硬皮馬勃菌根苗的合成方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及菌類人工栽培領(lǐng)域，具體而言，涉及一種硬皮馬勃菌根苗的合成方法。該硬皮馬勃菌根苗的合成方法，包括下列步驟：1)將含有硬皮馬勃子實(shí)體的組織置于母種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到硬皮馬勃母種，將硬皮馬勃母種接種到液體菌種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到硬皮馬勃液體菌種；和/或，將硬皮馬勃孢子粉配制成硬皮馬勃孢子懸浮液；2)培養(yǎng)宿主樹的無(wú)菌苗；3)待無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種硬皮馬勃液體菌種或硬皮馬勃孢子懸浮液，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，維持溫度為25℃±3℃，培養(yǎng)得到硬皮馬勃菌根苗。本發(fā)明提供的合成方法可以有效建立硬皮馬勃菌種與宿主樹的共生關(guān)系，能夠成功合成硬皮馬勃菌根苗，菌根感染率高達(dá)85％-90％。
【專利說(shuō)明】硬皮馬勃菌根苗的合成方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及菌類人工栽培領(lǐng)域，具體而言，涉及一種硬皮馬勃菌根苗的合成方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 硬皮馬勃是一種食、藥用真菌，最早載于《名醫(yī)別錄》，味辛性平，入肺經(jīng)，有消腫、 止血、解毒等功效，用于咽喉腫痛及各種出血。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，硬皮馬勃具有多種藥 理作用和臨床應(yīng)用，含有甾體化合物、萜類化合物、小分子含氮化合物、馬勃多糖、蛋白質(zhì)、 肽類等化學(xué)成分有抑菌、抗炎、止咳、殺蟲、抗腫瘤細(xì)胞的作用，具有很高的藥用價(jià)值。崔磊 2006年報(bào)道，從馬勃的新鮮子實(shí)體中分離出新蛋白質(zhì)，其對(duì)小鼠脾細(xì)胞顯示一種抗促細(xì)胞 分裂劑活性，能減少乳腺癌細(xì)胞的生存能力。從硬皮馬勃中分離得一種類似泛激素的肽，此 肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抗增殖活性。
[0003] 硬皮馬勃含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、微量元素及氨基酸，幼嫩子實(shí)體肉質(zhì)細(xì)膩， 美味可口而深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，是老百姓餐桌上喜聞樂(lè)見(jiàn)的美味佳肴，又因其公認(rèn)的 藥用價(jià)值而成為一種重要的食、藥用菌倍受消費(fèi)者青睞。但硬皮馬勃自然產(chǎn)量有限且隨大 大量的人為采摘，資源越來(lái)越少。人工栽培是增加資源、保護(hù)生態(tài)環(huán)境，維持可持續(xù)發(fā)展的 重要方向。而菌根苗合成是硬皮馬勃人工栽培的首要問(wèn)題，菌根苗人工合成就是建立硬皮 馬勃與其宿主樹的共生關(guān)系，是實(shí)現(xiàn)硬皮馬勃人工栽培的第一步。但目前很難人工合成菌 根苗，或者是人工合成時(shí)菌根感染率很低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種硬皮馬勃菌根苗的合成方法，以解決上述的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明提供的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，包括下列步驟：
[0006] (1)將含有硬皮馬勃子實(shí)體的組織置于母種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到硬皮馬勃母種，將 硬皮馬勃母種接種到液體菌種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到硬皮馬勃液體菌種；
[0007] 和 / 或，
[0008] 將硬皮馬勃孢子粉配制成硬皮馬勃孢子懸浮液；
[0009] (2)將思茅松、云南松或高山松的種子培養(yǎng)至萌發(fā)出白色芽點(diǎn)移栽入無(wú)菌苗培養(yǎng) 基中培養(yǎng)得到無(wú)菌苗；
[0010] (3)待無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種硬皮馬勃液體菌種或硬皮馬勃孢子懸浮 液，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，維持溫度為25°C ±3°C，培養(yǎng)得到硬皮馬勃菌根苗。
