一種太空蠟狀芽孢桿菌株lct-bc25的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種空間菌株蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，更具體的說(shuō)是一種太空微生物，運(yùn)用空間技術(shù)獲得。其特征：蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25是一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，具有芽孢，對(duì)阿米卡星的耐藥性出現(xiàn)了增強(qiáng)。在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)層面對(duì)其進(jìn)行詳盡闡明，證實(shí)LCT-BC25的全基因組序列總長(zhǎng)度為5,154,512bp，具有5,263個(gè)編碼基因；有310個(gè)上調(diào)基因和996個(gè)下調(diào)基因，并證實(shí)這些基因的生物學(xué)功能主要與細(xì)胞生長(zhǎng)和修復(fù)的生理學(xué)過(guò)程有關(guān)；有57個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白和77個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白，并證實(shí)差異表達(dá)蛋白的功能主要是與糖類(lèi)代謝脂類(lèi)代謝和氨基酸代謝相關(guān)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種太空蠟狀芽孢桿菌株LCT-BC25
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種新的微生物菌株蠟狀芽孢桿菌 LCT-BC25以及其生物學(xué)特性、基因組DNA序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和差異蛋白組學(xué)分析，獲得其在基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組的特性。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類(lèi)空間探索活動(dòng)的日益頻繁，宇宙空間成為了人類(lèi)活動(dòng)的一個(gè)重要領(lǐng)域。 微生物是自然環(huán)境中的一部分，其存在于空氣、水、土壤等生物圈的各個(gè)部分。人類(lèi)的空間活動(dòng)不可避免的將微生物帶上了宇宙空間。盡管外層空間具有極端和復(fù)雜的環(huán)境，這些微生物都能夠適應(yīng)這些諸如微重力、宇宙射線(xiàn)、溫度、壓力等的改變并表現(xiàn)出相應(yīng)的形態(tài)和生理學(xué)的變化。尤其是有研究證實(shí)在模擬微重力條件下培養(yǎng)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)小鼠感染的毒力會(huì)增強(qiáng)；肺炎鏈球菌等機(jī)會(huì)致病菌在模擬微重力條件下毒力增強(qiáng)。目前，在空間站中已檢測(cè)出包括肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌和腸球菌等多種細(xì)菌。對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行深入研究有助于了解空間環(huán)境對(duì)這些細(xì)菌的影響極其致病力和耐藥性的改變機(jī)制，為載人航天提供醫(yī)學(xué)保障基礎(chǔ)。
[0003]蠟樣芽胞桿菌是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，好氧或兼性厭氧并能夠形成孢子。蠟狀芽孢桿菌是一種條件致病菌，其能夠產(chǎn)生相關(guān)導(dǎo)致嘔吐的毒素和三種不同的腸毒素，引起嘔吐綜合征和腹瀉病造成食物中毒，是一種潛在的會(huì)導(dǎo)致宇航員急性胃腸道疾病的重要致病菌。 尤其是空間飛行時(shí)，航天員所攜帶的食物大多 是由從地球出發(fā)前制作的罐頭食品，極容易受蠟狀芽孢桿菌污染。
[0004]既往針對(duì)蠟樣芽胞桿菌生物學(xué)特性及用途等研究均局限于地面，對(duì)空間環(huán)境下蠟樣芽胞桿菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種太空蠟狀芽孢桿菌菌株LCT-BC25。對(duì)空間菌株進(jìn)行表型檢測(cè)，然后對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)闡明該細(xì)菌的特性及用途。
[0006]本發(fā)明提供的菌株蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，其保藏號(hào)為CGMCCN0.6515。
[0007]所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，革蘭氏陽(yáng)性桿菌，具有芽孢，菌體單個(gè)或者成雙排列蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25對(duì)阿米卡星的耐藥性出現(xiàn)了明顯的增強(qiáng)。
[0008]所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，全基因組序列包含43個(gè)contigs，7個(gè) scaffolds，長(zhǎng)度為5，154，512bp，平均GC含量為35.31%，預(yù)測(cè)出5，263個(gè)編碼基因。
[0009]所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，轉(zhuǎn)錄組與對(duì)照組比較有310個(gè)上調(diào)基因和996個(gè)下調(diào)基因，并證實(shí)這些基因的生物學(xué)功能主要與細(xì)胞生長(zhǎng)和修復(fù)的生理學(xué)過(guò)程有關(guān)。
[0010]所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，轉(zhuǎn)錄組與對(duì)照組比較57個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白和77 個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白，并證實(shí)差異表達(dá)蛋白的功能主要是與糖類(lèi)代謝脂類(lèi)代謝和氨基酸代謝相關(guān)?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25的biolog生化特征
[0012]圖2蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25與地面對(duì)照株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)
[0013]圖3蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25的轉(zhuǎn)錄組基因覆蓋度統(tǒng)計(jì)
[0014]圖4蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因
