利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，包括長(zhǎng)春花感病植株的培育、長(zhǎng)春花的扦插再生、長(zhǎng)春花扦插再生條件的優(yōu)化、藥物處理和抗韌皮部桿菌藥物的篩選。本發(fā)明以植物韌皮部桿菌的天然寄主長(zhǎng)春花為篩選抗韌皮部桿菌藥物的試材，篩選方法快速、操作簡(jiǎn)便，能直觀、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)待篩選藥物抗韌皮部桿菌的效果。
【專利說(shuō)明】利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及篩選抗菌藥物的方法，具體涉及一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，屬植保【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]韌皮部桿菌(Ca.Liberibacter)是一種引起柑橘黃龍病、馬鈴薯斑馬片病等嚴(yán)重病害的病菌，對(duì)世界柑橘、馬鈴薯等生產(chǎn)造成巨大的損失。如柑橘黃龍病2005年在美國(guó)佛羅里州首次發(fā)現(xiàn)，在短短的5年時(shí)間里，已經(jīng)擴(kuò)散到全部34個(gè)柑橘產(chǎn)生產(chǎn)縣，造成高達(dá)46億美元的經(jīng)濟(jì)損失；同樣地，馬鈴薯斑馬片病是20世紀(jì)90年代中期在南美洲首次發(fā)現(xiàn)的新病害，近年該病害在美國(guó)、墨西哥及新西蘭等地?cái)U(kuò)散為害，對(duì)當(dāng)?shù)伛R鈴薯生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。這類菌至今還未能獲得純化培養(yǎng)，因此其科赫氏假說(shuō)(Koch’ s postulates)還未得到驗(yàn)證，也無(wú)法通過(guò)離體培養(yǎng)進(jìn)行藥物篩選，嚴(yán)重制約了該菌和相關(guān)病害的防治。
[0003]長(zhǎng)春花是韌皮部桿菌的天然寄主，病原菌在長(zhǎng)春花體內(nèi)繁殖速度很快，而且感病后癥狀明顯，是一種理想的篩選抗韌皮部桿菌藥物的植物材料。健康的長(zhǎng)春花生長(zhǎng)快，扦插成活率高，對(duì)外界條件要求很低，但當(dāng)長(zhǎng)春花感染韌皮部桿菌后，由于病原菌的快速繁殖造成韌皮部的嚴(yán)重?fù)p傷，很難扦插成活。因此，如果通過(guò)在培養(yǎng)基中添加外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及控制培養(yǎng)條件，促進(jìn)帶菌發(fā)病的長(zhǎng)春花枝條扦插后能夠保持正常的發(fā)根和生長(zhǎng)，這樣就能通過(guò)發(fā)病的長(zhǎng)春花扦插再生和病原菌的增殖情況進(jìn)行抗韌皮部桿菌的藥物篩選和評(píng)價(jià)。
[0004]經(jīng)檢索，目前，未見(jiàn)有抗韌皮部桿菌藥物篩選方法的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本領(lǐng)域技術(shù)人員長(zhǎng)期希望找到一種能快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便地用于篩選及評(píng)價(jià)抗韌皮部桿菌藥物的方法，用于防治柑橘黃龍病、馬鈴薯斑馬片病等病害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，能快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便地用于篩選及評(píng)價(jià)抗韌皮部桿菌藥物。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特征在于如下步驟:
[0008](I)長(zhǎng)春花感病植株的培育:通過(guò)菟絲子的吸器與寄主植物維管束相連接，將感染柑橘黃龍病植株的韌皮部桿菌病原菌傳到種子培育的長(zhǎng)春花，I~6個(gè)月后，長(zhǎng)春花葉片出現(xiàn)感染韌皮部桿菌的癥狀，經(jīng)PCR檢測(cè)，確定長(zhǎng)春花植株感病，保育在防蟲(chóng)溫室中。