[0011]本發(fā)明提供了兩種硬皮馬勃菌種與無(wú)菌苗接種合成菌根苗，分別為：硬皮馬勃孢 子懸浮液和硬皮馬勃液體菌種。這樣不僅豐富了硬皮馬勃菌種的來(lái)源，而且硬皮馬勃孢子 懸浮液的制備和培養(yǎng)要比硬皮馬勃液體菌種簡(jiǎn)單，并且菌根感染率相差無(wú)幾。
[0012] 本發(fā)明選擇思茅松、云南松或高山松為宿主樹種，通過(guò)單獨(dú)培養(yǎng)硬皮馬勃菌種和 單獨(dú)培養(yǎng)宿主樹的無(wú)菌苗，并通過(guò)選擇在無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)接入硬皮馬勃菌種，保持基質(zhì) 濕潤(rùn)，維持溫度為25°C ±3°C，培養(yǎng)得到了硬皮馬勃菌根苗。
[0013] 優(yōu)選地，所述液體菌種培養(yǎng)基包括下列組分，按重量份計(jì)：
[0014] 馬鈐薯100-200份，葡萄糖10-20份，酒石酸銨1-2份，蛋白胨2-4份，MgS041-2份， ΚΗ 2Ρ041-2份，水500-1500份；優(yōu)選地，馬鈐薯120-180份，葡萄糖12-18份，酒石酸銨1-2 份，蛋白胨 2-4 份，MgS04l-2 份，ΚΗ2Ρ041-2 份，水 800-1200 份；
[0015] 所述母種培養(yǎng)基為在所述液體菌種培養(yǎng)基各組分及用量的基礎(chǔ)上增加15-20份 的瓊脂。
[0016] 優(yōu)選地，所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基包括下列組分，按重量份計(jì)：
[0017] 蛭石 15000-40000 份，珍珠巖 20000-50000 份，草炭 50000-100000 份，紅壤 土 100000-300000 份，腐殖質(zhì) 10000-30000 份，磷酸二氫銨 100-200 份，MgS04100-200 份，ΚΗ2Ρ04100-200份；優(yōu)選地，蛭石20000-30000份，珍珠巖30000-40000份，草炭 60000-90000 份，紅壤土 150000-250000 份，腐殖質(zhì) 15000-25000 份，磷酸二氫銨 120-180 份，MgS04130-180份，KH2P04120-180份；優(yōu)選地，腐殖質(zhì)包括牛糞。
[0018] 優(yōu)選地，在步驟（1)中，配制硬皮馬勃孢子懸浮液的方法為：按重量份計(jì)，向 50-500份硬皮馬勃孢子粉中加入500-5000份無(wú)菌水，得到硬皮馬勃孢子懸浮液。
[0019] 優(yōu)選地，在步驟（3)中，每株無(wú)菌苗接種硬皮馬勃孢子懸浮液5-10ml，所述硬皮馬 勃孢子懸浮液的菌球濃度為5 X 106-5 X 101°個(gè)/ml。
[0020] 優(yōu)選地，在步驟（1)中，將含有硬皮馬勃子實(shí)體的組織置于母種培養(yǎng)基中后，在 27°C ±2°C的溫度下，暗光培養(yǎng)得到硬皮馬勃母種。
[0021] 優(yōu)選地，在步驟（1)中，將硬皮馬勃母種接入液體菌種培養(yǎng)基中后保持基質(zhì)濕潤(rùn)， 維持溫度為27°C ±2°C，在125-160r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩暗光培養(yǎng)振蕩暗光培養(yǎng)8-12天。
[0022] 優(yōu)選地，在步驟（3)中，每株無(wú)菌苗接種硬皮馬勃液體菌種10_20ml，所述硬皮馬 勃液體菌種的菌球濃度為1000-2000個(gè)/ml。
[0023] 優(yōu)選地，所述母種培養(yǎng)基和所述液體菌種培養(yǎng)基的pH分別為4. 0-6. 0。
[0024] 優(yōu)選地，在步驟（1)中，在向液體菌種培養(yǎng)基中接種硬皮馬勃母種之前，對(duì)液體菌 種培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理。
[0025] 本發(fā)明通過(guò)選擇合適的母種培養(yǎng)基和液體菌種培養(yǎng)基的各種組分及其用量，使 得母種培養(yǎng)基適于將硬皮馬勃子實(shí)體組織培養(yǎng)為硬皮馬勃母種，液體菌種培養(yǎng)基適于將 硬皮馬勃母種培養(yǎng)為硬皮馬勃液體菌種，培養(yǎng)所得硬皮馬勃液體菌種的菌球濃度高達(dá) 1000-2000 個(gè) /ml。
[0026] 在配制硬皮馬勃孢子懸浮液的過(guò)程中，發(fā)明人通過(guò)控制硬皮馬勃孢子粉與水的用 量比例，使得配制出的硬皮馬勃孢子懸浮液的菌球濃度為5X 106-5X 101°個(gè)/ml。
[0027] 無(wú)菌水是將水中微生物殺死或過(guò)濾而得到的水，水中的無(wú)機(jī)鹽等不會(huì)減少。發(fā)明 人在配制硬皮馬勃孢子懸浮液時(shí)選擇無(wú)菌水的目的是防止水中帶入的雜菌對(duì)培養(yǎng)的影響。
