一種百合的根尖脫毒與快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種百合的根尖脫毒與快繁方法，該方法為：采用百合根尖作為外植體，將該外植體接種在根尖伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使得外植體根尖拉長；將前述根尖拉長的外植體接種在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)所述拉長的根尖產(chǎn)生胚性愈傷組織，達到脫毒和再生的目的。將前述胚性愈傷組織接種到分化生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)即發(fā)育為完整的試管苗。發(fā)育后的試管苗可采用RT-PCR方法檢測是否含有病毒。利用本發(fā)明，將傳統(tǒng)的莖尖脫毒改為根尖脫毒，簡化了操作程序，避免了脫毒過程中的高污染率，顯著提高了工作效率，且接種體在培養(yǎng)基上生長良好，試管苗繁殖系數(shù)高，脫毒徹底，移栽成活率達98％以上。
【專利說明】一種百合的根尖脫毒與快繁方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物脫毒與組培快繁【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種百合的根尖脫毒與快繁 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 百合（Lilium spp.)屬于百合科（Liliaceae)百合屬多年生具地下鱗莖的草本球 根植物，花朵碩大、花色艷麗、香氣怡人，是世界著名的"五大"切花之一，也是我國重要的農(nóng) 業(yè)經(jīng)濟作物，具有很高的觀賞、食用及藥用價值。中國是世界重要的百合遺傳資源分布地之 一，現(xiàn)有百合屬植物約115個種，其中起源于中國的就有55個種和18個變種，占世界百合 屬植物的一半以上。近年來，百合的市場需求逐年增加，因此，它具有很好的研究開發(fā)和利 用價值。
[0003] 本項目組在對田間百合品種種質(zhì)資源收集利用及組培快繁過程中發(fā)現(xiàn)其存在以 下兩個問題：
[0004] 一是百合田間植株病毒病發(fā)病嚴重。目前已報道的百合病毒病約有20余種，其中 以百合無癥病毒（LSV)、百合斑駁病毒（LMoV)和黃瓜花葉病毒（CMV)最為嚴重，其他各種病 毒病均為局部地區(qū)發(fā)生。這三種病毒分布廣、危害大，常常復(fù)合侵染百合植株，侵染癥狀表 現(xiàn)為脈明癥、葉片斑駁、葉片有鑲嵌并萎黃變色，葉片卷曲、出現(xiàn)褐色壞死斑點等，使品種嚴 重退化，花小且少，甚至畸形變色，嚴重影響其觀賞品質(zhì)。不同的病毒在百合上常常表現(xiàn)出 相似的癥狀，而同種病毒在不同的條件下的癥狀又有很大變異，這給病害的田間診斷和防 治帶來極大困難。針對這一問題，本實驗室已成功采用RT-PCR的檢測方法，對百合病毒進 行檢測。
[0005] 二是傳統(tǒng)的百合莖尖脫毒技術(shù)對植株損傷太大，材料不易獲取，脫毒成活率低。目 前，對于百合進行脫毒的技術(shù)研發(fā)仍然集中在：對莖尖脫毒技術(shù)進行進一步優(yōu)化，比如將熱 處理脫毒或試劑脫毒與莖尖脫毒結(jié)合。例如，申請?zhí)枮?01210050972. 2的專利"東方百合 種球脫毒方法"即是通過綜合運用熱處理脫毒和莖尖脫毒來提高脫毒率和組培苗成活率。 又例如，申請?zhí)枮?01010506318. 9的專利"使用病毒靈藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法"則是 在培養(yǎng)基上加入抗病毒藥物，然后在加入抗病毒藥物的培養(yǎng)基上進行組培苗培養(yǎng)，之后再 進行莖尖脫毒。
[0006] 而關(guān)于采用以百合根尖為外植體進行脫毒和組培快繁的技術(shù)，目前尚未見有文獻 報導(dǎo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于，提供一種百合的根尖脫毒與快繁方法。主要解決的技術(shù)問題 是：百合組織培養(yǎng)過程中傳統(tǒng)的莖尖脫毒技術(shù)存在一些缺陷，例如操作繁瑣、對植株損傷太 大、材料不易獲取，脫毒成活率低、組培苗污染率高等。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -種百合的根尖脫毒與快繁方法，該方法包括以下步驟：
[0010] 步驟1，采用百合根尖作為外植體，將該外植體接種在根尖伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使 得外植體根尖拉長；
[0011] 步驟2,將前述根尖拉長的外植體接種在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)所述拉長的 根尖產(chǎn)生胚性愈傷組織，達到脫毒和再生的目的。
[0012] 進一步地，所述步驟1之前還包括百合根尖外植體的獲得，其獲得方法為：將百合 無菌苗接種到生根培養(yǎng)基上，待根長至l-2cm時，將根前端0. 3-0. 5mm的根尖切下作為外植 體。另外，為了檢測根尖脫毒效果，還可將攜帶百合病毒的無菌苗接種到生根培養(yǎng)基上，待 根長至l_2cm時，將根前端0. 3-0. 5mm的根尖切下作為外植體；待外植體分化為試管苗后， 檢測分化后的試管苗是否還含有之前攜帶的百合病毒，如果不含有則說明已經(jīng)達到脫毒效 果，如果含有則說明未達到脫毒效果。
