一種蠟狀芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明從福建省廈門市海滄、同安等港口淡海水交界處的水樣及污泥樣中分離并篩選得到具有很好生物防治作用的菌株，該菌株為蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1（ Bacilluscereus ），于2014年08月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CCGMCCNo:9547；并利用該蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1（ Bacilluscereus ）制備對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中多種病原菌均有較好的抑菌、防治效果的海洋源殺菌劑，且該海洋源殺菌劑使用過程對(duì)環(huán)境友好，無農(nóng)藥殘留及污染問題，同時(shí)不存在對(duì)病原菌產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。
CGMCC No.9547
2014.08.25
【專利說明】一種蠟狀芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物菌株及其應(yīng)用，尤其涉及一種蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1及應(yīng)用其制備用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害防治的殺菌劑。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，尤其是高密度養(yǎng)殖，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的防治往往是決定經(jīng)濟(jì)收益的一個(gè)重要因素。如今養(yǎng)殖戶的病害防治方法主要是通過使用抗生素進(jìn)行防治，其效果雖好卻也帶來了抗生素殘留的問題，且隨著抗生素的使用，水產(chǎn)病原菌的抗藥性亦隨之增強(qiáng)，加之人們對(duì)飲食健康的重視，農(nóng)業(yè)部出臺(tái)相關(guān)政策使得抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用將逐步被替代。
[0003]目前世界上普遍認(rèn)為生物防治可能是解決水產(chǎn)養(yǎng)殖病害較為行之有效的途徑之一，但國(guó)內(nèi)外還暫未發(fā)現(xiàn)專門防水產(chǎn)養(yǎng)殖中各種病害的生物殺菌藥劑，所以，本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切需要有效防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的新的微生物菌劑和方法的出現(xiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1 {BacillusCerew1S),該臘狀芽孢桿菌菌株K2-1于2014年08月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCCNo:9547，且采用該菌株制備一種能夠有效防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的海洋源殺菌劑。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:
本實(shí)驗(yàn)室從福建省廈門市海滄、同安等港口淡海水交界處的水樣及污泥樣中分離并篩選得到具有很好生物防治作用的菌株，并采用16s rDNA法對(duì)該菌株進(jìn)行測(cè)序分析，最終鑒定其為蠟狀芽孢桿菌的一個(gè)菌株。
[0006]進(jìn)一步地，采用該菌株制備一種防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害的海洋源殺菌劑，其制備的具體步驟為:
(1)所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1的活化:取所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1并將其接種至斜面SLB培養(yǎng)基，且于30-40°C下培養(yǎng)12-48h ;用接種環(huán)將斜面培養(yǎng)后的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基上，并于30-4(TC、150-200rpm條件下活化培養(yǎng)5_10h ；
(2)發(fā)酵液的制備:將步驟(I)活化好的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)接種量1_10%，攪拌速率150-200 rpm，溫度設(shè)定為30_40°C ;發(fā)酵培養(yǎng)8_30h則獲得所需的發(fā)酵液；
(3)取步驟(2)所得的發(fā)酵液進(jìn)行8000-1OOOOrpm離心5-10min，之后將離心所得的上清液進(jìn)行水浴，水浴溫度70-80°C、水浴時(shí)間10-20min，得到不含菌體的發(fā)酵上清液，備用；
