低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法，主要是利用低能離子注入介導(dǎo)技術(shù)高效、定向地將Ri質(zhì)粒導(dǎo)入黃芩外植體中，促使Ri質(zhì)粒與黃芩基因組發(fā)生重組整合，實現(xiàn)誘導(dǎo)黃芩毛狀根的目的，所得的黃芩毛狀根形態(tài)上多叢生，分枝多，無向地性，能夠不依賴激素快速生長，能穩(wěn)定生物合成黃芩苷，誘導(dǎo)率可達20～55％，黃芩苷含量可達16.47～19.56％。本發(fā)明提供的方法不僅操作簡便，適用范圍更廣泛，將為單子葉植物及裸子植物的毛狀根體系建立奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于黃芩的人工培育【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃芩毛狀根的誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藥物植物被發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染后,在傷口處就會形成不定根，不定根除菌后能迅速生長，并產(chǎn)生多個分枝，呈毛發(fā)狀，該不定根又被稱為毛狀根(Hairy roots)。自1907年Smith和Townsend發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌能誘導(dǎo)植物形成毛狀根后，1930年Riker等再次闡述了該現(xiàn)象。隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)毛狀根的研究進展十分迅速，除了探求外源基因?qū)胫参锛毎臋C制和植物激素的生理效應(yīng)外，應(yīng)用毛狀根生物技術(shù)誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物的形成與生物轉(zhuǎn)化等研究也有很大發(fā)展。到20世紀末，國內(nèi)外學(xué)者已建立了分屬于31個科的100余種植物的毛狀根培養(yǎng)體系，并進行次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)和調(diào)控,包括苷類、生物堿、醌類、芳香油、酚類、黃酮等多種天然產(chǎn)物。毛狀根培養(yǎng)技術(shù)已被認為是生產(chǎn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的一條重要途徑，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]發(fā)根農(nóng)桿菌之所以具有這種致根性，是因為它具有能誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生的Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒是發(fā)根農(nóng)桿菌染色體外的一個約250kb的大質(zhì)粒，帶有冠癭合成酶基因。在Ri質(zhì)粒上，存在與轉(zhuǎn)化有關(guān)的 兩個主要功能區(qū)，即T-DNA (轉(zhuǎn)移區(qū))和Vir (致病區(qū))。Vir區(qū)基因并不發(fā)生轉(zhuǎn)移，但它對T-DNA的轉(zhuǎn)移非常重要。當發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物時Ri質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)化并插入到植物細胞基因組中，其整合和表達的結(jié)果導(dǎo)致了大量毛狀根的產(chǎn)生。Ri質(zhì)粒誘導(dǎo)的發(fā)根具有生長迅速、激素自養(yǎng)、生長條件簡單、次生代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定，分化程度高、不易變異等特點，而且可把二次代謝物分泌至培養(yǎng)基中。盡管發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于植物次生代謝生產(chǎn)的歷史較短，但該技術(shù)發(fā)展迅速，特別是在一些有價值的藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)上，但是該技術(shù)在推廣過程中遇到了一些問題，如有些植物發(fā)根難以誘導(dǎo)，尤其是單子葉植物和裸子植物，這主要歸因于發(fā)根農(nóng)桿菌對這些植物的侵染能力較弱，致使處于發(fā)根農(nóng)桿菌體內(nèi)的Ri質(zhì)粒不能轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)；同時，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根后，必須盡快除去毛狀根吸附的發(fā)根農(nóng)桿菌，使毛狀根在無菌條件下生長。針對這些問題，亟需開發(fā)一種高效的轉(zhuǎn)Ri質(zhì)粒誘導(dǎo)毛狀根的方法。