[0009](2)長(zhǎng)春花的扦插再生:在采集長(zhǎng)春花感病枝條前I~12個(gè)小時(shí),完全燒灌植株，采集I~IOcm至少包含兩張葉片的帶菌枝條，在`枝條的基部用促根劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑蘸浸，種植在栽培基質(zhì)中，置于10~35°C的遮陰、防蟲(chóng)控溫溫室中，保持空氣相對(duì)濕度60~95%;其特征在于所述栽培基質(zhì)為蛭石、或砂、或蛭石和砂、或蛭石和有機(jī)土的混合基質(zhì)，其配比一般為蛭石和砂各50%，或蛭石和有機(jī)土各50%。所述的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑一般為NAA或/和IBA，二種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度各為2~16 μ g/ml ;蘸浸時(shí)間一般為1_8個(gè)小時(shí)；[0010](3)長(zhǎng)春花扦插再生條件的優(yōu)化:調(diào)整培養(yǎng)基基質(zhì)組成、噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、促根劑和營(yíng)養(yǎng)液；
[0011](4)藥物處理:取待篩選的藥物，0.1~1000mg/L浸泡處理嚴(yán)重感病的長(zhǎng)春花枝條I~12小時(shí)，進(jìn)行扦插、管理，扦插后I~4周，用相同的藥物再處理I~3次；所述待篩選的藥物，如抗生素、化學(xué)殺菌劑、生物殺菌劑、抗菌多肽等。
[0012](5)抗韌皮部桿菌藥物的篩選:2~6個(gè)月后，觀察不同藥物處理的成活再生生物量和檢測(cè)新生長(zhǎng)枝條的韌皮部桿菌的含量，篩選出抗韌皮部桿菌藥物。
[0013]其中步驟(3)所述調(diào)整基質(zhì)，指將基質(zhì)調(diào)整為有機(jī)土和蛭石各50%的混合物；所述的營(yíng)養(yǎng)液為MS或MT，使用濃度為水和營(yíng)養(yǎng)液的體積比為1:1。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
[0015]1、能直觀、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)待篩選藥物抗韌皮部桿菌的效果。
[0016]2、篩選方法快速、操作簡(jiǎn)便。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0018](I)通過(guò)菟絲子的吸器與寄主植物維管束相連接，將感染柑橘黃龍病植株的韌皮部桿菌傳到種子培育的長(zhǎng)春花，2個(gè)月后，長(zhǎng)春花葉片出現(xiàn)感染韌皮部桿菌的癥狀，經(jīng)PCR檢測(cè)，確定長(zhǎng)春花植株感病，保育在防蟲(chóng)溫室中。
[0019]PCR檢測(cè)方法如`下:①病原菌DNA的提取:用Qiagen的植物DNA提取試劑盒提取(DNeasy Plant Mini Kit, Cat.69106，Qiagen, MO, USA)。將感病的長(zhǎng)春花葉片，撕取中脈，將約200mg中脈裝入2.0ml離心管，加入APl緩沖液和RNAase后，用勻漿機(jī)(Fast Pr印24)打碎，然后在65°C下溫育20min，期間反復(fù)顛倒試管2~3次；加入AP2緩沖液置于冰浴中20min,然后在10，OOOXg下離心5min,加入1.5倍體積的AP3/E緩沖液,反復(fù)振蕩數(shù)次,轉(zhuǎn)入微濾柱,10，000 X g離心Imin ;用AW緩沖液清洗兩次之后再空柱離心徹底甩干，最后向柱中加入50 μ I AE緩沖液洗脫，8，000 Xg離心Imin洗脫植物總DNA，所得用于PCR檢測(cè)；②病原菌的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè):采用TaqMan進(jìn)行，利用亞洲韌皮桿菌核糖體蛋白基因16s核糖體DNA的特異性祀序列按照Primer Express軟件(ABI,USA)設(shè)計(jì)的探針和引物的組合(參考 Li 等 2006 的方法):HLBas (5 ‘-GTCGAGCGCGTATGCAA TACG-3’)、HLBr (5 ‘-CTACCTTTTTCTACGGGATAACGC-3’)、HLBp (5 ‘-AGACGGGTGAGTAACGCG-3’)，由上海生物工程公司合成引物，TaqMan熒光探針5'端、3'端分別用FAM報(bào)導(dǎo)熒光染料和TRAMA淬滅熒光染料標(biāo)記，鋁膜袋閉光保存于_20°C備用。采用20 μ I反應(yīng)體系，含有終濃度I X TaqMan qPCR Mix (AppliedBiosystems)、300nM(each)引物(HLBas and HLBr), 150nM 探針(HLBp)以及適量模板。PCR反應(yīng)程序:在 ABI PRISM7500 (Applied BiosystemsjFoster City, CA)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，預(yù)擴(kuò)增95°C，lmin ;然后95°C，3s，60°C，30s，40個(gè)循環(huán)；末次延伸72°C，7min ;在每個(gè)循環(huán)的延伸階段(60°C)同步多次采集熒光。