[0013] 所述生根培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+NAA 0· 4-0. 6mg/L+蔗糖28-32g/L+瓊脂 6-8g/L，PH 5. 6-6. 0。其中，生根培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為：MS培養(yǎng)基+NAA 0. 5mg/l+蔗糖30g/ 1+瓊脂 7g/l，PH 5.8。
[0014] 進一步地，所述步驟1中根尖伸長培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+ΝΑΑ0. 2-0. 5mg/L+ 蔗糖28-32g/L+瓊脂6-8g/L，pH 5.6-6.0。其中，根尖伸長培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為：MS培養(yǎng)基 +NAA 0· 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，PH5. 8。
[0015] 進一步地，所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+毒莠定0. 8-1. 2mg/L+6-BA 0· 4-0. 6mg/L+蔗糖28-32g/L+瓊脂6-8g/L，PH 5. 6-7. 0。其中，體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)選配 方為：MS 培養(yǎng)基 + 毒莠定 1. Omg/L+6-BA 0· 5mg/L+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，PH 5. 8。
[0016] 進一步地，所述步驟2之后還包括：將所述胚性愈傷組織接種到體胚增殖培養(yǎng)基 上培養(yǎng)，使所述胚性愈傷組織增殖。所述體胚增殖培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+毒莠定 0. 2-0. 5mg/L+蔗糖28-32g/L+瓊脂6-8g/L，PH5. 6-7. 0。其中，體胚增殖培養(yǎng)基的優(yōu)選配方 為：MS培養(yǎng)基+毒莠定0. 2-0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，PH 5. 8。
[0017] 進一步地，將前述獲得的胚性愈傷組織或增殖后的胚性愈傷組織接種到分化生 根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將體胚發(fā)育成完整的試管苗。所述分化生根培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基 +6-8六0.2-0.511^/1+隱六0.2-0.511^/1+蔗糖28-328/1+瓊脂6-88/1，？!15.6-7.0。其中，分 化生根培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為：MS培養(yǎng)基+6-BA 0. 2-0. 5mg/L+NAA 0. 2-0. 5mg/L+蔗糖30g/ L+瓊脂 7g/L，PH 5.8。
[0018] 進一步地，所述通過根尖脫毒方式獲得的試管苗可通過RT-PCR病毒檢測方法確 定是否含有百合病毒。
[0019] 本發(fā)明中所述的MS培養(yǎng)基是指：用于植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其配方為本領(lǐng) 域的常規(guī)技術(shù)。可以自己根據(jù)MS配方配制獲得，也可以直接通過市場購買獲得。所述的毒 莠定，其化學(xué)名稱為4-氨基-3, 5, 6-三氯吡啶-2-羧酸。所述的NAA是一種植物激素生長 素，其化學(xué)名稱為萘乙酸。所述6-BA是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，主要用于促進細胞分裂，其化 學(xué)名稱為6-芐氨基腺嘌呤。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：
[0021] 1、相對于百合莖尖脫毒的方式，操作簡單、效率提高。因為百合"莖尖"是由外圍 葉原基、芽原基包裹著，在顯微鏡下用手術(shù)工具連續(xù)剝除多層葉原基和芽原基是一項難度 較大且效率很低的工作，而百合"根尖"在顯微鏡下相對容易操作，效率可提高幾十倍至上 百倍。
[0022] 2、對外植體材料傷害小：一株外植體莖尖只有一個，而根尖可以多次取樣，且不會 對外植體植株造成毀滅性的傷害。
[0023] 3、提高了組培苗的質(zhì)量：本發(fā)明以根尖為外植體不僅成功培育出百合組培苗；并 通過試驗驗證，根尖組培苗比莖尖組培苗在外植體成活率及脫毒種苗繁殖速度上均有提 高。大田種植試驗數(shù)據(jù)表明，根尖脫毒組培苗其生根率和移栽成活率高達98%以上。
[0024] 4、本發(fā)明針對百合根尖特點，對各級培養(yǎng)基作了適應(yīng)性改進和調(diào)整，確保根尖組 培的成功。
[0025] 5、本發(fā)明結(jié)合百合根尖脫毒、百合根外植體體細胞胚胎誘導(dǎo)及RT-PCR病毒檢測 技術(shù)相結(jié)合，確保了百合組培苗一定的脫毒率，從而為百合種苗優(yōu)質(zhì)、安全、高產(chǎn)和大面積 推廣奠定了基礎(chǔ)。