[0004]低能離子注入技術(shù)是20世紀80年代由我國科學(xué)家余增亮研究員等人開創(chuàng)和拓展的多學(xué)科交叉的新興研究技術(shù)，目前已被廣泛運用于生物品種改良。在此基礎(chǔ)上，我國學(xué)者自主開發(fā)了低能離子注入介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。作為一種新的轉(zhuǎn)基因方法，低能離子注入介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有其自身的特點:(1)注入離子對細胞具有極強的刻蝕作用，致使細胞表面形成可使外源DNA進入的通道，加上由于注入正離子的積累，大大降低了細胞表面的負電性，從而減少了細胞對帶負電的外源DNA的靜電排斥力，提高了外源DNA的導(dǎo)入。(2)低能離子注入介導(dǎo)轉(zhuǎn)入的外源DNA是直接整合入宿主總DNA中，因此具有較好的遺傳穩(wěn)定性。
(3)低能離子注入介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過將能量較高的離子射入生物體內(nèi)，通過能量沉積、質(zhì)量沉積和電荷交換的機制使生物體產(chǎn)生自由基、染色結(jié)構(gòu)變異或者DNA分子的斷裂、堿基插入、缺失、重復(fù)等生物學(xué)效應(yīng)而產(chǎn)生生物突變體。目前，低能離子注入介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)化無論在理論上還是實際應(yīng)用上都取得了顯著成果。目前尚未見將低能離子注入轉(zhuǎn)基因方法運用于誘導(dǎo)藥用植物毛狀根的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明 采用了以下技術(shù)方案:
[0007]I)將黃芩外植體轉(zhuǎn)接到含50~200 μ g/mL乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接后于25~28°C黑暗培養(yǎng)2~3天，培養(yǎng)后用無菌水將黃芩外植體表面的培養(yǎng)基沖洗干凈，沖洗干凈后將黃芩外植體表面的無菌水用無菌風吹干，吹干后在黃芩外植體上劃痕；
[0008]2)經(jīng)過步驟I)后，將黃芩外植體放置于離子注入機的真空靶室內(nèi)，然后對黃芩外植體進行低能離子注入；
[0009]3)將經(jīng)過低能離子注入的黃芩外植體浸泡入含Ri質(zhì)粒的TE緩沖溶液中并進行避光溫育，溫育的時間為2~4h,溫育的溫度為25~28°C,然后將黃岑外植體接種于含0.1~
0.5mg/L吲哚-3- 丁酸的MS固體培養(yǎng)基中，接種后于25~28°C黑暗培養(yǎng)21~25天誘導(dǎo)出毛狀根。
[0010]所述黃芩外植體為切成0.5~1.0cm的黃芩帶節(jié)莖段的碎段。
[0011]所述含Ri質(zhì)粒的TE緩沖溶液中Ri質(zhì)粒的濃度為≥200 μ g/mL。
[0012]所述離子注入的條件為:以N+作為注入離子，最佳注入劑量為2.5X1016~
3.5X 1016ions/cm2，最佳注入能量為25~30KeV,脈沖時間為5~IOs,間隔時間為5~IOs,真空度為1.5~2.0XlO-4Pa0
[0013]本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0014]1、本發(fā)明所述誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法通過低能離子注入介導(dǎo)的Ri質(zhì)粒誘導(dǎo)黃芩屬黃岑得到毛狀根，結(jié)合基因間隔序列(intergenic transcribed spacer, ITS)基因檢測分析，鑒定所得毛狀根為黃芩屬黃芩毛狀根，誘導(dǎo)率可達20~55%，在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，所得黃芩毛狀根呈黃色，能穩(wěn)定生物合成黃芩苷，黃芩苷含量可達16.47~19.56%。