[0020](2)采集2~4cm至少包含兩張葉片的嚴(yán)重感染韌皮部桿菌含菌量的枝條，用5 μ g/ml的IBA和5 μ g/ml NAA處理枝條的基部4個(gè)小時(shí),然后將處理后的扦插枝條種植在蛭石和砂各50%的培養(yǎng)基質(zhì)中，置于25°C的遮陰、防蟲(chóng)控溫溫室中，保持空氣相對(duì)濕度90%。
[0021](3)以有機(jī)土和蛭石的混合物為培養(yǎng)基基質(zhì)，扦插后，每隔一個(gè)星期噴施相同濃度的NAA和IBA —次，共噴施兩次；并且配合施用營(yíng)養(yǎng)液MS或MT。
[0022]從表1結(jié)果可以明顯看出，經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化的再生長(zhǎng)春花系統(tǒng)，可以有效促進(jìn)帶病長(zhǎng)春花枝條的生長(zhǎng)，其再生率高達(dá)60%以上，而常規(guī)方法無(wú)法促進(jìn)帶病長(zhǎng)春花枝條的生長(zhǎng)，再生率為0.1%。
[0023]表1:優(yōu)化與常規(guī)長(zhǎng)春花處理感病長(zhǎng)春花枝條的再生效果比較
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特征在于步驟如下: (1)長(zhǎng)春花感病植株的培育:通過(guò)菟絲子的吸器與寄主植物維管束相連接，將感染柑橘黃龍病植株的韌皮部桿菌病原菌傳到種子培育的長(zhǎng)春花，I~6個(gè)月后，長(zhǎng)春花葉片出現(xiàn)感染韌皮部桿菌的癥狀，經(jīng)PCR檢測(cè)，確定長(zhǎng)春花植株感病，保育在防蟲(chóng)溫室中。 (2)長(zhǎng)春花的扦插再生:在采集長(zhǎng)春花感病枝條前I~12個(gè)小時(shí)，完全澆灌植株，采集I~IOcm至少包含兩張葉片的帶菌枝條，在枝條的基部用促根劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑蘸浸，種植在栽培基質(zhì)中，置于10~35°C的遮陰、防蟲(chóng)控溫溫室中，保持空氣相對(duì)濕度60~95% ； (3)長(zhǎng)春花扦插再生條件的優(yōu)化:調(diào)整培養(yǎng)基基質(zhì)組成、噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、促根劑和營(yíng)養(yǎng)液； (4)藥物處理:取待篩選的藥物，0.1~1000mg/L浸泡處理嚴(yán)重感病的長(zhǎng)春花枝條I~12小時(shí)，進(jìn)行扦插、管理，扦插后I~4周，用相同的藥物再處理I~3次； (5)抗韌皮部桿菌藥物的篩選:2~6個(gè)月后，觀察不同藥物處理的成活再生生物量和檢測(cè)新生長(zhǎng)枝條的韌皮部桿菌的含量，篩選出抗韌皮部桿菌藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特征在于所述栽培基質(zhì)為蛭石、或砂、或蛭石和砂、或蛭石和有機(jī)土的混合基質(zhì)。其配比一般為蛭石和砂各50%，或蛭石和有機(jī)土各50%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特征在于蛭石和砂的混合基質(zhì)，其配比為蛭石和砂各50% ;蛭石和有機(jī)土的混合基質(zhì)，其配比為蛭石和有機(jī)土各50%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特征在于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑一般為NAA或 /和IBA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特征在于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA和IBA的使用濃度各為2~16 μ g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用長(zhǎng)春花篩選抗韌皮部桿菌藥物的方法，其特征在于長(zhǎng)春花扦插再生過(guò)程中，噴施 的營(yíng)養(yǎng)液為MS或MT。
【文檔編號(hào)】A01G1/00GK103798012SQ201310691324
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】張木清 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)