水稻組成型啟動子及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及到一種水稻組成型表達啟動子，含有該啟動子的植物表達載體和轉(zhuǎn)化子，本發(fā)明還涉及上述啟動子在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種水稻組成型表達啟動子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。發(fā)明人將含有該啟動子DNA序列和GUS基因的植物表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)染色鑒定，GUS基因在水稻各個組織和器官中均有表達，因此本發(fā)明提供的啟動子能夠驅(qū)動外源基因在植物中組成型表達，從而培育出理想的、品質(zhì)更加優(yōu)良的水稻品種。
【專利說明】水稻組成型啟動子及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種水稻組成型表達啟動子及其應(yīng)用，該啟動子能夠在水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中驅(qū)動目標基因的表達。
【背景技術(shù)】[0002]水稻是分子生物學(xué)研究的模式植物之一，也是世界上最重要的糧食作物之一。而組成型啟動子為植物基因工程中應(yīng)用最早、最為廣泛的一類啟動子。所謂組成型啟動子即是在所有組織器官和發(fā)育階段都能夠啟動基因表達的啟動子，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性，RNA和蛋白質(zhì)表達量也是相對恒定的。
[0003]目前植物基因工程中普遍使用的組成型啟動子主要為花椰菜花葉病毒CaMV的35S啟動子、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因NOS啟動子，以及玉米泛素蛋白Ubiquitin啟動子?；ㄒ嘶ㄈ~病毒CaMV的35S啟動子，是植物基因工程現(xiàn)階段仍在廣泛使用的組成型啟動子之一，但是CaMV35S啟動子具有潛在的增強子的作用，由于其被廣泛的用于做篩選標記的啟動子，所以很容易導(dǎo)致其它組織特異性表達啟動子的特異性喪失(Singer et al.，2011)。除此之外，在單子葉植物中，CaMV35S啟動子的表達強度比Ubiquitin啟動子要低一些。至于根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的胭脂堿合成酶基因Nos啟動子和章魚堿合成酶基因Ocs啟動子，它們雖然來自細菌，但都具有植物啟動子的特性，比如Clontech公司開發(fā)的PBI系列載體就是用Nos啟動子來驅(qū)動報告基因表達的。
[0004]水稻actin I (Act I)啟動子在單子葉植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中也被廣泛運用。另一種研究和使用廣泛的組成型啟動子是Ubiquitin類啟動子,此類啟動子在單子葉植物中表達穩(wěn)定，強度高，正越來越多地被運用到植物基因工程中，目前有文獻報道的有玉米來源的 Ubiquitin 啟動子(Chrisetnse et al.，1992)、大豆來源的 poly-ubiquitin 啟動子(Hernandez-Garcia et al.，2009)、水稻來源的 poly-ubiquitin(Bhattacharyya etal., 2012)啟動子和 Switchgrass 來源的 poly-ubiquitin 啟動子(Mann et al., 2012)等。
[0005]在轉(zhuǎn)基因育種或用于研究基因功能時，為了充分發(fā)揮外源基因表達產(chǎn)物的功能一般都使用組成型啟動子使外源基因在植物中高效、穩(wěn)定、持久地表達。一方面，為了精確的控制目的基因的表達水平；另一方面，為了避免同時使用同一個類型啟動子驅(qū)動多個外源基因而導(dǎo)致基因沉默或共抑制的現(xiàn)象，需要不同的啟動子。目前，一些新的組成型啟動子也被陸續(xù)分離出來并得到運用，如帶了轉(zhuǎn)運肽的ibAGPl啟動子(Kwak et al.，2007)在雙子葉植物的轉(zhuǎn)化方面就有很強的優(yōu)勢，油棕櫚來源的TCTP基因啟動子在油棕櫚的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中就有很好的運用前景(Masura et al.，2011)。在過去的十年中，從水稻中已獲得了大量優(yōu)良的功能基因，而對組成型啟動子的報道卻相對較少，其數(shù)量遠遠不能匹配基因數(shù)量的增長。眾所周知，水稻是我國的主糧之一，因此，分離鑒定天然或者人工合成組成型啟動子對我國水稻轉(zhuǎn)基因育種具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明旨在提供一種驅(qū)動外源基因在水稻各部位組成型表達的啟動子并獲得含有該啟動子序列的轉(zhuǎn)化子、植物表達載體、宿主菌，以及所述啟動子、轉(zhuǎn)化子、植物表達載體、宿主菌的應(yīng)用 。
[0007]本發(fā)明所提供的水稻組成型表達啟動子，來源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare),其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或者為下述之一:
[0008]具有SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列；
[0009]具有在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或
[0010]一個以上的核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物，并與SEQ ID N0:1
[0011]所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
[0012]具體而言，發(fā)明人從日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分離克隆得到基因啟動子序列，其結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的2100bp的DNA序列，將稱之為pCON啟動子。
[0013]在本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案中，提供一種重組載體，其通過將包含上述核苷酸序列的組成型啟動子與載體相結(jié)合而構(gòu)成。
