幼激素、其變異體、基于其的模擬劑或其拮抗劑或促效劑。參見(jiàn)例如哈姆莫克(Hammock)等人,自然344:458(1990)中關(guān)于經(jīng)克隆的保幼激素酯酶(一種保幼激素的失活劑)的桿狀病毒表達(dá)的公開(kāi)內(nèi)容。H.昆蟲(chóng)特異性肽或其神經(jīng)肽，其在表達(dá)時(shí)干擾受影響的害蟲(chóng)的生理機(jī)能。舉例來(lái)說(shuō)，參見(jiàn)里根(Regan),生物化學(xué)雜志269:9(1994)(表達(dá)克隆產(chǎn)生編碼昆蟲(chóng)利尿劑激素受體的DNA)和普拉特(Pratt)等人,生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)163:1243(1989)(在太平洋折翅蠊(Diplopterapuntata)中鑒別的抑咽側(cè)體神經(jīng)肽)的公開(kāi)內(nèi)容。還可以參見(jiàn)頒予托馬斯基(Tomalski)等人的美國(guó)專(zhuān)利案第5,266,317號(hào)，其公開(kāi)編碼昆蟲(chóng)特異性、麻痹性神經(jīng)毒素的基因。I.本質(zhì)上由蛇、黃蜂等產(chǎn)生的昆蟲(chóng)特異性毒液。例如參見(jiàn)潘(Pang)等，基因(Gene)116:165(1992)，關(guān)于編碼蝎昆蟲(chóng)毒性肽的基因在植物中的異源表達(dá)的公開(kāi)內(nèi)容。J.引起單萜、倍半萜、類(lèi)固醇、氧肟酸、苯丙素衍生物或另一種具有殺昆蟲(chóng)活性的非蛋白質(zhì)分子的超累積的酶。K.涉及生物學(xué)活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)中的酶；例如糖分解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、殼質(zhì)酶和葡聚糖酶，無(wú)論是天然的還是合成的。參見(jiàn)PCT申請(qǐng)案WO93/02197(斯科特(Scott)等人)，其披露了纖維二糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有殼質(zhì)酶編碼序列的DNA分子可以例如以寄存編號(hào)39637和67152從ATCC獲得。還可參見(jiàn)克拉默(Kramer)等人，昆蟲(chóng)生物化學(xué)分子生物學(xué)(InsectBiochem.Molec.Biol.)23:691(1993)(其教示了編碼煙草鉤蟲(chóng)殼質(zhì)酶的cDNA的核苷酸序列)和卡瓦尼克(Kawalleck)等人，植物分子生物學(xué)21:673(1993)(其提供歐芹ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列)。L.刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如參見(jiàn)博特拉(Botella)等人，植物分子生物學(xué)24:757(1994)(其關(guān)于綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA純系的核苷酸序列)和格里斯(Griess)等人，植物生理學(xué)104:1467(1994)(其提供了玉米鈣調(diào)蛋白cDNA純系的核苷酸序列)的公開(kāi)內(nèi)容。M.疏水性時(shí)刻肽。參見(jiàn)PCT申請(qǐng)案WO95/16776，其披露可抑制真菌植物病原體的鱟素的肽衍生物，和PCT申請(qǐng)案WO95/18855，其教示可提供疾病抗性的合成抗菌劑肽。N.膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑。例如參見(jiàn)杰恩斯(Jaynes)等人，植物科學(xué)(PlantSci.)89:43(1993)的公開(kāi)內(nèi)容，其關(guān)于異源表達(dá)殺菌肽-β-溶解肽類(lèi)似物以給予對(duì)茄假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植物。O.病毒侵襲性蛋白質(zhì)或由其衍生的復(fù)合毒素(complextoxin)。例如，病毒外殼蛋白質(zhì)在經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞中的積累賦予對(duì)由衍生外殼蛋白基因的病毒以及相關(guān)病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。參見(jiàn)比奇(Beachy)等人,植物病理學(xué)綜述(Ann.Rev.Phytopathol.)28:451(1990)。已經(jīng)對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物賦予針對(duì)苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白質(zhì)介導(dǎo)的抗性。P.由其衍生的昆蟲(chóng)特異性抗體或免疫毒素。