(4)發(fā)酵液色譜分離:將步驟(3)所得的發(fā)酵上清液進(jìn)行柱層析分離，使用層析柱填充為S印hadex G-50,洗脫液為H2O,收集時(shí)間為40_90min，上樣量為柱體積1°/Γ5%，流速0.5?lmL/min ； (5)殺菌劑成品:將步驟(4)收集到的收集液通過活性炭去色素，之后進(jìn)行分裝包裝即可得所述海洋源殺菌劑的成品。
[0007]進(jìn)一步地，所述LB培養(yǎng)基的組分均為:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 1g7H2O 1000mL ;所述SLB培養(yǎng)基的組分為:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂15g，H2O 1000 mL。
[0008]本發(fā)明的有益效果在于:
提供一種蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1 {Bacillus cerem)，并利用該蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1 {Bacillus cereus)制備對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中多種病原菌均有較好的抑菌、防治效果的海洋源殺菌劑，且該海洋源殺菌劑使用過程對(duì)環(huán)境友好，無農(nóng)藥殘留及污染問題，同時(shí)不存在對(duì)病原菌產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

【具體實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明一種蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1是從福建省廈門市海滄、同安等港口淡海水交界處的水樣及污泥樣中分離并篩選得到具有很好生物防治作用的菌株，并采用16s rDNA法對(duì)該菌株進(jìn)行測(cè)序分析，最終鑒定其為蠟狀芽孢桿菌的一個(gè)菌株。
[0010]1.菌株的分離:
(I)初篩:取1g海淡排污口出污泥樣品，并加至10mL 0.85%NaCl中，攪拌后取上層濁液置于LB培養(yǎng)基，且于37°C、180rpm下富集培養(yǎng)，富集培養(yǎng)30h后，將菌液置于75°C水浴20min，水浴后的菌液進(jìn)行梯度稀釋及平板涂布法進(jìn)行分離操作，之后挑取LB平板上長(zhǎng)起的不同菌落形態(tài)的芽孢桿菌，保存?zhèn)溆谩?br> [0011](2)復(fù)篩:分別挑取步驟(I)初篩中得到的芽孢桿菌并置于LB培養(yǎng)基中，于37°C、180rpm培養(yǎng)24h,之后1000rpm下離心6min,得發(fā)酵上清液備用；使用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定各發(fā)酵上清液的抑菌活性:以水產(chǎn)致病菌溶藻弧菌為指示菌制備抑菌板，用牛津杯大小的打孔器打孔后，每孔各加50uL發(fā)酵上清液，接著置于37°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)8h，之后測(cè)量比較其抑菌圈直徑，進(jìn)而篩選出對(duì)該病原菌抑菌效果最好的菌株，將該菌株標(biāo)記為菌株K2-1。
[0012]2.菌株的鑒定:
將篩選所得菌株K2-1接種至LB固體培養(yǎng)基，于37°C下培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并做部分生理生化特性的測(cè)定，結(jié)果如下:菌落白色，表面粗糙，不透明，革蘭氏陽性，產(chǎn)芽孢，葡萄糖發(fā)酵陽性，水解淀粉陽性。同時(shí)對(duì)該菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)定，得其16s rDNA序列如SEQ IDNO:1所示。
[0013]將測(cè)得的16s rDNA序列輸入NCBI進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)其相似度最高的為蠟狀芽孢桿菌QkiciIIus cereus);則結(jié)合生理生化測(cè)定結(jié)果及16s rDNA序列數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果，確定該菌株為臘狀芽孢桿菌iBacillus cereus)?
[0014]3.一種防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害的海洋源殺菌劑，其制備的具體步驟為:
(1)所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1的活化:取所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1并將其接種至斜面SLB培養(yǎng)基，且于30-40°C下培養(yǎng)12-48h ;用接種環(huán)將斜面培養(yǎng)后的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基上，并于30-40°C、150-200rpm條件下活化培養(yǎng)5_10h ；
(2)發(fā)酵液的制備:將步驟(I)活化好的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)接種量1_10%，攪拌速率150-200 rpm，溫度設(shè)定為30_40°C ;發(fā)酵培養(yǎng)8_30h則獲得所需的發(fā)酵液； (3)去菌體取步驟(2)所得的發(fā)酵液進(jìn)行8000-1OOOOrpm離心5_10min，之后將離心所得的上清液進(jìn)行水浴，水浴溫度70-80°C、水浴時(shí)間10-20min，得到不含菌體的發(fā)酵上清液，備用；
