拮抗植物病原菌的生防菌株及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株拈抗植物病原菌的生防菌株及其用途；所述菌株為灰紅鏈霉菌Y1B(Streptomyces?griseoruber?Y1B)CCTCC?N0：M2013358。采用GYM培養(yǎng)基對(duì)該灰紅鏈霉菌Y1B進(jìn)行發(fā)酵，收集發(fā)酵液，萃取并減壓蒸餾，制得發(fā)酵粗產(chǎn)品。該發(fā)酵粗產(chǎn)品，對(duì)水稻紋枯病菌和西瓜枯萎病菌有較好的抑菌效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】拮抗植物病原菌的生防菌株及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物防治和生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株拈抗植物病原菌的生防菌株及其用途 。
【背景技術(shù)】
[0002]伴隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物病蟲(chóng)害防治越來(lái)越依賴(lài)于化學(xué)農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用。但是在化學(xué)農(nóng)藥大量使用的同時(shí)，環(huán)境污染問(wèn)題也隨之而來(lái)，由此人們對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的防治技術(shù)提出了更高的要求。生防農(nóng)藥作為一種新型的綠色農(nóng)藥，以其安全可靠、不污染環(huán)境、抗菌效果好的特點(diǎn)，近年來(lái)受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注，因此尋找有效的生防菌株也成為人們?nèi)找骊P(guān)注的熱點(diǎn)。
[0003]鏈霉菌可以產(chǎn)生多種抗生素，目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素中，約有80%是由放線(xiàn)菌產(chǎn)生，其中又以鏈霉菌屬列居放線(xiàn)菌中最大的菌屬，該屬可產(chǎn)生1000多種抗生素。這些抗生素除了可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，在農(nóng)作物生產(chǎn)方面，還具有植物保護(hù)的用途。
[0004]鏈霉菌是一類(lèi)活躍在植物根際的微生物，土壤中的許多鏈霉菌具有抑制植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，屬于植物根際促生菌。生防農(nóng)藥中大部分是農(nóng)用抗生素，具有毒性低、殘留少的特點(diǎn)，可以有效抑制植物病原菌的生長(zhǎng)和繁殖。因此，鏈霉菌產(chǎn)生的農(nóng)用抗生素在生防農(nóng)藥中占有重要地位，多種鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物被研制成農(nóng)用抗生素在生產(chǎn)上大力推廣，如井R霉素、春雷霉素、中生菌素等在植物病蟲(chóng)害防治方面取得的效果得到了人們的公認(rèn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株拈抗植物病原菌的生防菌株及其用途；通過(guò)發(fā)酵該菌株制備粗產(chǎn)品，對(duì)植物病原菌有較好的防治效果。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0007]第一方面，本發(fā)明涉及一株拈抗植物病原菌的生防菌株，所述菌株為灰紅鏈霉菌YlB(Streptomyces griseoruber YlB)CCTCC NO:M2013358。
[0008]優(yōu)選地，所述灰紅鏈霉菌YlB具有SEQ ID NO:1所示的16SrDNA序列。
[0009]第二方面，本發(fā)明涉及一種上述的拈抗植物病原菌的生防菌株在制備防治植物枯萎病生物農(nóng)藥中的用途。
[0010]第三方面，本發(fā)明涉及一種生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備方法，采用GYM培養(yǎng)基對(duì)如權(quán)利要求1所述的灰紅鏈霉菌YlB進(jìn)行發(fā)酵，收集發(fā)酵液，萃取并減壓蒸餾，即得所述發(fā)酵粗產(chǎn)品。
[0011]優(yōu)選地，每1000mL GYM培養(yǎng)基中含有葡萄糖3~5g、酵母提取物2~6g、麥芽提取物8~12g、余量為水，pH7.0~8.0。
[0012]優(yōu)選地，所述灰紅鏈霉菌YlB是通過(guò)如下步驟獲得的:采集水稻土壤樣品，土樣碾碎后放置在烘箱烘焙，稱(chēng)取烘焙后的土樣溶于無(wú)菌水中，充分振蕩，制成不同濃度的土壤懸浮液，涂布于添加有0.05%~0.25% K2Cr2O7的高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板上，待長(zhǎng)出菌落后，挑單菌落于SFM固體培養(yǎng)基上純化，即得灰紅鏈霉菌YlB (Streptomyces griseoruber YlB)CCTCC NO:M2013358o
[0013]優(yōu)選地，每1000mL高氏I號(hào)培養(yǎng)基中含有可溶性淀粉10~30g、KN030.8~1.2g、K2HPO40.3 ~0.6g、MgSO4.7Η200.4 ~0.8g、FeSO4.7Η200.008 ~0.012g、NaC10.4 ~0.6g、瓊脂18~24g、余量為水，ρΗ7.0~8.0。
[0014]優(yōu)選地，每1000mL SFM培養(yǎng)基的制備包括如下步驟:取15~25g黃豆餅粉，加蒸餾水沸水煮20~40min，過(guò)濾黃豆餅粉液體，濾液中加甘露醇15~25g，固體培養(yǎng)基另加瓊脂18~25g，蒸餾水定容至1000mL, ρΗ7.0~8.0。
[0015]第四方面，本發(fā)明涉及一種上述的制備方法制得的生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品在制備防治植物枯萎病生物農(nóng)藥中的用途。