[0028] 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)搖床的轉(zhuǎn)速對(duì)菌類的生長(zhǎng)也有一定影響。當(dāng)轉(zhuǎn)速低于125r/min時(shí)，菌 絲生長(zhǎng)量明顯減少，菌絲分散程度明顯降低；而當(dāng)轉(zhuǎn)速高于160r/min時(shí)，雖然菌絲分散程 度高，但菌絲太短，菌絲團(tuán)較小，不利于后續(xù)的接種，從而降低了菌根感染率。因此，本發(fā)明 將搖床轉(zhuǎn)速控制在125-160r/min。
[0029] 本發(fā)明中控制每株無(wú)菌苗接種硬皮馬勃孢子懸浮液5-10ml或硬皮馬勃液體菌種 10-20ml，使得接種量既能滿足接種需要，又不至于接種量太大造成浪費(fèi)，從而可以為后續(xù) 接種提供菌種，減少培養(yǎng)硬皮馬勃菌種的次數(shù)。
[0030] 發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述母種培養(yǎng)基和所述液體菌種培養(yǎng)基的pH分別為 4. 0-6. 0時(shí)，菌種生長(zhǎng)速度較快，而當(dāng)pH小于4. 0或pH大于6. 0時(shí)，菌種的生長(zhǎng)均受到抑 制，所以在培養(yǎng)過(guò)程中要及時(shí)調(diào)整母種培養(yǎng)基和液體菌種培養(yǎng)基的pH為4. 0-6. 0。
[0031] 為了進(jìn)一步消除雜菌對(duì)培養(yǎng)液體菌種的影響，在向液體菌種培養(yǎng)基中接種硬皮馬 勃母種之前，對(duì)液體菌種培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理。
[0032] 本發(fā)明所提供的合成方法可以有效建立硬皮馬勃菌種與宿主樹的共生關(guān)系，能夠 成功合成硬皮馬勃菌根苗，菌根感染率高達(dá)85% -90%。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1
[0034] (1)按下列比例稱取配制母種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯100g，葡萄糖10g，酒石 酸銨lg，蛋白胨2g，MgS0 4lg，KH2P04lg，瓊脂15g，水500ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至4.0， 得到母種培養(yǎng)基，將母體培養(yǎng)基置于25mmX 200mm的試管中；
[0035] (2)采集野生中等成熟的硬皮馬勃子實(shí)體，在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，用解剖刀切 取子實(shí)體中間部分2mmX 5mmX 10mm的組織塊，將該組織塊放入盛有母種培養(yǎng)基的試管中， 將試管置于27°C ±2°C的環(huán)境中，暗光培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)滿試管斜面，得到硬皮馬勃母種；
[0036] (3)按下列比例稱取配制液體菌種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯100g，葡萄糖10g， 酒石酸銨lg，蛋白胨2g，MgS0 4lg，KH2P04lg，水500ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至4. 0,得到 液體菌種培養(yǎng)基，取300ml液體菌種培養(yǎng)基于500ml的三角瓶中，在121°C的溫度下滅菌 30min，冷卻待用；
[0037] (4)向三角瓶中加入硬皮馬勃母種，加入量為1試管硬皮馬勃母種加入10個(gè)三角 瓶中，將三角瓶置于27°C ±2°C的環(huán)境中，在125r/min下振蕩暗光培養(yǎng)12天，得到液體菌 種，菌球濃度為2000個(gè)/ml ;
[0038] (5)在組培瓶底部平鋪一層濾紙，用自來(lái)水浸濕，然后用包頭紙系好，121°C滅菌 30min，冷卻待用；
[0039] (6)精選思茅松成熟種子，用自來(lái)水沖洗2h，之后用30% H202浸泡15min，同時(shí)不 斷搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水沖洗三次。放入滅菌的組培瓶中，每瓶放入5粒種子，置于23°C ±3°C 的環(huán)境中黑暗處培養(yǎng)，每天檢查2次，剔除污染雜菌的種子，至種子萌發(fā)出白色芽點(diǎn)；
[0040] (7)按下列比例稱取配制無(wú)菌苗培養(yǎng)基的各種組分：蛭石15kg，珍珠巖20kg，草炭 50kg，紅壤土 100kg，牛糞 10kg，磷酸二氫銨 100g，MgS04100g，KH2P04100g ;將蛭石、珍珠巖、 草炭預(yù)濕，加入紅壤土、牛糞，將磷酸二氫銨、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，噴灑入基質(zhì)中， 混勻，121°C滅菌50min，冷卻后將基質(zhì)裝入用高錳酸鉀消毒的塑料盆中；
