專利名稱：一種地衣芽孢桿菌、篩選方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種地衣芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
近年來隨著人們生活水平的提高和環(huán)保意識的增強(qiáng)，對水產(chǎn)品的安全和品質(zhì)提出了新的更高要求。但是由于水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化、高密度飼養(yǎng)模式的大規(guī)模應(yīng)用，使得養(yǎng)殖水體中有機(jī)物、氨氮和亞硝酸氮等污染物的濃度增加，不但導(dǎo)致水質(zhì)惡化，而且直接毒害養(yǎng)殖動物，引起病害的頻繁發(fā)生，水產(chǎn)品品質(zhì)也在不斷下降，造成養(yǎng)殖水體生態(tài)遭到嚴(yán)重破壞。針對水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)的這些問題，微生態(tài)制劑的調(diào)控技術(shù)已經(jīng)成為解決養(yǎng)殖水域污染病害問題的有效手段之一。相對于傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法而言，微生態(tài)技術(shù)具有成本低、收效大、無二次污染等優(yōu)點，是當(dāng)前環(huán)境治理尤其是水環(huán)境污染治理的研究熱點。具有高效除氮能力的細(xì)菌既有自養(yǎng)型細(xì)菌(硝化細(xì)菌、光合細(xì)菌等)，也有惡臭假單胞菌、芽孢桿菌等異養(yǎng)型細(xì)菌。目前芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用最多的微生物之一。一方面由于芽孢桿菌在分離和培養(yǎng)方面對營養(yǎng)和環(huán)境條件均有較低要求，具有生長速率快、溶解氧要求濃度低、能忍受酸性的環(huán)境等優(yōu)點；另一方面芽孢桿菌有利于提高養(yǎng)殖生物的消化機(jī)能，促進(jìn)其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降解水體中的有機(jī)碎屑，減少氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒有害物質(zhì)，起到優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，促進(jìn)水環(huán)境生態(tài)良性循環(huán)等功效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一方面的技術(shù)問題在于，提供一種地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformi)，其能分泌多種酶類，促進(jìn)動物酶活性并提高動物的免疫力，減少病原菌侵害；此外還能降解養(yǎng)殖水體中的氨氮、殘余餌料蛋白質(zhì)和淀粉，凈化養(yǎng)殖水體。本發(fā)明所要解決的第二方面的技術(shù)問題在于，提供一種地衣芽胞桿菌的篩選方法。本發(fā)明所要解決的第三方面的技術(shù)問題在于，提供一種地衣芽胞桿菌的應(yīng)用。為了解決上述問題本發(fā)明的第一方面的技術(shù)方案是這樣的一種地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformi),其特征在于,該地衣芽胞桿菌為X3914,在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC No.M2011325。所述地衣芽胞桿菌為X3914，于2011年9月21日在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO.M2011325。芽孢桿菌種屬，細(xì)胞排列呈桿狀、單生，O. 8ymX (I. 5 3. 5) μ m、革蘭氏染色陽性，有芽孢，具有運(yùn)動性，異養(yǎng)型細(xì)菌，在肉汁培養(yǎng)基上菌落為扁平、邊緣不整齊、表面粗糙皺褶。