一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的再生培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物生物【技術領域】。本發(fā)明具體地公開了一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的再生培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。所述再生培養(yǎng)基是根據(jù)不同倍性和不同來源的紫錐菊外植體對己酸二乙氨基乙醇酯（DA-6）的敏感性的不同，在MS配方中除了添加15～60g/L蔗糖、3～9g/L瓊脂、0.1～1.5mg/LBA和0.01～0.2mg/LNAA之外，還特別地添加相應濃度的DA-6。所述再生培養(yǎng)基通過添加DA-6促使BA誘導不定芽再生的效果得到顯著增強。本發(fā)明可有效克服紫錐菊再生培養(yǎng)中不同基因型限制問題，大幅提高不定芽再生效率，促進紫錐菊生物技術育種相關科研工作的開展。
【專利說明】一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的再生培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物【技術領域】，具體地，涉及一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的再生培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
【背景技術】[0002]紫錐菊{(diào)Echinacea purpurea L.)為菊科多年生草本植物,具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，其提取物是近年來在國際上受到普遍重視的一種免疫促進劑和免疫調(diào)節(jié)劑。由于其確切的功效作用，紫錐菊已經(jīng)成為一種世界著名的藥用植物。人們?yōu)榱双@得多種品種的紫錐菊，已經(jīng)嘗試將多種生物技術手段應用于其上，如轉(zhuǎn)基因、花藥培養(yǎng)、染色體加倍。這些目的的達成，都必須經(jīng)過一個共同的步驟，即誘導培養(yǎng)物，產(chǎn)生不定芽。雖然現(xiàn)有技術中已有很多研究針對紫錐菊不定芽再生而展開，但其再生效率并不理想。
[0003]現(xiàn)有技術中，在紫錐菊外植體誘導不定芽再生時，通常采用是含有15~60 g/L蔗糖，0.1~1.5 mg/L BA及O~0.15 mg/L NAA,以3~9 g/L瓊脂固化的MS培養(yǎng)基，在這種再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，不同基因型紫錐菊外植體的不定芽再生效率差異很大，除了部分基因型能夠獲得較合適再生效率外，其余大量基因型的再生效率很低，芽體的質(zhì)量也較差，嚴重制約了紫錐菊轉(zhuǎn)基因、花藥培養(yǎng)、染色體加倍等植物生物技術研究的開展，限制了紫錐菊生物技術育種工作的進行。
[0004]己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，通常用于田間栽培，很少用于組織培養(yǎng)。而且還沒有人嘗試將其用于紫錐菊組織栽培方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術中紫錐菊外植體再生不定芽時再生率低、再生芽體質(zhì)量差的缺陷，提供一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的再生培養(yǎng)基。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的方法。
[0007]本發(fā)明通過以下技術方案予以實現(xiàn)上述目的:
一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的再生培養(yǎng)基，其特征在于，紫錐菊外植體所需的再生培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的中除了添加15~60 g/L蔗糖、3~9 g/L瓊脂、0.1~1.5 mg/L BA和0.01~0.15 mg/L的NAA之外，還特別地添加了己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)。
[0008]所述紫錐菊外植體根據(jù)倍性和來源的不同分為二倍體、三倍體、四倍體或六倍體紫錐菊葉片、葉柄或根外植體。
[0009]二倍體或三倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.32 mg/L ;四倍體或六倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為 0.01 ~0.16 mg/L ；