[0041] (8)將萌發(fā)的種子移栽入塑料盆中，置于溫室大棚中，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在 25 °C ±3 °C的溫度下培養(yǎng)無(wú)菌苗；
[0042] (9)待無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種10ml液體菌種，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在溫度為 25 °C ±3 °C的環(huán)境中培養(yǎng)3個(gè)月。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] (1)按下列比例稱取配制母種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯200g，葡萄糖20g，酒石 酸銨2g，蛋白胨4g，MgS042g，KH2P042g，瓊脂20g，水1500ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至6· 0， 得到母種培養(yǎng)基，將母體培養(yǎng)基置于25mmX 200mm的試管中；
[0045] (2)采集野生中等成熟的硬皮馬勃子實(shí)體，在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，用解剖刀切 取子實(shí)體中間部分2mmX 5mmX 10mm的組織塊，將該組織塊放入盛有母種培養(yǎng)基的試管中， 將試管置于27°C ±2°C的環(huán)境中，暗光培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)滿試管斜面，得到硬皮馬勃母種；
[0046] (3)按下列比例稱取配制液體菌種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯200g，葡萄糖20g， 酒石酸銨2g，蛋白胨4g，MgS0 44g，KH2P042g，水1500ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至6. 0,得到 液體菌種培養(yǎng)基，取300ml液體菌種培養(yǎng)基于500ml的三角瓶中，在121°C的溫度下滅菌 30min，冷卻待用；
[0047] (4)向三角瓶中加入硬皮馬勃母種，加入量為1試管硬皮馬勃母種加入10個(gè)三角 瓶中，將三角瓶置于27°C ±2°C的環(huán)境中，在160r/min下振蕩暗光培養(yǎng)8天，得到液體菌 種，菌球濃度為1000個(gè)/ml ;
[0048] (5)在組培瓶底部平鋪一層濾紙，用自來(lái)水浸濕，然后用包頭紙系好，121°C滅菌 30min，冷卻待用；
[0049] (6)精選高山松成熟種子，用自來(lái)水沖洗lh，之后用30% H202浸泡30min，同時(shí)不 斷搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水沖洗三次。放入滅菌的組培瓶中，每瓶放入5粒種子，置于23°C ±3°C 的環(huán)境中黑暗處培養(yǎng)，每天檢查2次，剔除污染雜菌的種子，至種子萌發(fā)出白色芽點(diǎn)；
[0050] (7)按下列比例稱取配制無(wú)菌苗培養(yǎng)基的各種組分：蛭石40kg，珍珠巖50kg，草炭 100kg，紅壤土 300kg，牛糞 30kg，磷酸二氫銨 200g，MgS04200g，KH2P04200g ;將蛭石、珍珠巖、 草炭預(yù)濕，加入紅壤土、牛糞，將磷酸二氫銨、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，噴灑入基質(zhì)中， 混勻，121 °C滅菌50min，冷卻后將基質(zhì)裝入用高錳酸鉀消毒的塑料盆中；
[0051] (8)將萌發(fā)的種子移栽入塑料盆中，置于溫室大棚中，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在 25 °C ±3 °C的溫度下培養(yǎng)無(wú)菌苗；
[0052] (9)待無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種20ml液體菌種，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在溫度為 25 °C ±3 °C的環(huán)境中培養(yǎng)3個(gè)月。
[0053] 實(shí)施例2的菌根感染率為85. 37 %。
[0054] 實(shí)施例3
[0055] (1)按下列比例稱取配制母種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯140g，葡萄糖14g，酒石 酸銨lg，蛋白胨2g，MgS0 4lg，KH2P04lg，瓊脂15g，水800ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至4. 5， 得到母種培養(yǎng)基，將母體培養(yǎng)基置于25mmX 200mm的試管中；