【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0027] ( -）培養(yǎng)基的配制
[0028] 1)生根培養(yǎng)基：MS 培養(yǎng)基 +NAA 0· 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，PH 5. 8。
[0029] 2)根尖伸長培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+NAA 0· 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，PH 5. 8。
[0030] 3)體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+毒莠定L Omg/L+6-BA 0· 5mg/L+鹿糖30g/L+瓊 脂 7g/L，PH 5.8。
[0031] 4)體胚增殖培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+毒莠定0· 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，PH 5. 8。
[0032] 5)分化生根培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+6-BA 0· 5mg/L+NAA 0· 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7g/L，PH 5. 8。
[0033] 以配置1L的生根培養(yǎng)基為例，其具體配制過程是：稱取1L培養(yǎng)基所需的MS培養(yǎng) 基的各質(zhì)量份依次溶解、混合；然后依次稱取生根培養(yǎng)基配方中的NAA 0. 5mg、鹿糖30g、 瓊脂7g，分別加入到MS溶液中依次溶解，定容，調(diào)節(jié)PH值為5. 8 ;最后進行分裝，在高溫 121°C、高壓0. IMPa滅菌15-20分鐘，培養(yǎng)基冷卻后使用。
[0034] 本發(fā)明中，對于各階段使用的培養(yǎng)基，其配方中的各組分含量可以在一定范圍內(nèi) 變化。例如，所述生根培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+ΝΑΑ0. 4-0. 6mg/L+蔗糖28-32g/L+瓊 脂6-8g/L，PH 5. 6-6. 0。所述根尖伸長培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+NAA 0. 2-0. 5mg/L+蔗 糖28-32g/L+瓊脂6-8g/L，pH 5. 6-6. 0。所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+毒莠 定 0· 8-1. 2mg/L+6-BA 0· 4-0. 6mg/L+ 蔗糖 28-32g/L+ 瓊脂 6-8g/L，PH 5. 6-7. 0。所述體胚 增殖培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+毒莠定0. 2-0. 5mg/L+蔗糖28-32g/L+瓊脂6-8g/L，PH 5. 6-7. 0。所述分化生根培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+6-BA 0. 2-0. 5mg/L+NAA 0. 2-0. 5mg/ L+ 蔗糖 28-32g/L+ 瓊脂 6-8g/L，PH 5· 6-7. 0。
[0035] 上述培養(yǎng)基質(zhì)量份數(shù)以及ΡΗ值的變化基本不會對百合外植體的組織培育過程產(chǎn) 生影響。
[0036](二）百合根尖脫毒與快繁
[0037] 1)根尖外植體的選取：將攜帶百合病毒的材料接種到前述配制的生根培養(yǎng)基上 培養(yǎng)，待根長至l_2cm時，在超凈工作臺中的解剖鏡下將前端0. 3-0. 5mm的根尖切下作為外 植體，備用。
[0038] 2)根尖伸長培養(yǎng)：將外植體接種到前述配制的根尖伸長培養(yǎng)基上，在25±2°C的 培養(yǎng)條件下暗培養(yǎng)1個月，待根尖外植體伸長。
[0039] 3)體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)：將伸長的根尖外植體接種到前述配制的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在 25±2°C的培養(yǎng)條件下暗培養(yǎng)2個月，誘導(dǎo)胚性愈傷組織。
[0040] 4)體胚增殖培養(yǎng)：將胚性愈傷組織接種到前述配制的體胚增殖培養(yǎng)基上，在 25±2°C的培養(yǎng)條件下暗培養(yǎng)1個月，增殖胚性愈傷組織。
[0041] 5)體胚分化生根培養(yǎng)：將胚性愈傷組織接種到前述配制的分化生根培養(yǎng)基上，在 25±2°C、光強為50μηιο1 nT2s'光照16h/d的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1個月，體胚發(fā)育為完整的 試管苗。
[0042](三）百合試管苗的病毒檢測