因此，靶向昆蟲(chóng)腸中至關(guān)重要的代謝功能的抗體會(huì)使受影響的酶失活，殺死昆蟲(chóng)。參見(jiàn)泰勒(Taylor)等人,497號(hào)摘要,關(guān)于分子植物-微生物相互作用的第七次國(guó)際會(huì)議(SeventhInt'lSymposiumonMolecularPlant-MicrobeInteractions)(蘇格蘭愛(ài)丁堡(Edinburgh,Scotland)(1994))(在轉(zhuǎn)基因煙草中經(jīng)由單鏈抗體片段的產(chǎn)生進(jìn)行的酶促失活)。Q.病毒特異性抗體。參見(jiàn)例如特拉多奇(Tavladoraki)等人，自然366:469(1993)，其展示表達(dá)重組型抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物免于病毒攻擊。R.本質(zhì)上由病原體或寄生物產(chǎn)生的發(fā)育阻滯蛋白質(zhì)。因此，真菌內(nèi)-α-1，4-D-聚半乳糖醛酶通過(guò)使植物細(xì)胞壁同-α-1，4-D-半乳糖醛酶溶解來(lái)促進(jìn)真菌定殖和植物營(yíng)養(yǎng)物釋放。參見(jiàn)拉姆(Lamb)等人,生物技術(shù)(Bio/Technology)10:1436(1992)。圖巴特(Toubart)等人，植物雜志(PlantJ.)2:367(1992)描述了編碼豆內(nèi)聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白質(zhì)的基因的克隆和表征。S.本質(zhì)上由植物產(chǎn)生的發(fā)育阻滯蛋白質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，羅格曼(Logemann)等人，生物技術(shù)10:305(1992)證實(shí)表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的對(duì)真菌疾病的抗性。T.涉及系統(tǒng)性后天性抗性(SAR)反應(yīng)和/或發(fā)病機(jī)理相關(guān)基因的基因。布里格斯(Briggs),當(dāng)代生物學(xué)(S.CurrentBiology)5(2)(1995)。U.抗真菌基因。參見(jiàn)科內(nèi)利森(Cornelissen)和梅爾徹斯(Melchers),植物生理學(xué),101:709-712(1993)；帕里斯基(Parijs)等人,植物學(xué)(Planta)183:258-264(1991)和布什內(nèi)爾(Bushnell)等人,植物路徑的研究(Can.J.ofPlantPath)20(2):137-149(1998)。V.提供對(duì)疫病(Phytophthorablight)的抗性的基因，如R1、R2、R3、R4和其它抗性基因。參見(jiàn)奈斯(Naess,S.K.)等人,(2000)野生墨西哥土豆(Solanumbulbocastanum)中對(duì)晚疫病的抗性映射到染色體8.遺傳學(xué)理論應(yīng)用(Theor.Appl.Genet.)101:697-704和李(Li,X.)等人,(1998)使用常用AFLP標(biāo)記物的同源四倍體和基因映射：提供對(duì)致病疫霉的抗性的R2等位基因映射到馬鈴薯染色體4上。遺傳學(xué)理論應(yīng)用96:1121-1128。2.提供對(duì)除草劑的抗性的基因，例如：A.抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑，如咪唑啉酮或磺酰脲。這種類(lèi)別中的例示性基因編碼突變體ALS和AHAS，如例如分別由李(Lee)等人,歐洲分子生物學(xué)雜志7:1241(1988)和三木(Miki)等人,遺傳學(xué)理論應(yīng)用80:449(1990)描述。B.草甘膦(分別由突變體5-烯醇丙酮酰-3-磷酸合成酶(EPSP)和aroA基因減弱的抗性)和其它膦?；衔?如草銨膦(glufosinate)(草丁膦乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)PATbar基因)和吡啶氧(pyridinoxy)或苯氧丙酸和環(huán)己烷(cyclohexones)(ACC酶抑制劑編碼基因)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利案第4,940,835號(hào)，其披露了可提供草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。編碼突變型aroA基因的DNA分子可以按ATCC寄存編號(hào)39256獲得，而突變型基因的核苷酸序列披露于頒予科麥的美國(guó)專(zhuān)利案第4,769,061號(hào)中。頒予熊田(Kumada)等人的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)案第0333033號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利案第4,975,374號(hào)披露了提供對(duì)除草劑(如L-草丁膦)的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。