[0056] (2)采集野生中等成熟的硬皮馬勃子實(shí)體，在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，用解剖刀切 取子實(shí)體中間部分2mmX 5mmX 10mm的組織塊，將該組織塊放入盛有母種培養(yǎng)基的試管中， 將試管置于27°C ±2°C的環(huán)境中，暗光培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)滿試管斜面，得到硬皮馬勃母種；
[0057] (3)按下列比例稱取配制液體菌種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯140g，葡萄糖14g， 酒石酸銨lg，蛋白胨2g，MgS0 4lg，KH2P04lg，水800ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至4. 5,得到 液體菌種培養(yǎng)基，取300ml液體菌種培養(yǎng)基于500ml的三角瓶中，在121°C的溫度下滅菌 30min，冷卻待用；
[0058] (4)向三角瓶中加入硬皮馬勃母種，加入量為1試管硬皮馬勃母種加入10個(gè)三角 瓶中，將三角瓶置于27°C ±2°C的環(huán)境中，在135r/min下振蕩暗光培養(yǎng)11天，得到液體菌 種，菌球濃度為1800個(gè)/ml ;
[0059] (5)在組培瓶底部平鋪一層濾紙，用自來(lái)水浸濕，然后用包頭紙系好，121°C滅菌 30min，冷卻待用；
[0060] (6)精選思茅松成熟種子，用自來(lái)水沖洗lh，之后用30% H202浸泡30min，同時(shí)不 斷搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水沖洗三次。放入滅菌的組培瓶中，每瓶放入5粒種子，置于23°C ±3°C 的環(huán)境中黑暗處培養(yǎng)，每天檢查2次，剔除污染雜菌的種子，至種子萌發(fā)出白色芽點(diǎn)；
[0061] (7)按下列比例稱取配制無(wú)菌苗培養(yǎng)基的各種組分：蛭石20kg，珍珠巖30kg，草炭 60kg，紅壤土 150kg，牛糞 15kg，磷酸二氫銨 120g，MgS04130g，KH2P04120g ;將蛭石、珍珠巖、 草炭預(yù)濕，加入紅壤土、牛糞，將磷酸二氫銨、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，噴灑入基質(zhì)中， 混勻，121 °C滅菌50min，冷卻后將基質(zhì)裝入用高錳酸鉀消毒的燒制陶土盆中；
[0062] (8)將萌發(fā)的思茅松種子移栽入燒制陶土盆中，置于溫室大棚中，保持基質(zhì)濕潤(rùn)， 在25°C ±3°C的溫度下培養(yǎng)思茅松無(wú)菌苗；
[0063] (9)待思茅松無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種12ml液體菌種，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在 溫度為25°C ±3°C的環(huán)境中培養(yǎng)3個(gè)月。
[0064] 實(shí)施例3的菌根感染率為85. 16 %。
[0065] 實(shí)施例4
[0066] (1)按下列比例稱取配制母種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯160g，葡萄糖16g，酒石 酸銨2g，蛋白胨4g，MgS042g，KH2P042g，瓊脂20g，水1200ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至5. 5， 得到母種培養(yǎng)基，將母體培養(yǎng)基置于25mmX 200mm的試管中；
[0067] (2)采集野生中等成熟的硬皮馬勃子實(shí)體，在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，用解剖刀切 取子實(shí)體中間部分2mmX 5mmX 10mm的組織塊，將該組織塊放入盛有母種培養(yǎng)基的試管中， 將試管置于27°C ±2°C的環(huán)境中，暗光培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)滿試管斜面，得到硬皮馬勃母種； [0068] (3)按下列比例稱取配制液體菌種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯160g，葡萄糖16g， 酒石酸銨2g，蛋白胨4g，MgS042g，KH2P042g，水1200ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至5. 5,得到 液體菌種培養(yǎng)基，取300ml液體菌種培養(yǎng)基于500ml的三角瓶中，在121°C的溫度下滅菌 30min，冷卻待用；