[0015]2、本發(fā)明所述誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法基于Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物后，Ri質(zhì)粒上的T-DNA片段整合入植物細胞核基因組中，使植物外植體產(chǎn)生毛狀根的原理。與現(xiàn)有技術(shù)的不同之處在于，本發(fā)明所述Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法是利用低能離子注入技術(shù)對植物表面具有高效冷刻蝕作用的特點，將來源于農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒高效導(dǎo)入黃芩外植體中，誘導(dǎo)黃芩毛狀根的生成，解決了現(xiàn)有技術(shù)只能依靠發(fā)根農(nóng)桿菌對植物自然侵染能力的大小實現(xiàn)轉(zhuǎn)移Ri質(zhì)粒進行誘導(dǎo)毛狀根的目的，提高了黃芩毛狀根誘導(dǎo)的高效性，為黃芩毛狀根的誘導(dǎo)開辟出一條有效途徑。
[0016]3、本發(fā)明所述誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法不需要發(fā)根農(nóng)桿菌與植物外植體共培養(yǎng)，毛狀根也無需脫菌處理，解決了毛狀根誘導(dǎo)過程中，植物外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時間過長或過短引起植物細胞受到毒害而死亡的問題，操作簡便，誘導(dǎo)效率得到提高。
[0017]4、對于步驟I)至步驟3)，現(xiàn)有技術(shù)中利用低能離子介導(dǎo)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(或基因片斷)的相關(guān)研究表明，影響轉(zhuǎn)化率的因子有離子的能量、劑量、每次脈沖處理劑量、離子質(zhì)量數(shù)和化學(xué)性質(zhì)等。其中，離子能量和劑量的增加有助于刻蝕樣品產(chǎn)生微通道，但注入離子能量和劑量過高會引起靶材料遺傳物質(zhì)突變，適于誘變育種。因此，在植物轉(zhuǎn)基因研究中，要求各種處理及培養(yǎng)條件盡量減小不必要的突變，所以離子束能量和劑量并不是越高越好。為此，當?shù)湍茈x子介導(dǎo)轉(zhuǎn)化用至本發(fā)明時，本發(fā)明以黃芩外植體為研究對象，并在其表面進行劃痕處理以及利用高濃度(400 μ g/mL)的Ri質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化以達到外源質(zhì)粒的高效導(dǎo)入的目的，實現(xiàn)在提高轉(zhuǎn)化效率的同時減少低能離子注入引發(fā)的宿主不必要的突變。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為經(jīng)低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所得的黃芩毛狀根的生長曲線圖譜；
[0019]圖2為經(jīng)低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所得的黃芩毛狀根生物合成黃芩苷的遺傳穩(wěn)定性圖譜。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0021]本發(fā)明針對利用農(nóng)桿菌與植物外植體共培養(yǎng)誘導(dǎo)毛狀根方法的不足，采用低能離子注入介導(dǎo)技術(shù)將Ri質(zhì)粒直接導(dǎo)入黃芩外植體中，為黃芩毛狀根的誘導(dǎo)提供新的方法:
[0022]I)黃芩外植體獲得；
[0023]2)發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)及Ri質(zhì)粒的制備；
[0024]3) N+注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黃芩外植體；
[0025]4)黃芩毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0026]5)黃芩毛狀根的鑒別及黃芩苷檢測。
[0027]本發(fā)明具體步驟如下:
[0028](一 )黃岑外植體的制備
[0029]將黃芩種子用自來水沖洗24h，然后用75%乙醇浸泡30s，然后用0.1 % HgCl2溶液對黃芩種子表面滅菌5min，然后用無菌水沖洗黃芩種子3~5次，然后將黃芩種子接種于MS 固體培養(yǎng)基(Murashige T and Skoog F (1962).Physiol Plantl5 (3): 473-497)上，恒溫(25°C )培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)12d后種子開始萌發(fā)，種子開始萌發(fā)后設(shè)定光周期為12h，繼續(xù)培養(yǎng)15d后長出幼苗。取黃芩植株幼苗，無菌條件下切取帶節(jié)莖段，將帶節(jié)莖段切成0.5~