頒予李曼斯(Leemans)等人的歐洲申請(qǐng)案第0242246號(hào)中提供PAT基因的核苷酸序列。迪格里夫(DeGreef)等人，生物技術(shù)7:61(1989)描述表達(dá)編碼草丁膦乙?；D(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。提供對(duì)苯氧基丙酸和環(huán)己烷(如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾靈(haloxyfop))的抗性的基因的例子是由馬歇爾(Marshall)等人，遺傳學(xué)理論應(yīng)用83:435(1992)描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc2-S3基因。C.抑制光合作用的除草劑，如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲腈(腈水解酶基因)。普茨比拉(Przibilla)等人，植物細(xì)胞(PlantCell)3:169(1991)描述用編碼突變型psbA基因的質(zhì)體轉(zhuǎn)型衣藻屬(Chlamydomonas)。用于腈水解酶基因的核苷酸序列披露于頒予斯德克的美國(guó)專(zhuān)利案第4,810,648號(hào)并且含有這些基因的DNA分子可按ATCC寄存編號(hào)53435、67441和67442獲得。海斯(Hayes)等人，生物化學(xué)雜志285:173(1992)描述編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)。D.已將乙酰羥酸合成酶引入多種植物中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)這種酶的植物對(duì)多種除草劑具有抗性。參見(jiàn)哈托利(Hattori)等人,分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)246:419,1995。其它提供對(duì)除草劑的耐受性的基因包括編碼大鼠細(xì)胞色素P4507A1的嵌合蛋白質(zhì)和酵母NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的基因(鹽田(Shiota)等人,植物生理學(xué),106:17,1994)、谷胱甘肽還原酶和超氧化歧化酶的基因(奧諾(Aono)等人,植物細(xì)胞生理學(xué)36:1687,1995)和多種磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(達(dá)塔(Datta)等人,植物分子生物學(xué)20:619,1992)。E.原卟啉原氧化酶(protox)是產(chǎn)生葉綠素所必需的，葉綠素是所有植物存活所必需的。原卟啉原氧化酶充當(dāng)多種除草化合物的目標(biāo)。這些除草劑還抑制所有存在的不同植物物種的生長(zhǎng)，引起其完全破壞。含有經(jīng)改變的原卟啉原氧化酶活性的對(duì)這些除草劑具有抗性的植物的產(chǎn)生描述于美國(guó)專(zhuān)利案第6,288,306號(hào)；第6,282,837號(hào)；第5,767,373號(hào)；以及國(guó)際公開(kāi)案WO01/12825中。3.提供或促進(jìn)附加值特性的基因，如：A.經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如通過(guò)用十八烷酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)型植物以增加植物的硬脂酸含量來(lái)進(jìn)行。參見(jiàn)克魯爾宗(Knultzon)等人,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊89:2625(1992)。B.降低的肌醇六磷酸含量，1)引入植酸酶編碼基因?qū)⒃鰪?qiáng)肌醇六磷酸的分解，為經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物增加更多的游離磷酸。舉例來(lái)說(shuō)，關(guān)于黑曲霉(Aspergillusniger)植酸酶基因的核苷酸序列的公開(kāi)內(nèi)容，參見(jiàn)范哈金斯特(VanHartingsveldt)等人,基因127:87(1993)。2)可引入可降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，舉例來(lái)說(shuō)，這可通過(guò)克隆并且接著再引入與可引起由低含量植酸表征的玉米突變的單個(gè)等位基因相關(guān)的DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)雷波伊(Raboy)等人,美迪卡(Maydica)35:383(1990)。C.