一種人外周血單個核細(xì)胞的凍存保護(hù)劑及保存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人外周血單個核細(xì)胞的凍存保護(hù)劑，由以下組分組成：培養(yǎng)基43份~53份；自體血漿30份~40份；二甲基亞砜12份~17份；人血白蛋白5%~7%；海藻糖0.17molL/~0.23mol/L。本發(fā)明公開的保存方法為，采集新鮮抗凝血液，使用人血白蛋白將外周核細(xì)胞配置成細(xì)胞懸液，然后加入等體積的凍存保護(hù)劑，混合均勻后于-90℃~-70℃的條件下保存10h~20h，然后轉(zhuǎn)入液氮中保存。本發(fā)明的公開的凍存保護(hù)劑和保存方法，可以使凍存后的細(xì)胞同時具有較高的活率和較強(qiáng)的細(xì)胞活性，縮短CIK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增的周期。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物細(xì)胞保存的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到一種人外周血單個核細(xì)胞的凍 存保護(hù)劑及保存方法。 一種人外周血單個核細(xì)胞的凍存保護(hù)劑及保存方法

【背景技術(shù)】
[0002] 人外周血單個核細(xì)胞指外周血中具有單個核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹 突狀細(xì)胞等細(xì)胞。人外周血單個核細(xì)胞是制備細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞的種子細(xì)胞，也是 誘導(dǎo)生成特定淋巴細(xì)胞的種子細(xì)胞。在實(shí)際臨床使用中，通常會在患者健康時提取人外周 血單個核細(xì)胞進(jìn)行凍存，在需要時再對其進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增，因此凍存前后人外周血單個核細(xì) 胞的質(zhì)量和數(shù)量直接關(guān)系到誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的周期和細(xì)胞質(zhì)量，這就要求在人外周血單個核 細(xì)胞凍存的過程中，將細(xì)胞的損傷降到最低；使細(xì)胞在復(fù)蘇后有較高的活率；復(fù)蘇后細(xì)胞 形態(tài)規(guī)則，擴(kuò)增周期短。
[0003] 現(xiàn)有的人外周血單個核細(xì)胞凍存技術(shù)主要采用血清、滲透性冷凍保護(hù)劑和培養(yǎng)基 配制凍存液對細(xì)胞進(jìn)行凍存；或者在凍存保護(hù)液中加入羥乙基淀粉，采用這種方法凍存的 細(xì)胞在回輸過程中可能導(dǎo)致過敏性反應(yīng)，并且在復(fù)蘇之后細(xì)胞的雖然存活率較高但細(xì)胞活 性較低，主要表現(xiàn)為不規(guī)則形態(tài)的細(xì)胞較多，并且在隨后誘導(dǎo)培養(yǎng)殺傷細(xì)胞過程中，擴(kuò)增周 期較長。
[0004] 因此要能夠滿足實(shí)際的需要，在人外周血單個核細(xì)胞凍存復(fù)蘇之后細(xì)胞不僅要保 證有較高的活率還要有較強(qiáng)的細(xì)胞活性，還應(yīng)盡量縮短隨后的CIK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增周期。
[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提出了一種新的解決方案。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種人外周血單個核細(xì)胞的凍存保護(hù)劑，以及使用這種凍存 保護(hù)劑保存人外周血單個核細(xì)胞的方法。
[0007] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：提供一種人外周血單個核細(xì)胞的凍 存保護(hù)劑，由以下組分組成：培養(yǎng)基43份?53份；自體血漿30份?40份；二甲基亞砜12 份?17份；人血白蛋白5%?7% ;海藻糖0· 17molL/?0· 23mol/L。
[0008] 此外，本發(fā)明還公開了人外周單個核細(xì)胞的保存方法，包括以下步驟：
[0009] A、采集新鮮的抗凝人外周血進(jìn)行離心處理，分別提取血漿和外周血單個核細(xì)胞； 取血漿配置人血白蛋白，外周血單個核細(xì)胞采用磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次；使用人血白蛋白 將清洗后的外周血單個核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；