1.0cm碎段得黃芩外植體。
[0030]( 二)發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)和Ri質(zhì)粒的獲得
[0031 ] 1、發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng):將低溫(-20 °C )忙藏的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes) A4或1.2556菌株接種于YEB固體培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L,蛋白胨10g/L,NaC15g/L，瓊脂粉15g/L)上28°C條件下活化2~3次，再挑取單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L)中，于110r/min、25°C下，培養(yǎng)2天得農(nóng)桿
菌培養(yǎng)液。
[0032]2、Ri質(zhì)粒的提取步驟:
[0033] 主要試劑:水溶液1:50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH8.0)，IOmM乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0);水溶液 I1:2N NaOHlmL, 10% SDSlmL，加 ddH20 至 10mL，使用前臨時配置；溶液II1:醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH4.8，4°C保存?zhèn)溆?；TE緩沖溶液(IOmM Tris-HCl (pH7.8)，ImMEDTA(pH8.0));苯酚/氯仿/異戊醇(V:V:V = 25:24:1);乙醇(無水乙醇、70%乙醇)；溴化乙錠(EB):10mg/mL ;核糖核酸酶 A(RNase A, Sigma)。
[0034]I)取1.5mL上述農(nóng)桿菌培養(yǎng)液放入微量離心管中，室溫8000r/min離心Imin,棄
上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡，得細菌沉淀。
[0035]2)將細菌沉淀重懸于100 μ L預(yù)冷(置于冰塊表面60min)的水溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻(且不至于沉淀)。
[0036]3)經(jīng)過步驟2)后，加200 μ L新鮮配制的水溶液II，顛倒數(shù)次混勻(不要劇烈振蕩)，并將離心管放置于冰上2~3min，使細胞膜裂解。
[0037]4)經(jīng)過步驟3)后，加入150 μ L預(yù)冷(置于冰塊表面60min)的溶液III，將離心管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，在冰上放置3~5min。
[0038]5)經(jīng)過步驟4)后，加入450 μ L的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4°C、12000r/min 離心 lOmin。
[0039]6)經(jīng)過步驟5)后，小心移出上清于一新微量離心管中，加入上清2.5倍體積預(yù)冷(置于冰塊表面60min)的無水乙醇,混勻，室溫放置2~5min, 4°C、12000r/min離心15min。
[0040]7)經(jīng)過步驟6)后，ImL預(yù)冷(置于冰塊表面60min)的70%乙醇洗滌離心得到的沉淀I~2次，4°C、8000r/min離心7min,棄上清,將沉淀在室溫下晾干。
[0041]8)經(jīng)過步驟7)后，將晾干的沉淀溶于20 μ L TE緩沖溶液(含RNase Α20 μ g/mL)，37°C水浴30min以降解RNA分子，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0042](三)黃芩毛狀根的誘導(dǎo)
[0043]取無菌的黃芩莖段(即碎段)，轉(zhuǎn)接到含100 μ g/mL乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基(即在MS固體培養(yǎng)基中額外添加100 μ g/mL乙酰丁香酮)上，于25°C黑暗預(yù)培養(yǎng)2天。然后取出黃芩莖段用無菌水沖洗3次，使黃芩莖段表面的培養(yǎng)基沖洗干凈，然后置于無菌平皿(90mm)中央并用無菌風吹至表面無水后在黃芩莖段表面輕輕劃痕(即在表面形成細小的線狀創(chuàng)傷口)。
[0044]劃痕后將裝有黃芩莖段的無菌平皿放置于離子注入機的真空靶室內(nèi)，進行離子注入，注入條件為:低能N+作為注入離子，最佳注入劑量為3.0X1016ionS/Cm2，最佳注入能量為30KeV，脈沖時間為10s，間隔時間為10s，真空度為2.0X10_4Pa。