經(jīng)修飾的碳水化合物組合物，其通過(guò)用編碼可改變淀粉的分支模式的酶的基因使植物轉(zhuǎn)型而實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)什羅扎(Shiroza)等人,細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)170:810(1988)(鏈球菌突變體果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)、施泰因梅茨(Steinmetz)等人,分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)20:220(1985)(枯草桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)、潘(Pen)等人,生物技術(shù)10:292(1992)(表達(dá)蘚楊芽胞桿菌(Bacilluslichenifonnis)α-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生)、艾略特(Elliot)等人,植物分子生物學(xué)21:515(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)、蘇加德等人,生物化學(xué)雜志268:22480(1993)(大麥α-淀粉酶基因的定點(diǎn)突變誘發(fā))和費(fèi)舍爾(Fisher)等人,植物生理學(xué)102:1045(1993)(玉米內(nèi)胚乳淀粉分支酶II)。D.通過(guò)FAD-2基因修飾增加油酸和/或通過(guò)FAD-3基因修飾減少亞麻酸。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第6,063,947號(hào)；第6,323,392號(hào)；和國(guó)際公開(kāi)案WO93/11245。4.控制雄性無(wú)菌性的基因A.在tapetum特異性啟動(dòng)子的控制下引入脫乙?；富虿⑶沂┯没瘜W(xué)N-Ac-PPT。參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)案WO01/29237。B.引入多種花蕊特異性啟動(dòng)子。參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)案WO92/13956和WO92/13957。C.引入芽胞桿菌RNA酶和芽胞桿菌RNA酶抑制劑基因。參見(jiàn)保羅(Paul)等人,植物分子生物學(xué)19:611-622,1992。用于馬鈴薯轉(zhuǎn)型的方法已研發(fā)許多用于植物轉(zhuǎn)型的方法，包括生物和生理植物轉(zhuǎn)型方案。參見(jiàn)例如三木等人,“用于將外來(lái)DNA引入植物的程序”,植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)中的方法,格里克(Glick,B.R.)和湯普森(Thompson,J.E.)編(CRC出版公司(CRCPress,Inc.),波卡拉頓(BocaRaton),1993),第67-88頁(yè)。此外，可使用用于植物的植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)型和再生的表達(dá)載體和活體外培養(yǎng)方法。參見(jiàn)例如格魯伯等人,“用于植物轉(zhuǎn)型的載體”,植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)中的方法,格里克和湯普森編(CRC出版公司,波卡拉頓,1993),第89-119頁(yè)。A.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)型作用，一種用于將表達(dá)載體引入植物中的方法是基于農(nóng)桿菌的天然轉(zhuǎn)型系統(tǒng)。參見(jiàn)例如霍施(Horsch)等人,科學(xué)227:1229(1985)。根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤細(xì)菌，其以遺傳方式轉(zhuǎn)型植物細(xì)胞。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ti和Ri質(zhì)體分別攜帶負(fù)責(zé)植物的基因轉(zhuǎn)型的基因。參見(jiàn)例如卡多(Kado,C.I.),植物科學(xué)重要綜述(Crit.Rev.PlantSci.)10:1(1991)。關(guān)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)和方法的說(shuō)明由格魯伯等人,見(jiàn)上文、三木等人,見(jiàn)上文和莫洛尼等人,植物細(xì)胞報(bào)告(PlantCellReports)8:238(1989)提供。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第5,563,055號(hào)(唐森德(Townsend)和托馬斯(Thomas)),1996年10月8日頒布。B.