(4)發(fā)酵液色譜分離:將步驟(3)所得的發(fā)酵上清液進(jìn)行柱層析分離，使用層析柱填充為S印hadex G-50,洗脫液為H2O,收集時(shí)間為40_90min，上樣量為柱體積1°/Γ5%，流速0.5?lmL/min ；
(5)殺菌劑成品:將步驟(4)收集到的收集液通過活性炭去色素，之后進(jìn)行分裝包裝即可得所述海洋源殺菌劑的成品。
[0015]需要說明的是，本發(fā)明海洋源殺菌劑制備過程中進(jìn)行發(fā)酵液色譜分離時(shí)，由開始加洗脫液洗脫起計(jì)時(shí)，0-40min的流出液為無效果的流出液，40_90min的流出液為有殺菌效果的產(chǎn)品液即本發(fā)明所需收集的收集液，90min后流出液亦是無效的流出液。
[0016]另外，本發(fā)明中所涉及到的:LB培養(yǎng)基的組分均為:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g, H2O 1000 mL ;固體LB培養(yǎng)基、SLB培養(yǎng)基的組分均為:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，瓊脂 15g, H2O 1000 mL。
[0017]為了更好的對(duì)本發(fā)明中海洋源殺菌劑進(jìn)行進(jìn)一步闡述說明， 申請(qǐng)人:例舉了如下實(shí)施例。
[0018]實(shí)施例一
菌株K2-1的活化:取所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1并將其接種至斜面SLB培養(yǎng)基，且于30°C下培養(yǎng)12h ;用接種環(huán)將斜面培養(yǎng)后的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基上，并于30°C、150rpm條件下活化培養(yǎng)5h ；
發(fā)酵液的制備:將活化好的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)接種量1%，攪拌速率150 rpm，溫度設(shè)定為30°C ;發(fā)酵培養(yǎng)8h則獲得所需的發(fā)酵液；
去菌體:取獲得的發(fā)酵液進(jìn)行SOOOrpm離心5min，之后將離心所得的上清液進(jìn)行水浴，水浴溫度70°C、水浴時(shí)間lOmin，得到不含菌體的的發(fā)酵上清液；
發(fā)酵液色譜分離:將所得的發(fā)酵上清液進(jìn)行柱層析分離，使用層析柱填充為SephadexG-50，洗脫液為H2O,收集時(shí)間為40-90min，上樣量為柱體積1%，流速0.5mL/min ；
殺菌劑成品:將步驟收集到的收集液通過活性炭去色素，之后進(jìn)行分裝包裝即可得所述海洋源殺菌劑的成品。
[0019]實(shí)施例二
菌株K2-1的活化:取所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1并將其接種至斜面SLB培養(yǎng)基，且于35°C下培養(yǎng)15h ;用接種環(huán)將斜面培養(yǎng)后的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基上，并于35°C、170rpm條件下活化培養(yǎng)7h ；
發(fā)酵液的制備:將活化好的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)接種量5%，攪拌速率170 rpm，溫度設(shè)定為35°C ;發(fā)酵培養(yǎng)18h則獲得所需的發(fā)酵液；
去菌體:取獲得的發(fā)酵液進(jìn)行9000rpm離心8min，之后將離心所得的上清液進(jìn)行水浴，水浴溫度75°C、水浴時(shí)間15min，得到不含菌體的的發(fā)酵上清液；
發(fā)酵液色譜分離:將所得的發(fā)酵上清液進(jìn)行柱層析分離，使用層析柱填充為SephadexG-50，洗脫液為H2O,收集時(shí)間為40-90min，上樣量為柱體積3%，流速0.8mL/min ；
殺菌劑成品:將步驟收集到的收集液通過活性炭去色素，之后進(jìn)行分裝包裝即可得所述海洋源殺菌劑的成品。
[0020]實(shí)施例三
菌株K2-1的活化:取所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1并將其接種至斜面SLB培養(yǎng)基，且于40°C下培養(yǎng)48h ;用接種環(huán)將斜面培養(yǎng)后的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基上，并于40°C、200rpm條件下活化培養(yǎng)1h ；
發(fā)酵液的制備:將活化好的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)接種量10%，攪拌速率200 rpm，溫度設(shè)定為40°C ;發(fā)酵培養(yǎng)30h則獲得所需的發(fā)酵液；
去菌體:取獲得的發(fā)酵液進(jìn)行1000rpm離心lOmin，之后將離心所得的上清液進(jìn)行水浴，水浴溫度80°C、水浴時(shí)間20min，得到不含菌體的的發(fā)酵上清液；
發(fā)酵液色譜分離:將所得的發(fā)酵上清液進(jìn)行柱層析分離，使用層析柱填充為SephadexG-50，洗脫液為H2O,收集時(shí)間為40-90min，上樣量為柱體積5%，流速lmL/min ；