[0045]注入完畢后進行避光溫育:用2~3mL含400 μ g/mL Ri質(zhì)粒(Ri質(zhì)粒濃度越大則轉(zhuǎn)化率會越高)的TE緩沖溶液浸泡經(jīng)離子注入后的黃芩莖段(能夠全部浸沒即可)，對照組黃芩莖段經(jīng)低能離子注入后用不含Ri質(zhì)粒的TE緩沖溶液浸泡。于25°C避光溫育4h后，分別將浸泡于含有Ri質(zhì)粒的TE緩沖溶液和不含Ri質(zhì)粒的TE緩沖溶液中的黃芩莖段接種于含0.3mg/L吲哚-3- 丁酸的MS固體培養(yǎng)基(即在MS固體培養(yǎng)基中額外添加0.3mg/L吲哚-3-丁酸)中，并于25°C黑暗培養(yǎng)誘導(dǎo)毛狀根。
[0046]經(jīng)低能離子注入技術(shù)介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)入后的黃芩莖段于21~25天后基部有根長出，大多數(shù)具有毛狀根的特征:具有白色根毛，多分支，向上或沿培養(yǎng)基水平生長并失去向地性，毛狀根的誘導(dǎo)率達20~55% (現(xiàn)有技術(shù)中，誘導(dǎo)率最高為10~40%，專利號:ZL201110132376.4)。而對照組在14天左右逐漸褐化、死亡。
[0047](四)誘導(dǎo)出的黃芩毛狀根鑒定及其黃芩苷檢測
[0048]1、利用ITS和ι.ο1Β基因測序鑒定誘導(dǎo)出的黃芩毛狀根:毛狀根基因組DNA的提取和ITS基因檢測分析方法依據(jù)已授權(quán)專利(專利號:ZL201110132376.4)中所應(yīng)用的方法。ITS基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)上海生工有限公司測序分析，并與NCBI上的ITS進行比對分析表明，誘導(dǎo)出的毛狀根的ITS與黃芩屬黃芩(登錄號:AB557593.1)的ITS相似度高達90%以上，表明該毛狀根可以分類為黃芩屬黃芩。
[0049]2、 利用ι.ο1Β基因鑒定Ri質(zhì)粒是否重組到誘導(dǎo)出的黃芩毛狀根的基因組中:依據(jù)ι.ο1Β基因序列信息，設(shè)計一對特異性引物:
[0050]roIB-UP:5，-GCTCTTGCACTGCTAGATTT-3，
[0051]roIB-down -GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’
[0052]PCR 反應(yīng)體系:2 μ L Taq 聚合酶、3 μ LIOxPCR 緩沖液、I μ L50mmol/LMg2\2yL10mmol/L dNTP、上述兩種引物各I μ L，2 μ L毛狀根模板基因組DNA，加無菌重蒸水補至終體積30 μ L。
[0053]PCR 反應(yīng)條件:首先 94°C 5min ;94°C變性 30s:52°C退火 45s ;72°C反應(yīng) 30s ;共 30次循環(huán)；最后72°C延伸反應(yīng)lOmin。
[0054]PCR擴增產(chǎn)物用1.0% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳進行分析。rolB基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)上海生工有限公司測序分析，并與NCBI上的ι.ο1Β進行比對分析表明，該基因已穩(wěn)定重組到誘導(dǎo)出的黃芩毛狀根的基因組中。
[0055]3、所得毛狀根的液體培養(yǎng):對所得毛狀根進行三級擴大培養(yǎng):1) 一級種子培養(yǎng):在無菌條件下將50mg毛狀根接種于150mL毛狀根液體培養(yǎng)基(添加有0.4mmol/L苯丙氨酸以及60g/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基)中，然后在110r/min、26°C條件下避光培養(yǎng)5天；2)二級種子培養(yǎng):在無菌條件下將經(jīng)過一級種子培養(yǎng)的150mg毛狀根接種于300mL所述毛狀根液體培養(yǎng)基中，然后在110r/min、26°C條件下避光培養(yǎng)10天；3)培養(yǎng)基二次補加培養(yǎng):在無菌條件下將經(jīng)過二級種子培養(yǎng)的毛狀根以5g/L的接種量接種于500mL所述毛狀根液體培養(yǎng)基中，然后在110r/min、26°C下避光培養(yǎng)，培養(yǎng)15天后補加300mL所述毛狀根液體培養(yǎng)基，然后在110r/min、26°C下繼續(xù)培養(yǎng)15天后收獲黃芩毛狀根，然后測定收獲的黃芩毛狀根的鮮重及其黃芩苷的含量。
[0056]黃芩毛狀根生物量(用鮮重表示)的測定:取出毛狀根，用布氏漏斗抽濾至無水滴下時稱重。
[0057]黃芩毛狀根生物量(用干重表示)的測定:取毛狀根，蒸餾水洗去表面培養(yǎng)基，于70°C下滅酶并烘至恒重，研磨后過60目篩得黃芩毛狀根干粉，稱重。