[0043] 1)百合RNA的制備：選取侵染了百合無癥病毒（Lily symptomless virus, LSV)、 黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV)、百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV) 的葉片為材料，采用Omega E. Z. N. A植物RNA提取試劑盒提取基因組RNA，保存于-20°C，備 用。
[0044] 2)cDNA合成：根據(jù)百合病毒CP(coat protein)基因序列設(shè)計出百合無癥病毒 (Lily symptomless virus，LSV)、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV)、百合斑駁 病毒（Lily mottle virus, LMoV)的特異性引物對；cDNA合成每個反應(yīng)總體積為20ul，反應(yīng) 試劑包括總 RNA 2ul，10umol 01igo(dT)151ul，ddH20 7.5ul，70°C水浴 5min，冰浴 5min;添 加 2.5mM/l dNTP 4ul，5Xbuffer 4ul，40U/ul RNA 酶抑制劑 0.5ul，200U/ul M-MLV 反轉(zhuǎn)錄 酶lul，反應(yīng)程序為42°C反轉(zhuǎn)錄60min，70°C滅活15min。
[0045] 所述的百合病毒特異性引物對為下表所示：
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種百合的根尖脫毒與快繁方法，包括以下步驟： 步驟1，采用百合根尖作為外植體，將該外植體接種在根尖伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使得外 植體根尖拉長； 步驟2,將前述根尖拉長的外植體接種在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)所述拉長的根尖 產(chǎn)生胚性愈傷組織，達到脫毒和再生的目的。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于，所述步驟1之前 還包括百合根尖外植體的獲得：將百合無菌苗接種到生根培養(yǎng)基上，待根長至l_2cm時，將 根前端〇. 3-0. 5mm的根尖切下作為外植體。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng) 基的配方為：MS 培養(yǎng)基 +NAA 0· 4-0. 6mg/L+ 蔗糖 28-32g/L+ 瓊脂 6-8g/L，PH 5. 6-6. 0。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于，所述步驟1中 根尖伸長培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+NAA 0. 2-0. 5mg/L+蔗糖28-32g/L+瓊脂6-8g/L，PH 5· 6-6· 0。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于，所述步驟2中 的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+毒莠定0. 8-1. 2mg/L+6-BA 0. 4-0. 6mg/L+鹿糖 28-32g/L+ 瓊脂 6-8g/L，PH 5. 6-7. 0。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于，所述步驟2之后 還包括：將所述胚性愈傷組織接種到體胚增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使所述胚性愈傷組織增殖。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于，所述體胚增 殖培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+毒莠定0. 2-0. 5mg/L+蔗糖28-32g/L+瓊脂6-8g/L，PH 5· 6-7· 0。
8. 如權(quán)利要求1或6所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于，還包括：將 胚性愈傷組織或增殖后的胚性愈傷組織接種到分化生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將體胚發(fā)育成完整 的試管苗。
9. 如權(quán)利要求8所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于，所述分化生根 培養(yǎng)基的配方為：MS 培養(yǎng)基 +6-ΒΑ 0· 2-0. 5mg/L+NAA 0· 2-0. 5mg/L+ 蔗糖 28-32g/L+ 瓊脂 6-8g/L，PH 5. 6-7. 0。
10. 如權(quán)利要求8所述的一種百合的根尖脫毒與快繁方法，其特征在于：所述試管苗通 過RT-PCR病毒檢測方法確定是否含有百合病毒。
【文檔編號】A01H4/00GK104186319SQ201410409288
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】陳敏敏, 顧俊杰, 周音, 張建軍, 沈強, 張平, 張宏偉, 王暉 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上海鮮花港企業(yè)發(fā)展有限公司