[0010] B、配置凍存保護(hù)劑，取培養(yǎng)基43份?53份；自體血漿30份?40份；二甲基亞砜 12份?17份混合均勻，然后加入人血白蛋白和海藻糖，人血白蛋白的終含量質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 5%?7%，海藻糖的終含量為0· 17molL/?0· 23mol/L ;
[0011] C、取外周血單個核細(xì)胞的細(xì)胞懸液，加入等體積的凍存保護(hù)劑，混合均勻后 于-90°C?-70°c的條件下保存10h?24h，然后轉(zhuǎn)入液氮中保存。
[0012] 綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0013] 本發(fā)明的公開的凍存保護(hù)劑和保存方法，可以使凍存后的細(xì)胞同時具有較高的活 率和較強(qiáng)的細(xì)胞活性，縮短CIK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增的周期。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0015] 采集新鮮的EDTA抗凝人外周血加入淋巴分離管中進(jìn)行離心處理，分別提取上層 的血漿和中層的外周血單個核細(xì)胞。取血漿配置人血白蛋白，外周血單個核細(xì)胞采用磷酸 鹽緩沖液清洗數(shù)次；使用人血白蛋白將清洗后的外周血單個核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，采用臺 盼藍(lán)計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度為6. 0 X 107個/ml。
[0016] 在細(xì)胞懸液中加入凍存保護(hù)劑，混合均勻后在低溫處保存一段時間，然后轉(zhuǎn)入液 氮中保存。在實(shí)施過程中，可以將細(xì)胞懸液分成多份，每份加入的保護(hù)劑成分和劑量可以不 相同，同時可以讓每份的保存條件保持一定差別，對照驗證保存過程和條件對保存效果的 影響。凍存保護(hù)劑的組分、加入比例以及保存條件如表1。
[0017] 表1 :實(shí)施例1?7的具體實(shí)施方案
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 一種人外周血單個核細(xì)胞的凍存保護(hù)劑，由以下組分組成： 培養(yǎng)基43份?53份；自體血漿30份?40份；二甲基亞砜12份?17份； 人血白蛋白5%?7% ;海藻糖0· 17molL/?0· 23mol/L。
2. 如權(quán)利要求1所述的保護(hù)劑，其特征在于：所述組分的組成為： 培養(yǎng)基50份；自體血漿35份；二甲基亞砜15份；人血白蛋白5% ;海藻糖0. 2mol/L。
3. -種人外周單個核細(xì)胞的保存方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 采集新鮮的抗凝人外周血進(jìn)行離心處理，分別提取血漿和外周血單個核細(xì)胞；取血 漿配置人血白蛋白，外周血單個核細(xì)胞采用磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次；使用人血白蛋白將清 洗后的外周血單個核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液； B、 配置凍存保護(hù)劑，取培養(yǎng)基43份?53份；自體血漿30份?40份；二甲基亞砜12 份?17份混合均勻，然后加入人血白蛋白和海藻糖，人血白蛋白的終含量為5%?7%，海 藻糖的終含量為〇· 17molL/?0· 23mol/L ; C、 取外周血單個核細(xì)胞的細(xì)胞懸液，加入等體積的凍存保護(hù)劑，混合均勻后 于-90°C?_70°C的條件下保存10h?24h，然后轉(zhuǎn)入液氮中保存。
4. 如權(quán)利要求3所述的保存方法，其特征在于：所述凍存保護(hù)劑的配置為：取培養(yǎng)基 50份；自體血漿35份；二甲基亞砜15份混合均勻，然后加入人血白蛋白和海藻糖，人血白 蛋白的終含量為5%，海藻糖的終含量為0. 2mol/L。
5. 如權(quán)利要求3所述的保存方法，其特征在于：所述細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為6. OX 107 個/ml。
【文檔編號】A01N1/02GK104082277SQ201410359369
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】張清友, 王翔, 李昌旭, 海泉, 李海燕, 李俊, 趙峻 申請人:成都清科生物科技有限公司