殺菌劑成品:將步驟收集到的收集液通過活性炭去色素，之后進(jìn)行分裝包裝即可得所述海洋源殺菌劑的成品。
[0021]4.對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害的防治試驗(yàn)
試驗(yàn)一:實(shí)施例一制備所得海洋源殺菌劑對(duì)受嗜水氣單胞菌侵害的青石斑魚的治療試驗(yàn)
(I)試驗(yàn)方法:采用創(chuàng)傷方法，用嗜水氣單胞菌對(duì)健康的青石斑魚進(jìn)行攻毒，使健康的青石斑魚發(fā)病，然后選擇12個(gè)實(shí)驗(yàn)桶，隨機(jī)分成4組(D1、D2、D3和CKl )，每組三個(gè)平行，將已發(fā)病的魚隨機(jī)放入實(shí)驗(yàn)桶，每桶放養(yǎng)30尾。使用實(shí)施例一制備所得海洋源殺菌劑對(duì)發(fā)病青石斑魚進(jìn)行治療:Dl組采用1ppm的濃度進(jìn)行潑灑,每天一次,連續(xù)3天；D2組采用5ppm的濃度進(jìn)行潑灑，每天一次，連續(xù)3天；D3組采用2.5ppm的濃度進(jìn)行潑灑，每天一次，連續(xù)3天；CK組不做處理。
[0022](2)試驗(yàn)結(jié)果:使用1ppm實(shí)施例一制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即Dl組青斑魚治愈率為46.6% ;使用5ppm實(shí)施例一制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即D2組青斑魚治愈率為33.3% ;使用2.5ppm實(shí)施例一制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即D3組青斑魚治愈率為23.3% ;未使用實(shí)施例一制備所得海洋源殺菌劑的的空白對(duì)照組即CKl組青斑魚治愈率為0%。
[0023]試驗(yàn)二:實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑對(duì)受嗜水氣單胞菌侵害的青石斑魚的治療試驗(yàn)
(O試驗(yàn)方法:采用創(chuàng)傷方法，用嗜水氣單胞菌對(duì)健康的青石斑魚進(jìn)行攻毒，使健康的青石斑魚發(fā)病，然后選擇12個(gè)實(shí)驗(yàn)桶，隨機(jī)分成4組(A1、A2、A3和CK2)，每組三個(gè)平行，將已發(fā)病的魚隨機(jī)放入實(shí)驗(yàn)桶，每桶放養(yǎng)30尾。使用實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑對(duì)發(fā)病青石斑魚進(jìn)行治療:A1采用1ppm的濃度進(jìn)行潑灑,每天一次,連續(xù)3天；A2組采用5ppm的濃度進(jìn)行潑灑，每天一次，連續(xù)3天；A3組采用2.5ppm的濃度進(jìn)行潑灑，每天一次，連續(xù)3天；CK2組不做處理。
[0024](2)試驗(yàn)結(jié)果:使用1ppm實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即Al組青斑魚治愈率為66.6% ;使用5ppm實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即A2組青斑魚治愈率為56.6% ;使用2.5ppm實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即A3組青斑魚治愈率為43.3% ;未使用實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑的空白對(duì)照組即CK2組青斑魚治愈率為0%。
[0025]試驗(yàn)三:實(shí)施例三制備所得海洋源殺菌劑對(duì)受嗜水氣單胞菌侵害的青石斑魚的治療試驗(yàn)
(O試驗(yàn)方法:采用創(chuàng)傷方法，用嗜水氣單胞菌對(duì)健康的青石斑魚進(jìn)行攻毒，使健康的青石斑魚發(fā)病，然后選擇12個(gè)實(shí)驗(yàn)桶，隨機(jī)分成4組(B1、B 2、B 3和CK3)，每組三個(gè)平行，將已發(fā)病的魚隨機(jī)放入實(shí)驗(yàn)桶，每桶放養(yǎng)30尾。使用實(shí)施例三制備所得海洋源殺菌劑對(duì)發(fā)病青石斑魚進(jìn)行治療:B1組采用1ppm的濃度進(jìn)行潑灑，每天一次，連續(xù)3天；B2組采用5ppm的濃度進(jìn)行潑灑,每天一次,連續(xù)3天；B3組采用2.5ppm的濃度進(jìn)行潑灑,每天一次，連續(xù)3天；CK3組不做處理。
[0026](2)試驗(yàn)結(jié)果:使用1ppm實(shí)施例三制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即BI組青斑魚治愈率為60% ;使用5ppm實(shí)施例三制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即BI組青斑魚治愈率為53.3% ;使用2.5ppm實(shí)施例三制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即BI組青斑魚治愈率為36.6% ;未使用實(shí)施例三制備所得海洋源殺菌劑的空白對(duì)照組即CK3組青斑魚治愈率為0%。
[0027]試驗(yàn)四:實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑對(duì)受嗜水氣單胞菌侵害的青石斑魚的治療試驗(yàn)