直接基因轉(zhuǎn)移，已研發(fā)統(tǒng)稱(chēng)為直接基因轉(zhuǎn)移的若干種植物轉(zhuǎn)型方法作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)型的替代方案。微粒子彈的植物表面的通常適用的方法測(cè)量1到4μm。用生物彈射擊裝置將表達(dá)載體引入植物組織，所述生物彈射擊裝置促進(jìn)微粒子彈的速度達(dá)到300到600m/s，其足以滲透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。桑福德(Sanford)等人,科學(xué)技術(shù)部分(Part.Sci.Technol.)5:27(1987)；桑福德(Sanford,J.C.)趨勢(shì)生物技術(shù)(TrendsBiotech)6:299(1988)；克萊因(Klein)等人,生物技術(shù)6:559-563(1988)；桑福德植物生理學(xué)7:206(1990)；克萊因等人,生物技術(shù)10:268(1992)。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第5,015,580號(hào)(赫里斯圖(Christou)等人),1991年5月14日頒布和美國(guó)專(zhuān)利案第5,322,783號(hào)(托姆斯(Tomes)等人),1994年6月21日頒布。另一用于將DNA物理傳遞到植物中的方法是目標(biāo)細(xì)胞的超聲波處理。張(Zhang)等人,生物技術(shù)9:996(1991)。或者，已使用脂質(zhì)體和球形質(zhì)體融合物將表達(dá)載體引入植物。德賽(Deshayes)等人,歐洲分子生物學(xué)雜志4:2731(1985)；赫里斯圖等人,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊84:3962(1987)。還報(bào)導(dǎo)使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鳥(niǎo)氨酸將DNA直接捕捉到原生質(zhì)體中。哈因(Hain)等人,分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)199:161(1985)和德雷珀(Draper)等人,植物細(xì)胞生理學(xué)23:451(1982)。還描述原生質(zhì)體以及完全全細(xì)胞和組織的電穿孔。唐(Donn)等人,植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)物的第七次國(guó)際會(huì)議的摘要(IAPTC),A2-38,第53頁(yè)(1990)；德哈因(D'Halluin)等人,植物細(xì)胞4:1495-1505(1992)和斯潘塞(Spencer)等人,植物分子生物學(xué)24:51-61(1994)。在馬鈴薯目標(biāo)組織的轉(zhuǎn)型作用之后，上述可選標(biāo)記基因的表達(dá)允許優(yōu)先選擇經(jīng)轉(zhuǎn)型的細(xì)胞、組織和/或植物，使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的再生和選擇方法。前述用于轉(zhuǎn)型作用的方法將典型地用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種類(lèi)。轉(zhuǎn)基因種類(lèi)可接著與另一種(未經(jīng)轉(zhuǎn)型或經(jīng)轉(zhuǎn)型)種類(lèi)雜交以產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)基因種類(lèi)?；蛘撸咽褂们笆鲛D(zhuǎn)型技術(shù)工程改造成特定馬鈴薯品系的基因特性可使用植物育種技術(shù)中眾所周知的傳統(tǒng)的回交技術(shù)移動(dòng)到另一品系中。舉例來(lái)說(shuō)，回交方法可用于使經(jīng)工程改造的特性從公共、非精華種類(lèi)移動(dòng)到精華種類(lèi)中，或從在基因體中含有外來(lái)基因的種類(lèi)移動(dòng)到不含有所述基因的種類(lèi)。如本文中所使用，視情形而定，“雜交”可指簡(jiǎn)單的X與Y雜交或回交過(guò)程。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，當(dāng)在本發(fā)明的情形中使用術(shù)語(yǔ)馬鈴薯植物時(shí)，這也包括保留W8的基本區(qū)別性特征的衍生物種類(lèi)，如所述種類(lèi)的基因轉(zhuǎn)化植物或其中合并有一或多個(gè)附加值基因(如除草劑或害蟲(chóng)抗性)的轉(zhuǎn)基因衍生物?；亟环椒膳c本發(fā)明一起使用以改良特征或?qū)⑻卣饕胨龇N類(lèi)中。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“回交”指雜交后代再與再現(xiàn)親本重復(fù)雜交1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次。有助于一或多種所需特征的基因的親本馬鈴薯植物稱(chēng)為非再現(xiàn)或供體親本。