[0016]優(yōu)選地，所述植物枯萎病為水稻枯萎病菌或西瓜枯萎病菌。
[0017]本發(fā)明具有的有益效果為:本發(fā)明制得的拈抗植物病原菌的生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品，對(duì)水稻紋枯病菌和西瓜枯萎病菌有較好的抑菌效果，相對(duì)抑菌率分別達(dá)到47.1%和30.9%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0019]圖1為本發(fā)明菌株灰紅鏈霉菌YlB(Streptomyces griseoruber YlB)的菌落形態(tài)圖；
[0020]圖2為本發(fā)明菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022]本發(fā)明的灰紅鏈霉菌YlB (Streptomyces griseoruber YlB),該菌株已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)保藏，保藏單位地址為:中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編為:430072，保藏日期為:2013年8月I日，保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M2013358。
[0023]本發(fā)明菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、16SrDNA序列和菌種分類(lèi)結(jié)果如下:
[0024]1、形態(tài)特征和培養(yǎng)特征:灰紅鏈霉菌YlB革蘭氏染色呈陽(yáng)性，孢子橢圓形，孢子絲緊密螺旋形。在SFM固體培養(yǎng)基上形成圓形灰色菌落，菌落表面凸起，光滑干燥，菌落可產(chǎn)生紅色色素(如圖1所示)。
[0025]2、本發(fā)明所述的灰紅鏈霉菌YlB的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0026]圖2為本發(fā)明菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，根據(jù)菌落形態(tài)和16SrDNA序列分析,該菌株屬于灰紅鏈霉菌(Streptomyces griseoruber),故命名為灰紅鏈霉菌Y1B。
[0027]本發(fā)明的菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備方法具體如下:[0028]1、菌株的獲得:從江蘇省無(wú)錫市采集水稻土壤樣品若干，將土樣碾碎后，放置在50°C~70°C烘箱烘焙30~60min。稱(chēng)取烘焙后的土樣溶于無(wú)菌水中，充分振蕩,制成不同濃度梯度的土壤懸浮液，涂布于添加有0.05%~0.25% K2Cr2O7的高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板上，在28°C~32°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~10天。挑單菌落于SFM固體培養(yǎng)基上純化，得到灰紅鏈霉菌 YlB (Streptomyces griseoruber YlB), CCTCC M2013358。
[0029]2、生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備:用SFM固體培養(yǎng)基活化冷凍保藏的CCTCCM2013358菌株，然后將上述培養(yǎng)物接種到SFM液體培養(yǎng)基搖瓶中，28°C~32°C條件下培養(yǎng)2~3天，作為種子液；再將種子液按1%~5%的接種量接種到GYM培養(yǎng)基搖瓶中，28°C~32°C條件下發(fā)酵6~8天。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心收集發(fā)酵上清液，用乙酸乙酯等體積萃取發(fā)酵上清液，合并收集有機(jī)相，減壓蒸餾有機(jī)相，濃縮蒸干后，得到發(fā)酵粗產(chǎn)品。具體見(jiàn)以下各實(shí)施例:[0030]實(shí)施例1
[0031]菌株的獲得:從江蘇省無(wú)錫市采集水稻土壤樣品若干，將土樣碾碎后，放置在60°C烘箱烘焙30min。稱(chēng)取烘焙后的土樣5g加入盛有45mL無(wú)菌水的搖瓶中，振蕩30min,制成KT1濃度的土壤懸浮液，將土壤懸浮液充分混勻，依次稀釋制成10_2、10_310_4、?ο-5濃度的土壤懸浮液。然后分別取10_2、10_3、10_4、10_5濃度的土壤懸浮液各200 μ L，涂布于添加有
0.1% K2Cr2O7的高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板上，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。挑單菌落于SFM固體培養(yǎng)基上純化,得到灰紅鏈霉菌YlB (Streptomyces griseoruber YlB)。
[0032]上述各種培養(yǎng)基的組分分別為:
[0033]高氏I 號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉 20g, KNO3Ig, K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.5g，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g, NaCl0.5g,瓊脂 20g,蒸餾水定容至 1000mL, ρΗ7.2 ~7.4。
[0034]SFM培養(yǎng)基:取20g黃豆餅粉，加蒸餾水沸水煮30min，用紗布過(guò)濾，濾液中加甘露醇20g，固體培養(yǎng)基另加瓊脂20g，蒸餾水定容至lOOOmL，pH7.2~7.3。
[0035]實(shí)施例2