(I)試驗(yàn)方法:采用創(chuàng)傷方法，用溶藻弧菌對(duì)健康的青石斑魚進(jìn)行攻毒，使健康的青石斑魚發(fā)病，然后選擇12個(gè)實(shí)驗(yàn)桶，隨機(jī)分成4組(C1、C2、C3和CK4)，每組三個(gè)平行，將已發(fā)病的魚隨機(jī)放入實(shí)驗(yàn)桶，每桶放養(yǎng)30尾。使用實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑對(duì)發(fā)病青石斑魚進(jìn)行治療:C1組采用1ppm的濃度進(jìn)行潑灑,每天一次,連續(xù)3天；C2組采用5ppm的濃度進(jìn)行潑灑，每天一次，連續(xù)3天；C3組采用2.5ppm的濃度進(jìn)行潑灑，每天一次，連續(xù)3天；CK4組不做處理。
[0028](2)試驗(yàn)結(jié)果:使用1ppm實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即Cl組青斑魚治愈率為56.6% ;使用5ppm實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即C2組青斑魚治愈率為46.6% ;使用2.5ppm實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑的實(shí)驗(yàn)組即C3組青斑魚治愈率為33.3% ;未使用實(shí)施例二制備所得海洋源殺菌劑的空白對(duì)照組即CK4組青斑魚治愈率為0%。
[0029]綜上可知，本發(fā)明利用蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1 {Bacillus cereus K2_l)制備所得的海洋源殺菌劑，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中多種病原菌(如溶藻弧菌、嗜水氣單胞、副溶血弧菌、愛德華氏菌，哈維氏弧菌等)均有較好的抑菌、防治效果；且使用過程對(duì)環(huán)境友好，無農(nóng)藥殘留及污染問題，同時(shí)不存在對(duì)病原菌產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種蠟狀芽孢桿菌菌株，其特征在于:所述菌株為蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1{Bacillus cereus),于2014年08月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CCGMCC No: 9547。
2.一種防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害的海洋源殺菌劑，其特征在于:其制備方法的具體步驟為: (1)權(quán)利要求1中所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1的活化:取權(quán)利要求1中所述的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1并將其接種至斜面SLB培養(yǎng)基，且于30-40°C下培養(yǎng)12_48h ;用接種環(huán)將斜面培養(yǎng)后的蠟狀芽孢桿菌菌株K2-1接種至LB培養(yǎng)基上，并于30-40°C、150-200rpm條件下活化培養(yǎng)5-10h ; (2)發(fā)酵液的制備:將步驟(I)活化好的蠟狀芽孢桿菌K2-1接種至LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)接種量1_10%，攪拌速率150-200 rpm，溫度設(shè)定為30_40°C ;發(fā)酵培養(yǎng)8_30h則獲得所需的發(fā)酵液； (3)去菌體:取步驟(2)所得的發(fā)酵液進(jìn)行8000-1OOOOrpm離心5_10min，之后將離心所得的上清液進(jìn)行水浴，水浴溫度70-80°C、水浴時(shí)間10-20min，得到不含菌體的發(fā)酵上清液，備用； (4)發(fā)酵液色譜分離:將步驟(3)所得的發(fā)酵上清液進(jìn)行柱層析分離，使用層析柱填充為S印hadex G-50,洗脫液為H2O,收集時(shí)間為40_90min，上樣量為柱體積1%?5%，流速0.5?lmL/min ； (5)殺菌劑成品:將步驟(4)收集到的收集液通過活性炭去色素，之后進(jìn)行分裝包裝即可得所述海洋源殺菌劑的成品。
3.如權(quán)利要求2所述一種防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害的海洋源殺菌劑，其特征在于:所述LB培養(yǎng)基的組分均為:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g, H2O 1000 mL ;所述SLB培養(yǎng)基的組分為:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂15g，H20 1000 mL。
【文檔編號(hào)】A01N63/02GK104293707SQ201410500676
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】徐長(zhǎng)安, 方衛(wèi)東, 黃仕新, 唐旭, 劉源森, 林凌 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所