為了解決上述問題本發(fā)明的第二方面的技術(shù)方案是這樣的一種地衣芽胞桿菌的篩選方法，包括如下步驟(I)健康大黃魚體表消毒后，取出腸道加入滅菌生理鹽水混合研磨，稀釋后分別涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基；(2)將上述兩種培養(yǎng)基平板置于25°C 30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I 2d，分別觀察平板上的菌落特征，挑選出不同特征的菌落，用瓊脂培養(yǎng)基斜面保藏；(3)將步驟(2)中的斜面培養(yǎng)的菌落用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，再利用篩選培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)；(4)最后用奈氏試劑檢驗培養(yǎng)液中NH4+的產(chǎn)生情況，以巨大芽孢桿菌I. 459 (購自CGMCC)作對照，如呈現(xiàn)黃色，說明此種細(xì)菌可將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為NH4+，即可判斷菌株具有氨氮降解功能。以此篩選出降解氨氮能力較強(qiáng)的菌株，編號為X3914，即為保存號為CCTCCM2011325 的菌株。優(yōu)選地，所述的步驟(I)中，取出腸道稱重后按I : 10 I : 15(W/V)的比例加入滅菌生理鹽水混合，用用滅菌勻漿器研磨。優(yōu)選地，所述的步驟(2)的平板培養(yǎng)溫度為28°C。為了解決上述問題本發(fā)明的第三方面的技術(shù)方案是這樣的一種地衣芽胞桿菌用于降解氨氮。優(yōu)選地，所述的地衣芽胞桿菌用于降解蛋白質(zhì)和/或淀粉。優(yōu)選地，所述的地衣芽胞桿菌降解蛋白質(zhì)和淀粉的條件為，溫度為10°C 40°C，pH為4. O 9. O,鹽度為O. 5% 3%,氨氮初始濃度為50mg/L 200mg/L。優(yōu)選地，所述的地衣芽胞桿菌降解蛋白質(zhì)和淀粉的條件，溫度為30°C，pH為7.鹽度為2%，氨氮初始濃度為100mg/L。優(yōu)選地，所述的地衣芽胞桿菌保存號為CCTCCM2011325。說明營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨IOg7NaCl 5g，瓊脂15_20g，水IOOOmL,pH 值 7. 0-7. 2，121°C 滅菌 20min。TCBS配方多價蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母浸出粉5g，硫代硫酸鈉10g，檸檬酸鐵lg，牛膽粉5g，膽酸鈉3g，蔗糖20g，檸檬酸鈉10g，溴麝香草酚藍(lán)0. 04g,麝香草酚藍(lán)0. 04g,瓊脂 14g。篩選培養(yǎng)基葡萄糖5. 0g，(NH4) 2S04 0. 25g, NaCl I. 0g, K2HP04 0. 5g,MgS04 · 7H20 0. 25g，水 1000ml, pH 7. 2，其中氨氮含量約為 50mg/L。大黃魚(Pseudosciaena crocea),于2009年10月-12月隨機(jī)挑選自浙江省寧波市象山海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖場，取樣時測定水溫27°C，海水鹽度26. 8%。。有益效果，本發(fā)明的地衣芽胞桿菌優(yōu)點I、該株地衣芽胞桿菌是從大黃魚腸道中篩選出來的,對海水魚及海水環(huán)境如高鹽度、高壓等有一定的耐受性，用于凈化大黃魚養(yǎng)殖水體或其他海水養(yǎng)殖水體較其他來源菌株有更好的適應(yīng)性；2、該地衣芽胞桿菌的生長與氨氮降解是同步進(jìn)行的，與其他生長率落后于氨氮濃度降低的相比，其具有更高的氨氮吸附效率，具有更大的降解效率。
具體實施例方式為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實施例I地衣芽胞桿菌的篩選首先用75%的酒精對健康大黃魚體表消毒；無菌條件下解剖，取出腸道，75%酒精棉球擦拭腸管外壁，無菌生理鹽水反復(fù)沖洗。制備腸道總菌懸液時(包括腸壁和腸內(nèi)容物)，先用無菌棉線分別結(jié)扎前腸、中腸及后腸部位各取約O. 5cm長的組織混合在一起作為樣品，稱重后按I : 10(w/v)的比例加入滅菌生理鹽水混合，用滅菌勻漿器充分研磨均勻，研磨的樣品設(shè)為10-1，再用滅菌生理鹽水對10-1樣品進(jìn)行倍比稀釋至10-6，各稀釋度樣品均置于漩渦混合儀上振蕩均勻。分別取各稀釋度樣品O. ImL涂布于2種選擇性培養(yǎng)基平板置28°C培養(yǎng)I 2d，分別觀察平板上的菌落特征，挑選出不同特征的菌落，如根據(jù)菌落大小、顏色、透明度、表面光澤度、邊緣形態(tài)等，斜面保藏。將斜面保藏菌種,用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。利用氨化細(xì)菌液體培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，并用奈氏試劑檢驗培養(yǎng)液中NH4+的產(chǎn)生情況，以巨大芽孢桿菌I. 