二倍體或三倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.16 mg/L ;四倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01 mg/L ；六倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08~0.16 mg/L ；二倍體或三倍體紫錐菊根外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01 mg/L ；四倍體紫錐菊根外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.16 mg/L0
[0010]優(yōu)選的，所述二倍體或三倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08~0.16 mg/L ;更優(yōu)選地，所述二倍體或三倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.16 mg/L。所述四倍體或六倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08~0.16 mg/L，更優(yōu)選地，四倍體或六倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08 mg/L0
[0011]優(yōu)選的，所述二倍體或三倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.08 mg/L ;更優(yōu)選地，所述二倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08 mg/L ;所述三倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01 mg/L。優(yōu)選地，所述六倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的 DA-6 的量為 0.16 mg/L。
優(yōu)選地,所述四倍體紫錐菊根外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.08mg/L ;更優(yōu)選地，所述四倍體紫錐菊根外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01 mg/Lo
[0012]一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的培養(yǎng)方法，根據(jù)如上所述不同倍性和來源的紫錐菊外植體所需的再生培養(yǎng)基的組分的需要，將不同類型的紫錐菊外植體接種在各自適宜的再生培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±4 °C，光照強度為1000~2500 lx，光照時間為10~16 h/d,的條件下培養(yǎng)18~60 d0所述接種的方式為橫放方式，即使葉柄外植體的橫切面與培養(yǎng)基的水平表面相垂直。
`[0013]己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，通常用于田間栽培，很少用于組織培養(yǎng)。而且還沒有人嘗試將其用于紫錐菊組織栽培方面。發(fā)明人對某些特殊種質(zhì)材料(各種不同倍性的紫錐菊)進行微繁殖時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物對DA-6的加入非常敏感，而且在某些濃度下，不定芽的再生效率顯著提升了。所以本發(fā)明主要研究了 DA-6對紫錐菊不定芽再生的影響相關實驗。
[0014]本發(fā)明考察了在培養(yǎng)基中加入己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)對紫錐菊外植體不定芽再生的影響。本發(fā)明使用了 3種來源的外植體:葉片、葉柄和根外植體。其中葉片外植體所需最佳DA-6濃度最高。根外植體需要的濃度最低。在四種不同倍性的外植體上進行試驗，高倍性的外植體對DA-6更敏感:低倍性的外植體需要的DA-6濃度更高一點。對低倍性的外植體適合的DA-6濃度，可能會抑制高倍性外植體產(chǎn)生不定芽。本發(fā)明的結(jié)果顯示，恰當使用DA-6，紫錐菊不同外植體的不定芽的再生可以顯著提升。
[0015]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明解決了通常紫錐菊不定芽再生培養(yǎng)中再生效率不高和再生芽質(zhì)量不夠好的突出問題，對于紫錐菊的生物技術研究特別是對于不能夠產(chǎn)生種子但具有更高種植價值的三、四、六倍體的種苗克隆具有重要的可直接應用的價值。
[0016]說明書附圖
圖1.不同DA-6濃度對二倍體外植體再生不定芽的影響；1~5分別是用0、0.01、0.08、0.16,0.32 mg/L的DA-6處理的二倍體葉片外植體；6~10分別是用0、0.01,0.08,0.16、0.32 mg/L的DA-6處理的二倍體葉柄外植體；11~15分別是用0、0.01,0.08,0.16,0.32mg/L的DA-6處理的二倍體根外植體。