[0014]在本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案中，提供一種轉(zhuǎn)化子，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化子含有上述水稻組成型表達啟動子PCON或植物表達載體及宿主。
[0015]在本發(fā)明的另一種優(yōu)選技術(shù)方案中，所述轉(zhuǎn)化子為細胞系、愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。
[0016]在本發(fā)明的另一種優(yōu)選技術(shù)方案中，提供一種宿主菌，其含有所述啟動子、或者含有所述的植物表達載體，其中，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。
[0017]在本發(fā)明的另一種優(yōu)選技術(shù)方案中，提供了所述植物組成型表達啟動子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)基因植物為水稻。
[0018]在本發(fā)明的另一種優(yōu)選技術(shù)方案中，提供了一種上述技術(shù)方案中的組成型表達啟動子的在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用，其中，將所述啟動子與目標基因融合，轉(zhuǎn)化到植物細胞、植物組織或植物器官中，并將相應(yīng)植物培育成植株，實現(xiàn)目標基因在植物中各個部位表達，從而達到對植物品質(zhì)的改良。優(yōu)選地，所述植物為水稻。
[0019]本發(fā)明的具體內(nèi)容是:
[0020]從日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分離克隆得到基因啟動子序列，其結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的2100bp的DNA序列，我們稱之為pCON啟動子，該序列經(jīng)酶切后連接到植物雙元表達載體PCAMBIA1381上，利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進行組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株整體上的Gus基因表達水平較高，各個組織和器官都顯藍色，證明該2100bp啟動子序列具有驅(qū)動基因表達的活性。
[0021]本發(fā)明提供的啟動子序列可與植物雙元表達載體連接，可以與所需的靶標基因鏈接，構(gòu)建重組植物表達載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后可驅(qū)動靶標基因在水稻中的組成型表達，提高外源基因在植物中的表達量，增加轉(zhuǎn)基因的效果，對作物性狀產(chǎn)生積極的影響。
[0022]本發(fā)明的技術(shù)效果表明，所克隆的水稻啟動子pCON能夠調(diào)控基因在水稻各個組織和器官均有表達，在實際應(yīng)用中具有一定的價值，在轉(zhuǎn)基因育種或用于研究基因功能時，為了充分發(fā)揮外源基因表達產(chǎn)物的功能一般都使用組成型啟動子使外源基因在植物中高效、穩(wěn)定、持久地表達。組成型啟動子在植物基因工程的研究中發(fā)揮著巨大的作用，并且在研究未知基因的功能如過量表達該基因方面仍然有很大的價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1中的A部分為植物表達載體PCAMBIA1381的示意圖；
[0024]圖1中的B部分為利用pCON啟動子驅(qū)動⑶S表達的載體pCAMBIA1381_pC0N示意圖。
[0025]圖2A-C為利用pCON啟動子驅(qū)動Gus基因表達情況的分析，其中，圖2A為野生型水稻各部位Gus染色結(jié)果，圖2B為35S染色結(jié)果，圖2C為pC0N_pCAMBIA1381轉(zhuǎn)基因水稻各部位Gus染色結(jié)果；并且，在圖2A-2C中的字母所表示的部分如下:A表示根、B表示莖、C表示葉、D表示葉鞘、E表示葉枕、F表示花、G表示種子、H表示胚乳橫切面。
【具體實施方式】
[0026]現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0027]實施例1、含有酶切位點的pCON啟動子的獲得
[0028]步驟1、引物的設(shè)計
[0029]根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中提供的水稻品種日本晴(Oryza sativaL cv.Nipponbare)全基因組序列，依據(jù)水稻pCON基因的上游2IOObp序列設(shè)計擴±曾引物，并根據(jù)選用的載體及靶標基因的特點，設(shè)計引物的酶切位點，在本實施例中以水稻雙元表達載體PCAMBIA1381 (來自于CAMBIA，公開使用載體，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗測試中心水稻組保存)為例，靶標基因為Gus基因，具體設(shè)計的引物為:正向引物5’端帶E.coRI,酶切位點(GAATTC),反向引物5’端帶Hindlll，酶切位點酶切位點(AAGCTT),引物序列如下:
[0030]正向引物:GAATTCTCGATACGATCATCGGGGTTGT E.coRI
[0031]反向引物:AAGCTTGACGGCGGCGAGCTATTGGCGG HindIII
[0032]由深圳華大基因公司合成。
[0033]步驟2、啟動子pCON的獲得
[0034]以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、正向引物擴增啟動子pCON，按常規(guī)PCR體系，擴增程序如下:
[0035]95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，58°C退火 30s, 72°C延伸 2min30s，35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0
[0036]回收PCR擴增的目的片段，目的片段長度2100bp，并連接到T載體上，按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，再經(jīng)菌落PCR篩選獲得陽性克隆，然后，挑取單克隆搖菌液提質(zhì)粒，用E.coRI和HindIII進行雙酶切驗證。驗證正確的克隆即為所要獲得的啟動子pCON，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0037]實施例2、植物表達載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