[0069] (4)向三角瓶中加入硬皮馬勃母種，加入量為1試管硬皮馬勃母種加入10個(gè)三角 瓶中，將三角瓶置于27°C ±2°C的環(huán)境中，在150r/min下振蕩暗光培養(yǎng)9天，得到液體菌 種，菌球濃度為1200個(gè)/ml ;
[0070] (5)在組培瓶底部平鋪一層濾紙，用自來(lái)水浸濕，然后用包頭紙系好，121°C滅菌 30min，冷卻待用；
[0071] (6)精選云南松成熟種子，用自來(lái)水沖洗1.5h，之后用30% H202浸泡20min， 同時(shí)不斷搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水沖洗三次。放入滅菌的組培瓶中，每瓶放入5粒種子，置于 23°C ±3°C的環(huán)境中黑暗處培養(yǎng)，每天檢查2次，剔除污染雜菌的種子，至種子萌發(fā)出白色 芽點(diǎn)；
[0072] (7)按下列比例稱取配制無(wú)菌苗培養(yǎng)基的各種組分：蛭石30kg，珍珠巖40kg，草炭 90kg，紅壤土 250kg，牛糞 25kg，磷酸二氫銨 180g，MgS04180g，KH2P04180g ;將蛭石、珍珠巖、 草炭預(yù)濕，加入紅壤土、牛糞，將磷酸二氫銨、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，噴灑入基質(zhì)中， 混勻，121 °C滅菌50min，冷卻后將基質(zhì)裝入用高錳酸鉀消毒的塑料盆中；
[0073] (8)將萌發(fā)的思茅松種子移栽入塑料盆中，置于溫室大棚中，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在 25 °C ±3 °C的溫度下培養(yǎng)思茅松無(wú)菌苗；
[0074] (9)待思茅松無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種18ml液體菌種，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在 溫度為25°C ±3°C的環(huán)境中培養(yǎng)3個(gè)月。
[0075] 實(shí)施例4的菌根感染率為85. 25 %。
[0076] 實(shí)施例5
[0077] (1)按下列比例稱取配制母種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯150g，葡萄糖15g，酒石 酸銨1. 5g，蛋白胨3g，MgS04l. 5g，KH2P041. 5g，瓊脂18g，水1000ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH 至5. 0,得到母種培養(yǎng)基，將母體培養(yǎng)基置于25mmX 200mm的試管中；
[0078] (2)采集野生中等成熟的硬皮馬勃子實(shí)體，在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，用解剖刀切 取子實(shí)體中間部分2mmX 5mmX 10mm的組織塊，將該組織塊放入盛有母種培養(yǎng)基的試管中， 將試管置于27°C ±2°C的環(huán)境中，暗光培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)滿試管斜面，得到硬皮馬勃母種；
[0079] (3)按下列比例稱取配制液體菌種培養(yǎng)基的各種組分：馬鈐薯150g，葡萄糖15g， 酒石酸銨1. 5g，蛋白胨3g，MgS04l. 5g，KH2P041. 5g，水1000ml ;將各組分混合，調(diào)節(jié)pH至 5. 0,得到液體菌種培養(yǎng)基，取300ml液體菌種培養(yǎng)基于500ml的三角瓶中，在121 °C的溫度 下滅菌30min，冷卻待用；
[0080] (4)向三角瓶中加入硬皮馬勃母種，加入量為1試管硬皮馬勃母種加入10個(gè)三角 瓶中，將三角瓶置于27°C ±2°C的環(huán)境中，在145r/min下振蕩暗光培養(yǎng)10天，得到液體菌 種，菌球濃度為2000個(gè)/ml ;
[0081] (5)在組培瓶底部平鋪一層濾紙，用自來(lái)水浸濕，然后用包頭紙系好，121°C滅菌 30min，冷卻待用；
[0082] (6)精選思茅松成熟種子，用自來(lái)水沖洗1.5h，之后用30% H202浸泡20min， 同時(shí)不斷搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水沖洗三次。放入滅菌的組培瓶中，每瓶放入5粒種子，置于 23°C ±3°C的環(huán)境中黑暗處培養(yǎng)，每天檢查2次，剔除污染雜菌的種子，至種子萌發(fā)出白色 芽點(diǎn)；