[0017]圖2.不同DA-6濃度對三倍體外植體再生不定芽的影響；1~5分別是用0、0.01、0.08,0.16,0.32 mg/L的DA-6處理的三倍體葉片外植體；6~10分別是用0、0.01,0.08、0.16,0.32 mg/L的DA-6處理的三倍體葉柄外植體;11~15分別是用0,0.01,0.08,0.16、0.32 mg/L的DA-6處理的三倍體根外植體。
[0018]圖3.不同DA-6濃度對四倍體外植體再生不定芽的影響；1~5分別是用0、0.01、0.08,0.16,0.32 mg/L的DA-6處理的四倍體葉片外植體；6~10分別是用0、0.01,0.08、0.16,0.32 mg/L的DA-6處理的四倍體葉柄外植體;11~15分別是用0,0.01,0.08,0.16、0.32 mg/L的DA-6處理的四倍體根外植體。
[0019]圖4.不同DA-6濃度對六倍體外植體再生不定芽的影響；1~5分別是用0、0.01、0.08,0.16,0.32 mg/L的DA-6處理的六倍體葉片外植體；6~10分別是用0、0.01,0.08、0.16,0.32 mg/L的DA-6處理的六倍體葉柄外植體;11~15分別是用0,0.01,0.08,0.16、0.32 mg/L的DA-6處理的六倍體根外植體。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明，實施例將幫助更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于下述實施例。除非特別說明，實施例中采用的試劑和方法為本領域常規(guī)使用的試劑和方法。
[0021]植物材料:本發(fā)明所述二倍體、四倍體紫錐菊是發(fā)明人通過早前研究獲得的；二倍體、四倍體紫錐菊的獲得方法可參考Nilanthi D, Chen X L, Zhao F C，et al.1nduction of tetraploids from petiole explants through colchicine treatments inEchinacea purpurea L[J].BioMed Research International, 2009, 2009.。三倍體紫錐菊是將二倍體和四倍體雜交獲得。六倍體是將三倍體外植體用秋水仙素處理加倍后誘導不定芽獲得(將三倍體外植體用秋水仙素處理加倍后誘導不定芽獲得六倍體紫錐菊的方法可參考本領域常規(guī)技術)。這些植株的倍性均已通過根尖染色體計數(shù)技術進行了鑒定。所有以上材料的無菌紫錐菊苗均在含有30 g/L蔗糖、0.01 mg/L NAA、以3~9 g/L瓊脂固化的MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±4°C，光照強度為1000~2500 lx，光照時間為10~16h/d的條件下培養(yǎng)。
[0022]實施例1:
S1.外植體準備:用剪刀從組培的完整紫錐菊苗上剪取葉片、葉柄和根各若干個。不同倍性的葉片、葉柄和根來自不同倍性的組培完整無菌苗。自來水沖洗所采葉片、葉柄和根30 min后，在超凈工作臺上把所有的葉片、葉柄和根置于一個容量為1000 mL的玻璃燒杯中，向該燒杯中加入75%乙醇溶液至浸沒所有的葉片、葉柄和根為止，I min后，倒掉乙醇溶液，保留葉片、葉柄和根；再向該燒杯中加入2%次氯酸鈉溶液至浸沒所有的葉片、葉柄和根為止，20 min后，倒掉次氯酸鈉溶液，保留葉片、葉柄和根；再向該燒杯中加入無菌蒸餾水至浸沒所有的葉片、葉柄和根為止，漂洗葉片、葉柄和根2 min后，倒掉蒸餾水，保留葉片、葉柄和根。用無菌水漂洗葉片、葉柄和根5次后，用滅過菌的鑷子把所有的葉片、葉柄和根放置在無菌吸水紙上，待葉片、葉柄和根表面干燥后，用滅過菌的手術刀對葉片、葉柄和根進行切割，按以下規(guī)格切割:葉片面積:0.6 cm2,葉柄、根長度:0.8 cm,獲得葉片、葉柄和根外植體。
[0023]S2.將二倍體的紫錐菊葉片、葉柄和根外植體分別接種到含有不同濃度DA-6 (O、0.01,0.08,0.16,0.32 mg/L)的再生培養(yǎng)基上(再生培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基的中添加30 g/L蔗糖、4.5 g/L瓊脂、0.3 mg/L BA和0.01 mg/L NAA)。試驗不定芽誘導再生的情況。
[0024]上述含有不同濃度DA-6 (0,0.01,0.08,0.16,0.32 mg/L)的再生培養(yǎng)基培養(yǎng)基配置方法具體為:先在MS培養(yǎng)基的中添加30 g/L蔗糖、4.5 g/L瓊脂、0.3 mg/L BA和0.01mg/L NAA，將以上成分配置好后，高壓滅菌，待培養(yǎng)基室溫冷卻到不燙手時在無菌操作臺中加入用無菌水配置好的各濃度的DA-6，使再生培養(yǎng)基中DA-6的終濃度為(0、0.01,0.08、0.16 或 0.32 mg/L)。
[0025]不定芽誘導再生的培養(yǎng)條件為將不同類型的紫錐菊外植體接種在各自適宜的再生培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±4°C，光照強度為1000~2500 lx，光照時間為10~16 h/d的條件下培養(yǎng)35 d。