[0038]將實施例1獲得的克隆中提取質(zhì)粒，用E.coRI和HindIII雙酶切，回收啟動子pCON片段。同時用E.coRI和HindIII雙酶切回收pCAMBIA1381片段，將上述的兩個片段用T4連接酶進行連接，得到啟動子pCON與Gus基因融合的植物表達載體pCAMBIA1381-pC0N(如圖1),利用凍融法將該植物表達載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，提取陽性質(zhì)粒，用E.coRI和HindIII進行酶切驗證。[0039]對照:轉(zhuǎn)CaMV35S:gus作為正對照，同時以Tnos:gus作為負對照。利用凍融法將表達載體pCAMBIA1381轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105,操作步驟及驗證同pCAMBIA1381-pC0N的轉(zhuǎn)化方法。
[0040]實施例3、利用啟動子pCON驅(qū)動Gus報告基因在水稻中表達
[0041]步驟1:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
[0042]成熟種子去掉穎殼后，用70%酒精浸泡種子lmin，倒掉酒精。用含有I滴Tween20的50%次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4%)溶液浸泡種子40min (150r/min)。倒掉次氯酸鈉，無菌水洗5遍至溶液澄清，無次氯酸鈉味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀沿種子的糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。30°C暗培養(yǎng)Ild后將愈傷與胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態(tài)良好、分裂旺盛的初級愈傷組織進行預(yù)培養(yǎng)3~5d后用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生等參照Yongbo Duan(Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al.An efficient and high-throughput protocolfor Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.D0I10.1007/s00299-012-1275-3.)等中描述的方法。
[0043]共獲得43 株 pC0N-pCAMBIA1381 植株，26 株 35S_pCAMBIA1381 植株和 38 株Tnos-pCAMBIA1381 植株。
[0044]步驟2、⑶S組織化學(xué)染色
[0045]參照Jefferson (Jefferson RA et al.GUS fusion: β -Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6:3901-3907)等的方法，將需要染色的組織抽真空，然后浸入染色液中，37°C染色24h。脫色時在37°C條件下用95%乙醇處理，至陰性對照材料呈白色。
[0046]通過⑶S組織染色，檢測啟動子pCON在水稻轉(zhuǎn)基因植株中對⑶S的啟動活性。結(jié)果顯示，正對照CaMV35S:gus轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉等各組織均有明顯染色(圖2A);而負對照Tnos::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株各組織中，均未檢測到Gus基因的活性(圖2B) ；pC0N::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株各組織器官經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍色，且染色與正對照CaMV35S:gus的轉(zhuǎn)基因植株的染色程度相當(圖2C)。結(jié)果說明，啟動子pCON能夠驅(qū)動Gus基因在水稻中特異性高水平的表達。該結(jié)果表明啟動子PCON為組成型啟動子。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻組成型表達啟動子，其特征在于:該啟動子包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一種水稻組成型表達啟動子，其特征在于:所述水稻組成型表達啟動子為下述之 具有SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列； 具有在所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上的核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物，并在高嚴謹條件下與SEQID NO:1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
3.一種植物表達載體，其特征在于:所述植物表達載體含有權(quán)利要求1或2所述啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體為重組載體，所述重組載體是將權(quán)利要求1或2所述的啟動子的核苷酸編碼序列插入水稻雙元表達載體PCAMBIA1381的多克隆位點所得到的。
5.一種轉(zhuǎn)化子，其特征在于:所述轉(zhuǎn)化子含有權(quán)利要求1或2所述啟動子、或者含有根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的植物表達載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于:所述轉(zhuǎn)化子為細胞系、愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。
7.一種宿主菌，其特征在于:所述宿主菌含有權(quán)利要求1或2所述啟動子、或者含有權(quán)利要求3或4所述的植物表達載體；其中，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1 或2所述的啟動子在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用，其特征在于，將含有權(quán)利要求1或2所述的啟動子的核苷酸編碼序列的重組表達載體轉(zhuǎn)入單子葉植物水稻愈傷組織，以啟動下游基因的表達。
【文檔編號】A01H5/00GK103540595SQ201310214044
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月1日
【發(fā)明者】楊劍波, 魏鵬程, 李娟 , 張銀萍, 李 浩, 李莉 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所