[0015]圖5蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25的蛋白組差異表達(dá)蛋白
【具體實(shí)施方式】
[0016]下述實(shí)施實(shí)例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0017]下述實(shí)施實(shí)例中所用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0018]一、蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25的表型
[0019]1.菌種選擇:蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為 CGMCC N0.6515。
[0020]2.形態(tài)學(xué):原樣品進(jìn)行稀釋涂布，進(jìn)行革蘭氏染色。蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，具有芽孢，菌體單個(gè)或者成雙排列。
[0021]3.蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25菌株16s rDNA鑒定
[0022]16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長(zhǎng)約1.5kb。將已分純的單菌直接經(jīng)菌液PCR 擴(kuò)增16S rDNA，部分通過(guò)菌液PCR較難擴(kuò)增的單菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組后擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物序列如下:
[0023]SgF:AGAGTTTGATCATGGCTCAG
[0024]SgR: TAGGGTTACCTTGTTACGACTT
[0025]16S rDNA PCR產(chǎn)物用96孔mi I Ipore純化系統(tǒng)純化后準(zhǔn)確定量，經(jīng)AB13730xl全自動(dòng)序列分析儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測(cè)序結(jié)果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp(雙向測(cè)序)即用于同源性分析。所得 16S rDNA序列在Eztaxonserver2.1數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),確定菌株大致的分類(lèi)地位。所有單菌16S序列全部導(dǎo)入seqman,輸出single file (fasta)后，經(jīng)Mega5.0軟件clusterW多重比對(duì)，輸出 meg文件重新導(dǎo)入構(gòu)建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method 為 bootstrap 參數(shù)設(shè)置為 1000。16s rDNA 鑒定結(jié)果顯示 LCT-BC25 與 Bacillus cereus ATCC14579(T)的相似性為 99%。
[0026]4.耐藥性檢測(cè):配制菌懸液后稀釋涂布，粘貼藥敏片，選擇的抗生素為青霉素G、 氨芐青霉素、頭孢唑林、復(fù)達(dá)欣(頭孢他啶)(頭孢噻甲羧肟)、菌必治(頭孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、環(huán)丙沙星(奔克)(悉復(fù)歡)(丙氟哌酸)、潔霉素(林可霉素)、萬(wàn)古霉素、 復(fù)方新諾明、氯霉素、舒普深(先鋒必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、鏈霉素、美滿(mǎn)霉素 (二甲胺四環(huán)素)(米諾環(huán)素)、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。培養(yǎng)24h后觀(guān)察抑菌圈大小。結(jié)果證實(shí)與地面對(duì)照株相比較，蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25對(duì)阿米卡星的耐藥性出現(xiàn)了明顯的增強(qiáng)，其抑菌圖大小為1.3cm(地面為2.6cm)。
[0027]5.溶血試驗(yàn):采用點(diǎn)種法，將太空株和地面株點(diǎn)種于同一血瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)24小時(shí)后觀(guān)察結(jié)果顯示LCT-BC25無(wú)溶血圈出現(xiàn)。
[0028]6.生化代謝(Biolog)實(shí)驗(yàn):制備菌懸液，接種至Biolog96孔板，37°C培養(yǎng)24_48h 觀(guān)察結(jié)果(見(jiàn)圖1)。該菌株生化代謝較地面株差別較大如表1。
[0029]表1蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25的biolog生化特征
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種空間蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，其特征在于:保藏號(hào)為:CGMCCN0.6515。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，其特征在于:革蘭氏陽(yáng)性桿菌，具有芽孢，菌體單個(gè)或者成雙排列，蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25對(duì)阿米卡星的耐藥性出現(xiàn)了明顯的增強(qiáng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，其特征在于:LCT_BC25的全基因組序列總長(zhǎng)度為5，154，512bp，平均GC含量為35.31%,包含43個(gè)contigs, 7個(gè)scaffolds, 預(yù)測(cè)出5，263個(gè)編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，其特征在于:較對(duì)照組有310個(gè)上調(diào)基因和996個(gè)下調(diào)基因，并證實(shí)這些基因的生物學(xué)功能主要與細(xì)胞生長(zhǎng)和修復(fù)的生理學(xué)過(guò)程有關(guān)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25，其特征在于:較對(duì)照組有57個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白和77個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白，并證實(shí)差異表達(dá)蛋白的功能主要是與糖類(lèi)代謝脂類(lèi)代謝和氨基酸代謝相關(guān)。
【文檔編號(hào)】C12R1/085GK103555603SQ201210380073
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月26日
【發(fā)明者】劉長(zhǎng)庭, 蘇龍翔, 方向群, 王俊峰, 李天志, 郭英華, 常德, 王雅娟, 陳振鴻, 王立 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院