[0036]生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備:用SFM固體培養(yǎng)基活化冷凍保藏的CCTCC M2013358菌株，然后將上述培養(yǎng)物接種到SFM液體培養(yǎng)基搖瓶中，280C、180rpm條件下培養(yǎng)2天，作為種子液；再將種子液按2%的接種量接種到GYM培養(yǎng)基搖瓶中，28°C、180rpm條件下發(fā)酵7天。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心收集發(fā)酵上清液，用乙酸乙酯等體積萃取發(fā)酵上清液3次，合并收集有機(jī)相，40 V減壓蒸餾有機(jī)相，濃縮蒸干后，得到發(fā)酵粗產(chǎn)品。
[0037]上述GYM培養(yǎng)基的組分為:葡萄糖4g，酵母提取物4g，麥芽提取物10g，蒸餾水定容至 1000mL, ρΗ7.2。
[0038]實(shí)施例3
[0039]生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品對(duì)植物病原菌的抑制作用:稱(chēng)取適量粗產(chǎn)品溶于二甲基亞砜(DMSO),配制成1000mg / L的溶液,按一定比例加入融化好的PDA培養(yǎng)基中，混合后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，分別制成粗產(chǎn)品終濃度為50mg / L的PDA培養(yǎng)基平板；同時(shí)，分別將等體積的無(wú)菌水和DMSO溶劑添加到融化好的PDA培養(yǎng)基中，混合后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，制成空白對(duì)照平板和溶劑對(duì)照平板。用直徑為8mm的打孔器打取水稻紋枯病菌和西瓜枯萎病菌的菌餅，接種到上述各平板中央，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，用十字交叉法測(cè)定各平板菌落的生長(zhǎng)直徑，按以下公式計(jì)算相對(duì)抑菌率(初始接種的菌落直徑為8mm):[0040]
相對(duì)抑菌率("O DMSO溶劑對(duì)照的菌落直徑-添加粗提物的菌落直徑
— 空白對(duì)照的菌落直徑-初始接種的菌落直徑
[0041]結(jié)果表明，本發(fā)明所述的生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品，對(duì)水稻紋枯病菌和西瓜枯萎病菌有較好的抑制作用，相對(duì)抑菌率分別達(dá)到47.7%和31.0 %。
[0042]PDA培養(yǎng)基:取200g去皮馬鈴薯，切成小塊后沸水煮30min，用紗布過(guò)濾，濾液中加葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1000mL,自然pH值。
[0043]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一株拈抗植物病原菌的生防菌株，其特征在于，所述菌株為灰紅鏈霉菌YlB (Streptomyces griseoruber YlB)CCTCC NO:M2013358。
2.如權(quán)利要求1所述的拈抗植物病原菌的生防菌株，其特征在于，所述灰紅鏈霉菌YlB具有SEQ ID NO:1所示的16SrDNA序列。
3.—種如權(quán)利要求1所述的拈抗植物病原菌的生防菌株在制備防治植物枯萎病生物農(nóng)藥中的用途。
4.一種生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備方法，其特征在于，采用GYM培養(yǎng)基對(duì)如權(quán)利要求1所述的灰紅鏈霉菌YlB進(jìn)行發(fā)酵，收集發(fā)酵液，萃取并減壓蒸餾，即得所述發(fā)酵粗產(chǎn)品。
5.如權(quán)利要求4所述的生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備方法，其特征在于，每1000mLGYM培養(yǎng)基中含有葡萄糖3~5g、酵母提取物2~6g、麥芽提取物8~12g、余量為水，pH7.0~8.0。
6.如權(quán)利要求4或5所述的生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備方法，其特征在于，所述灰紅鏈霉菌YlB是通過(guò)如下步驟獲得的:采集水稻土壤樣品，土樣碾碎后放置在烘箱烘焙，稱(chēng)取烘焙后的土樣溶于無(wú)菌水中，充分振蕩，制成不同濃度的土壤懸浮液，涂布于添加有0.05%~0.25% K2Cr2O7的高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板上，待長(zhǎng)出菌落后，挑單菌落于SFM固體培養(yǎng)基上純化，即得灰紅鏈霉菌 YlB (Sti^ptomyces griseoruber YlB) CCTCC NO:M2013358。
7.如權(quán)利要求6所述的生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備方法，其特征在于，每1000mL高氏I號(hào)培養(yǎng)基中含有可溶性淀粉10~30g、KNO30.8~1.2g、K2HPO40.3~0.6g、MgSO4.7Η200.4 ~0.8g、FeSO4.7Η200.008 ~0.012g、NaCl0.4 ~0.6g、瓊脂 18 ~24g、余量為水，pH7.0~8.0。
8.如權(quán)利要求6所述的生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品的制備方法，其特征在于，每1000mLSFM培養(yǎng)基的制備包括如下步驟:取15~25g黃豆餅粉，加蒸餾水沸水煮20~40min，過(guò)濾黃豆餅粉液體，濾液中加甘露醇15~25g，固體培養(yǎng)基另加瓊脂18~25g，蒸餾水定容至1000mL, ρΗ7.0 ~8.0。
9.一種如權(quán)利要求4所述的制備方法制得的生防菌株發(fā)酵粗產(chǎn)品在制備防治植物枯萎病生物農(nóng)藥中的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于,所述植物枯萎病為水稻枯萎病菌或西瓜枯萎病菌。
【文檔編號(hào)】A01P1/00GK103642725SQ201310627298
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】王威, 惠俊淵, 張雪洪 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)