[0026]從表1和圖1可知，適合濃度的DA-6能夠顯著提升全部3種外植體的不定芽誘導率。葉片獲得最佳誘導率的DA-6濃度(0.16 mg/L)高于葉柄和根的。而且在濃度最高為0.32 mg/L時，葉片外植體誘導產(chǎn)生不定芽的效率也沒有被抑制。這個濃度下(0.32 mg/L)已經(jīng)對葉柄外植體產(chǎn)生了 22%的抑制，而根外植體基本不產(chǎn)生不定芽。
[0027]表1不同濃度DA-6對二倍體外植體再生不定芽的影響
【權利要求】
1.一種高效的紫錐菊不定芽再生再生培養(yǎng)基，其特征在于，在MS配方的基礎上除了添加 15 ~60 g/L 鹿糖、3 ~9 g/L 瓊脂、0.1 ~1.5 mg/L BA 和 0.01 ~0.2 mg/L NAA 之外，還特別地添加了己酸二乙氨基乙醇酯，即DA-6。
2.根據(jù)權利要求1所述再生培養(yǎng)基所使用的外植體，其特征在于，外植體為二倍體、三倍體、四倍體或六倍體紫錐菊葉片、葉柄或根外植體。
3.根據(jù)權利要求1和2所述再生培養(yǎng)基和外植體，其特征在于，所述二倍體或三倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.32 mg/L ;四倍體或六倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.16 mg/L ； 二倍體或三倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.16 mg/L ;四倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01 mg/L ；六倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08~0.16 mg/L ； 二倍體或三倍體紫錐菊根外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01 mg/L ；四倍體紫錐菊根外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.16 mg/L0
4.根據(jù)權利要求3所述再生培養(yǎng)基，其特征在于，所述二倍體或三倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08~0.16 mg/L ;四倍體或六倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08~0.16 mg/L。
5.根據(jù)權利要求4所述再生培養(yǎng)基，其特征在于，所述二倍體或三倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.16 mg/L ;四倍體或六倍體紫錐菊葉片外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08 mg/L0
6.根據(jù)權利要求2所述再生培養(yǎng)基，其特征在于，所述二倍體或三倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加`的DA-6的量為0.01~0.08 mg/L ;六倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.16 mg/L0
7.根據(jù)權利要求6所述再生培養(yǎng)基，其特征在于，所述二倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.08 mg/L ;所述三倍體紫錐菊葉柄外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01 mg/L。
8.根據(jù)權利要求2所述再生培養(yǎng)基，其特征在于，所述四倍體紫錐菊根外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01~0.08 mg/L。
9.根據(jù)權利要求8所述再生培養(yǎng)基，其特征在于，所述四倍體紫錐菊根外植體所需的再生培養(yǎng)基中添加的DA-6的量為0.01 mg/L0
10.一種提高紫錐菊外植體再生不定芽的培養(yǎng)方法，其特征在于，根據(jù)權利要2所述不同倍性和來源的紫錐菊外植體所需的再生培養(yǎng)基的組分的需要，將不同類型的紫錐菊外植體接種在各自適宜的再生培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±4 °C，光照強度為1000~2500 Ix,光照時間為10~16 h/d的條件下培養(yǎng)18~60 d。
【文檔編號】A01H4/00GK103477985SQ201310406857
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權日:2013年9月9日
【發(fā)明者】陳曉鷺, 楊躍生, 吳鴻, 李棟梁 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學