[0058]黃芩毛狀根的黃芩苷含量測定:精密稱取0.300g黃芩毛狀根干粉，加40mL、70%乙醇回流提取3h后定容至IOOmL,然后過0.45 μ m微孔濾膜，得供試品溶液，結(jié)合用黃芩苷標準品制作的黃芩苷高效液相色譜標準曲線，采用高效液相色譜法(HPLC)測定供試品溶液中的黃岑苷含量。
[0059]所述黃芩苷的HPLC測定方法:采用2005年藥典所制定的方法，色譜柱:化學(xué)鍵合型十八烷基柱(SCiC18色譜柱)，檢測器:Pump K-1001，流動相:甲醇:水:磷酸=50:50:0.2(體積比)，檢測波長:274nm,柱溫:25°C,流速:lmL/min。
[0060]黃芩毛狀根的黃芩苷含量=HPLC計算的黃芩苷含量/黃芩毛狀根干重X 100%
[0061]經(jīng)三級擴大培養(yǎng)(45天)后收獲黃芩毛狀根，測得結(jié)果表明所得黃芩毛狀根的黃芩苷含量為16.47~19.56%。此外，由圖1可知，經(jīng)低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所得的黃芩毛狀根從第15天開始進入快速期，至30天進入生長平緩期。[0062]將經(jīng)低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所得的黃芩毛狀根經(jīng)三級擴大培養(yǎng)(45天)后，取150mg毛狀根轉(zhuǎn)接到300mL所述毛狀根液體培養(yǎng)基中，連續(xù)繼代培養(yǎng)12個月(26°C、110r/min條件下避光培養(yǎng))，期間每隔30天繼代培養(yǎng)一次，按照上述黃芩苷含量測定方法測定黃芩苷的含量。如圖2所示，經(jīng)繼代培養(yǎng)10個月后，仍保持生物合成黃芩苷的穩(wěn)定性，黃岑苷含量基本穩(wěn)定。
[0063] 本發(fā)明所述誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法只與Ri質(zhì)粒與被誘導(dǎo)植物及其接種部位有關(guān)，為打破發(fā)根農(nóng)桿菌僅能浸染絕大多數(shù)的雙子葉植物、少數(shù)單子葉植物及個別裸子植物的局限提供了有效途徑。本發(fā)明可以進一步與現(xiàn)有的DNA重組技術(shù)結(jié)合，用于將外源基因與Ri質(zhì)粒進行重組所構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物體內(nèi)，對植物基因工程的發(fā)展和植物品種改良提供實踐依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將黃芩外植體轉(zhuǎn)接到含50~200μ g/mL乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接后于25~28°C黑暗培養(yǎng)2~3天，培養(yǎng)后用無菌水將黃芩外植體表面的培養(yǎng)基沖洗干凈，沖洗干凈后將黃芩外植體表面的無菌水用無菌風吹干，吹干后在黃芩外植體上劃痕； 2)經(jīng)過步驟I)后，將黃芩外植體放置于離子注入機的真空靶室內(nèi)，然后對黃芩外植體進行低能離子注入； 3)將經(jīng)過低能離子注入的黃芩外植體浸泡入含Ri質(zhì)粒的TE緩沖溶液中并進行避光溫育，溫育的時間為2~4h，溫育的溫度為25~28°C，然后將黃芩外植體接種于含0.1~0.5mg/L吲哚-3- 丁酸的MS固體培養(yǎng)基中，接種后于25~28°C黑暗培養(yǎng)21~25天誘導(dǎo)出毛狀根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法，其特征在于:所述黃芩外植體為切成0.5~1.0cm的黃芩帶節(jié)莖段的碎段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法，其特征在于:所述含Ri質(zhì)粒的TE緩沖溶液中Ri質(zhì)粒的濃度為> 200 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所 述一種低能離子注入介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)黃芩毛狀根的方法，其特征在于:所述離子注入的條件為:以N+作為注入離子，注入劑量為2.5X IO16~3.5X1016ions/cm2，注入能量為25~30KeV，脈沖時間為5~10s，間隔時間為5~10s，真空度為 1.5 ~2.0XlO-4Pa0
【文檔編號】A01H5/00GK103981213SQ201410216379
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】錢衛(wèi)東, 王婷, 付云芳, 蔡長龍, 毛培宏, 施春陽 申請人:陜西科技大學(xué)