459 (購自CGMCC)作對照，如呈現(xiàn)黃色，說明此種細(xì)菌可將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為NH4+，即可判斷菌株具有氨氮降解功能。以此篩選出降解氨氮能力較強(qiáng)的菌株，編號為X3914。實施例22. I菌種的確認(rèn)采用常規(guī)生理生化反應(yīng)與分子16S rRNA技術(shù)對從大黃魚腸道中篩選出來的菌株X3914進(jìn)行鑒定。測定X3914的16S rRNA共有1511個有效堿基，根據(jù)地衣芽胞桿菌在Genebank中的16S rRNA進(jìn)行分子鑒定；再結(jié)合生理生化反應(yīng)X3914為革蘭氏陽性，桿狀，有芽孢，氧化酶與過氧化氫酶均為陽性，且具運(yùn)動性，進(jìn)一步采用法國生物梅里埃細(xì)菌鑒定儀(參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》)，最終確定X3914為地衣芽胞桿菌。(l)VITEK-32細(xì)菌鑒定儀對菌株X3914的鑒定報告
權(quán)利要求
1.一種地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformi),其特征在于，該地衣芽胞桿菌為 X3914，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO.M2011325。
2.—種權(quán)利要求I的地衣芽胞桿菌的篩選方法，包括如下步驟(1)健康大黃魚體表消毒后，取出腸道，加入滅菌生理鹽水混合研磨，稀釋后分別涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基；(2)將上述兩種培養(yǎng)基平板置于25V 30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I 2d，分別觀察平板上的菌落特征，挑選出不同特征的菌落，用瓊脂培養(yǎng)基斜面保藏；(3)將步驟(2)中的斜面培養(yǎng)的菌落用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，再利用篩選培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)；(4)最后用奈氏試劑檢驗培養(yǎng)液中NH4+的產(chǎn)生情況，以巨大芽孢桿菌I.459作對照，如呈現(xiàn)黃色，說明此種細(xì)菌可將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為NH4+，即可判斷菌株具有氨氮降解功能，即為保存號為CCTCCM2011325的菌株。
3.如權(quán)利要求2所述的地衣芽胞桿菌篩選方法，其特征在于，所述的步驟(I)中，取出腸道稱重后按I : 10 I : 15W/V的比例加入滅菌生理鹽水混合，用用滅菌勻漿器研磨。
4.如權(quán)利要求2所述的地衣芽胞桿菌篩選方法，其特征在于，所述的步驟(2)的平板培養(yǎng)溫度為28 °C。
5.一種權(quán)利要求I的地衣芽胞桿菌用途，所述地衣芽胞桿菌用于降解養(yǎng)殖水體中的氨氮。
6.如權(quán)利要求5所述的地衣芽胞桿菌用途，其特征在于，所述的地衣芽胞桿菌用于降解蛋白質(zhì)和/或淀粉。
7.如權(quán)利要求6所述的地衣芽胞桿菌用途，其特征在于，所述的地衣芽胞桿菌降解蛋白質(zhì)和淀粉的條件溫度為10°C 40°C，pH為4. O 9. 0，鹽度為O. 5% 3%，氨氮初始濃度為 50mg/L 200mg/L。
8.如權(quán)利要求6所述的地衣芽胞桿菌用途，其特征在于，所述的地衣芽胞桿菌降解蛋白質(zhì)和淀粉的條件溫度為30°C，pH為7.鹽度為2%，氨氮初始濃度為100mg/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種地衣芽胞桿菌，其能分泌多種酶類，促進(jìn)動物酶活性并提高動物的免疫力，減少病原菌侵害；此外還能降解養(yǎng)殖水體中的氨氮、殘余餌料蛋白質(zhì)和淀粉，凈化養(yǎng)殖水體。本發(fā)明還提供了一種地衣芽胞桿菌的篩選方法及其降解氨氮的用途。本發(fā)明的地衣芽胞桿菌保存號為CCTCC No.M2011325。
文檔編號C02F101/34GK102925377SQ20111038616
公開日2013年2月13日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者張慶華, 郭婧, 王娟, 封永輝, 張永華, 范斌 申請人:上海海洋大學(xué)