[0083] (7)按下列比例稱取配制無(wú)菌苗培養(yǎng)基的各種組分：蛭石24kg，珍珠巖35kg，草炭 75kg，紅壤土 200kg，牛糞 20kg，磷酸二氫銨 150g，MgS04150g，KH2P04150g ;將蛭石、珍珠巖、 草炭預(yù)濕，加入紅壤土、牛糞，將磷酸二氫銨、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，噴灑入基質(zhì)中， 混勻，121 °C滅菌50min，冷卻后將基質(zhì)裝入用高錳酸鉀消毒的塑料盆中；
[0084] (8)將萌發(fā)的思茅松種子移栽入塑料盆中，置于溫室大棚中，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在 25 °C ±3 °C的溫度下培養(yǎng)思茅松無(wú)菌苗；
[0085] (9)待思茅松無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種18ml液體菌種，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在 溫度為25°C ±3°C的環(huán)境中培養(yǎng)3個(gè)月。
[0086] 實(shí)施例5的菌根感染率為85. 67 %。
[0087] 實(shí)施例6
[0088] (1)采集野生硬皮馬勃菌成熟子實(shí)體，切開(kāi)包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散 方為成熟，將孢子粉連同包被風(fēng)干，保存于7°C ±3°C冰箱待用。
[0089] (2)取步驟（1)中的孢子粉500g，加入無(wú)菌水500ml，均勻搖動(dòng)，配成孢子懸浮液， 顯微鏡下鏡檢孢子濃度為5X 101°個(gè)/ml。
[0090] (3)培養(yǎng)無(wú)菌苗：無(wú)菌苗的培養(yǎng)過(guò)程與實(shí)施例1的步驟（5)-(8)完全相同。待無(wú) 菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種5ml孢子懸浮液，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在溫度為25°C ±3°C的環(huán) 境中培養(yǎng)3個(gè)月。
[0091] 實(shí)施例6的菌根感染率為85. 46 %。
[0092] 實(shí)施例7
[0093] (1)采集野生硬皮馬勃菌成熟子實(shí)體，切開(kāi)包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散 方為成熟，將孢子粉連同包被風(fēng)干，保存于7°C ±3°C冰箱待用。
[0094] (2)取步驟（1)中的孢子粉300g，加入3000ml無(wú)菌水，均勻搖動(dòng)，配成孢子懸浮 液，顯微鏡下鏡檢孢子濃度為5X 108個(gè)/ml。
[0095] (3)培養(yǎng)無(wú)菌苗：無(wú)菌苗的培養(yǎng)過(guò)程與實(shí)施例2的步驟（5)-(8)完全相同。待無(wú) 菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種7. 5ml孢子懸浮液，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在溫度為25°C ±3°C的 環(huán)境中培養(yǎng)3個(gè)月。
[0096] 實(shí)施例7的菌根感染率為87. 78 %。
[0097] 實(shí)施例8
[0098] (1)采集野生硬皮馬勃菌成熟子實(shí)體，切開(kāi)包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散 方為成熟，將孢子粉連同包被風(fēng)干，保存于7°C ±3°C冰箱待用。
[0099] (2)取步驟⑴中的孢子粉50g，加入5000ml無(wú)菌水，均勻搖動(dòng)，配成孢子懸浮液， 顯微鏡下鏡檢孢子濃度為5X 106個(gè)/ml。
[0100] (3)培養(yǎng)無(wú)菌苗：無(wú)菌苗的培養(yǎng)過(guò)程與實(shí)施例4的步驟（5)-(8)完全相同。待無(wú) 菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種l〇ml孢子懸浮液，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，在溫度為25°C ±3°C的環(huán) 境中培養(yǎng)3個(gè)月。
[0101] 實(shí)施例8的菌根感染率為89. 88%。
[0102] 本發(fā)明所提供的合成方法可以有效建立硬皮馬勃菌種與宿主樹的共生關(guān)系，菌根 感染率高達(dá)85 % -90%。