這一術(shù)語(yǔ)指非再現(xiàn)親本在回交方案中使用一次并且因此不再現(xiàn)的事實(shí)。接受來(lái)自非再現(xiàn)親本的基因轉(zhuǎn)移的親本馬鈴薯植物稱(chēng)為再現(xiàn)性親本，因?yàn)槠湓诨亟环桨钢杏糜谌舾奢喆?。在典型回交方案中，相關(guān)原始種類(lèi)(再現(xiàn)性親本)與攜帶待轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因的第二種類(lèi)(非再現(xiàn)親本)雜交。來(lái)自這一雜交的所得后代接著再與再現(xiàn)性親本雜交并且重復(fù)所述過(guò)程直到獲得其中再現(xiàn)性親本的實(shí)質(zhì)上所有所需形態(tài)和生理學(xué)特征在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中恢復(fù)的馬鈴薯植物(除從非再現(xiàn)親本轉(zhuǎn)移的一或多種基因以外)。對(duì)于成功回交程序，適合的再現(xiàn)性親本的選擇是重要步驟?；亟环桨傅哪繕?biāo)是改變或取代原始種類(lèi)中的一或多種特性或特征。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，用來(lái)自非再現(xiàn)親本的所需基因修飾、取代或補(bǔ)充再現(xiàn)性種類(lèi)的一或多種基因，同時(shí)保留實(shí)質(zhì)上所有其余所需基因，并且因此保留原始種類(lèi)的所需生理學(xué)和形態(tài)構(gòu)造。特定非再現(xiàn)親本的選擇將取決于回交的目的。一個(gè)主要目的是為植物添加一些商業(yè)上合乎需要、農(nóng)藝學(xué)上重要的特性。確切回交方案將取決于經(jīng)改變或添加以測(cè)定適合的測(cè)試方案的特征或特性。盡管回交方法在所轉(zhuǎn)移的特征是顯性等位基因時(shí)簡(jiǎn)化，但也可以轉(zhuǎn)移隱性等位基因。在這種情況下，可能需要引入后代的測(cè)試以測(cè)定是否已成功地轉(zhuǎn)移所需特征。類(lèi)似地，可使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的多種現(xiàn)有重組方法中的任一種將轉(zhuǎn)基因引入植物，如：格里希爾(Gressel),1985,提供農(nóng)作物中的除草劑抗性的生物技術(shù)：當(dāng)前現(xiàn)實(shí)(BiotechnologicallyConferringHerbicideResistanceinCrops:ThePresentRealities),植物基因體的分子形成和功能(MolecularFormandFunctionofthePlantGenome),范沃登-道亭(L.vanVloten-Doting)(編),紐約普雷納姆出版社(PlenumPress,NewYork)；赫特納(Huttner,S.L.)等人,1992,遺傳修飾植物的修正監(jiān)管(RevisingOversightofGeneticallyModifiedPlants),生物技術(shù)；克里(Klee,H.)等人,1989,植物基因載體和基因轉(zhuǎn)型作用：基于植物的根癌農(nóng)桿菌、細(xì)胞培養(yǎng)物和體細(xì)胞遺傳的使用的植物轉(zhuǎn)型系統(tǒng)(PlantGeneVectorsandGeneticTransformation:PlantTransformationSystemsBasedontheuseofAgrobacteriumtumefaciens,CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants)；孔茨(Koncz,C.)等人,1986,TL-DNA基因5的啟動(dòng)子控制由新型農(nóng)桿菌雙運(yùn)載體攜帶的嵌合基因的組織特異性表達(dá)(ThePromoterofTL-DNAGene5ControlstheTissue-SpecificExpressionofChimericGenesCarriedbyaNovelTypeofAgrobacteriumBinaryVector)；分子和普通遺傳學(xué)(MolecularandGeneralGenetics)；勞森(Lawson,C.)等人,1990,市售馬鈴薯栽培品種中對(duì)混合病毒感染的工程改造抗性：轉(zhuǎn)基因褐色布爾班克中對(duì)馬鈴薯病毒X和馬鈴薯病毒Y的抗性(EngineeringResistancetoMixedVirusInfectioninaCommercialPotatoCultivar:ResistancetoPotatoVirusXandPotatoVirusYinTransgenic褐色布爾班克),生物技術(shù)；米茨基(Mitsky,T.A.)等人,1996,針對(duì)PLRV感染的植物抗性，美國(guó)專(zhuān)利案第5,510,253號(hào)；紐厄爾(Newell,C.A.)等人,1991,馬鈴薯褐色布爾班克的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)型作用(Agrobacterium-MediatedTransformationofSolanumtuberosumL.Cv.