[0103] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，包括下列步驟： (1) 將含有硬皮馬勃子實(shí)體的組織置于母種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到硬皮馬勃母種，將硬皮 馬勃母種接種到液體菌種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到硬皮馬勃液體菌種； 和/或， 將硬皮馬勃孢子粉配制成硬皮馬勃孢子懸浮液； (2) 將思茅松、云南松或高山松的種子培養(yǎng)至萌發(fā)出白色芽點(diǎn)移栽入無(wú)菌苗培養(yǎng)基中 培養(yǎng)得到無(wú)菌苗； (3) 待無(wú)菌苗長(zhǎng)出側(cè)根時(shí)，在其根系接種硬皮馬勃液體菌種或硬皮馬勃孢子懸浮液，保 持基質(zhì)濕潤(rùn)，維持溫度為25°C ±3°C，培養(yǎng)得到硬皮馬勃菌根苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，所述液體菌種培 養(yǎng)基包括下列組分，按重量份計(jì)： 馬鈐薯100-200份，葡萄糖10-20份，酒石酸銨1-2份，蛋白胨2-4份，MgS04l-2份， ΚΗ2Ρ041-2份，水500-1500份；優(yōu)選地，馬鈐薯120-180份，葡萄糖12-18份，酒石酸銨1-2 份，蛋白胨 2-4 份，MgS04l-2 份，ΚΗ2Ρ041-2 份，水 800-1200 份； 所述母種培養(yǎng)基為在所述液體菌種培養(yǎng)基各組分及用量的基礎(chǔ)上增加15-20份的瓊 脂。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，所述無(wú)菌苗培養(yǎng) 基包括下列組分，按重量份計(jì)： 蛭石 15000-40000 份，珍珠巖 20000-50000 份，草炭 50000-100000 份，紅壤土 100000-300000 份，腐殖質(zhì) 10000-30000 份，磷酸二氫銨 100-200 份，MgS04100-200 份， KH2P04100-200 份；優(yōu)選地，蛭石 20000-30000 份，珍珠巖 30000-40000 份，草炭 60000-90000 份，紅壤土 150000-250000份，腐殖質(zhì)15000-25000份，磷酸二氫銨120-180份， MgS04130-180份，KH 2P04120-180份；優(yōu)選地，腐殖質(zhì)包括牛糞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步驟（1)中， 配制硬皮馬勃孢子懸浮液的方法為：按重量份計(jì)，向50-500份硬皮馬勃孢子粉中加入 500-5000份無(wú)菌水，得到硬皮馬勃孢子懸浮液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步驟（3)中， 每株無(wú)菌苗接種硬皮馬勃孢子懸浮液5-10ml，所述硬皮馬勃孢子懸浮液的菌球濃度為 5X10 6-5X1010 個(gè)/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步驟（1)中，將 含有硬皮馬勃子實(shí)體的組織置于母種培養(yǎng)基中后，在27°C ±2°C的溫度下，暗光培養(yǎng)得到 硬皮馬勃母種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步驟（1)中， 將硬皮馬勃母種接入液體菌種培養(yǎng)基中后保持基質(zhì)濕潤(rùn)，維持溫度為27°C ±2°C，在 125-160r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩暗光培養(yǎng)8-12天。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步驟（3) 中，每株無(wú)菌苗接種硬皮馬勃液體菌種10_20ml，所述硬皮馬勃液體菌種的菌球濃度為 1000-2000 個(gè) /ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，所述母種培養(yǎng)基 和所述液體菌種培養(yǎng)基的pH分別為4. 0-6. 0。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硬皮馬勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步驟（1)中，在 向液體菌種培養(yǎng)基中接種硬皮馬勃母種之前，對(duì)液體菌種培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理。
【文檔編號(hào)】A01G1/04GK104145716SQ201410425245
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】紀(jì)光燕, 楊君巧, 楊太茂, 郭細(xì)龍, 謝飛, 郭雪玲, 張文仙 申請(qǐng)人:景洪宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司