褐色布爾班克),植物細(xì)胞報(bào)告(PlantCellReports)；佩爾拉克(Perlak,F.J.)等人,1993,遺傳改良馬鈴薯：避免科羅拉多馬鈴薯甲蟲(chóng)的損害(ProtectionfromDamagebyColoradoPotatoBeetles),植物分子生物學(xué)(PlantMolecularBiology)；其皆以引用的方式并入本文中以用于這一目的。已經(jīng)鑒別不在新種類(lèi)的生產(chǎn)中固定選擇的許多特性，但其可通過(guò)回交和遺傳工程改造技術(shù)改良。這些特性可以是或可以不是轉(zhuǎn)基因；這些特性的實(shí)例包括(但不限于)：除草劑抗性；對(duì)細(xì)菌、真菌或病毒疾病的抗性；昆蟲(chóng)抗性；淀粉和其它碳水化合物的濃度的均勻性或增加；營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量增強(qiáng)；塊莖損壞趨勢(shì)降低；以及淀粉轉(zhuǎn)化成糖的轉(zhuǎn)化率降低。這些基因通常通過(guò)細(xì)胞核遺傳。這些特性中的若干種描述于美國(guó)專(zhuān)利案第5,500,365號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,387,756號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,789,657號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,503,999號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,589,612號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,510,253號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,304,730號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,382,429號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,503,999號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,648,249號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,312,912號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,498,533號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,276,268號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第4,900,676號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,633,434號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利案第4,970,168號(hào)中。寄存信息已由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(弗吉尼亞州馬納薩斯10801大學(xué)大道(10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia))20110進(jìn)行上文披露和所附權(quán)利要求書(shū)中所述的杰.爾.辛普洛公司(J.R.SimplotCompany)所有權(quán)POTATOCULTIVARW8的塊莖寄存。寄存日期是2014年3月11日。在本申請(qǐng)案的申請(qǐng)日之前，從由杰.爾.辛普洛公司保存的相同寄存物獲得25個(gè)微管小瓶的寄存物。當(dāng)授予專(zhuān)利權(quán)時(shí)，所有限制將不可撤銷(xiāo)地移除，并且寄存物意圖符合37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求。ATCC寄存編號(hào)是PTA-121079。寄存物將在最后一次請(qǐng)求之后保存在保藏中心三十年或五年時(shí)間或?qū)＠麢?quán)的強(qiáng)制壽命(無(wú)論哪個(gè)更長(zhǎng))，并且將在所述周期期間視需要更換。盡管上文已討論許多例示性方面和實(shí)施例，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將識(shí)別某些修改、置換、添加和其子組合。因此，預(yù)期以下所附權(quán)利要求書(shū)以及下文引入的權(quán)利要求書(shū)解釋為包括在它們的真實(shí)精神和范疇內(nèi)的所有這類(lèi)修改、置換、添加和子組合。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3