一種液體深層發(fā)酵生產天麻伴生蜜環(huán)菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種液體深層發(fā)酵生產天麻伴生蜜環(huán)菌的方法。其特征在于：天麻伴生蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵生產工藝分五個步驟：（1）蜜環(huán)菌菌種分離；（2）蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)；（3）固體種子菌的制備；（4）進行液體發(fā)酵培養(yǎng)；（5）蜜環(huán)菌栽培種接種、培養(yǎng)。本發(fā)明的方法提供了蜜環(huán)菌的各種培養(yǎng)基，解決了蜜環(huán)菌菌種迅速退化生長緩慢、菌絲體產量低、菌種大小質量不一的問題，該生產工藝與傳統固體發(fā)酵相比，大大縮短了蜜環(huán)菌栽培種成品的生長周期，同時提高了成品率，實現了天麻伴生優(yōu)質蜜環(huán)菌的大規(guī)模工廠化生產。
【專利說明】一種液體深層發(fā)酵生產天麻伴生蜜環(huán)菌的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物【技術領域】，具體來說是一種液體深層發(fā)酵生產天麻伴生蜜環(huán)菌栽培種的方法。
【背景技術】
[0002]天M Gastrodia elsta B1.屬蘭科(OrcAiiZaceae),沒有根和綠葉,不能進行光合作用，是異養(yǎng)型植物。天麻完成生活史的全過程是靠兩種或兩種以上的真菌供給營養(yǎng)，天麻種子萌發(fā)靠紫萁小菇等種子萌發(fā)菌供給營養(yǎng)，發(fā)芽后的原球莖靠同化蜜環(huán)菌才能正常生長。蜜環(huán)菌在生長過程中能夠產生菌索，菌索能夠從其提供營養(yǎng)物質的基物中伸出，并進入到另一個不支持其生長的基物中生長，蜜環(huán)菌的生長特性對天麻的產量和品質具有很大影響。為了保證烏天麻栽培的質量和產量，需要篩選出優(yōu)勢蜜環(huán)菌，優(yōu)化蜜環(huán)菌的擴繁條件用于工廠化生產和推廣。
[0003]蜜環(huán)菌栽培種生產方式有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種。液體發(fā)酵技術存在以下優(yōu)點:一、生長周期短，傳統固體發(fā)酵生產蜜環(huán)菌栽培種至少需要4個月，而使用液體發(fā)酵技術可以縮短2個月時間；二、生產用菌種成本低，栽培種生長均勻、速度快；三、提高了栽培種的成品率，有利于大規(guī)模工廠化生產。隨著液體發(fā)酵技術的不斷進步和完善，其應用已經越來越廣泛，但在蜜環(huán)菌發(fā)酵上存在在一些問題:一、菌種迅速退化生長緩慢；二、在需要大量擴繁菌絲體時，產量低；三、液體種子菌質量不一、菌種大小不均勻。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現有技術存在的不足，通過優(yōu)化天麻伴生蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵工藝各環(huán)節(jié)的培養(yǎng)基條件，解決了蜜環(huán)菌菌種迅速退化生長緩慢、菌絲體產量低、菌種大小質量不一的問題，提供一種可工廠化生產優(yōu)質蜜環(huán)菌栽培種的方法。
`[0005]本發(fā)明所采取的技術方案:在野外采集蜜環(huán)菌菌源分離純化后，制備斜面母種和固體種子菌，將固體種子菌碎化后進行液體發(fā)酵培養(yǎng)得到大量菌絲體，接種至栽培瓶中。
[0006]實現本發(fā)明的具體步驟如下。
[0007]( I)蜜環(huán)菌菌種分離:在云南彝良小草壩烏天麻主產區(qū)，采集野生天麻生長周圍的蜜環(huán)菌菌索進行分離純化，菌株編號MHL-001，菌種保藏號=CGMCC N0.6758。
[0008](2)蜜環(huán)菌母種培養(yǎng):配制試管斜面培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基包含以下成分:馬鈴薯100-300g、葡萄糖 10-30g、麥麩 5-30g、KH2PO4 0.l_10g、MgSO40.l_5g、維生素 10mg、瓊脂10-30g、pH值5.5-8。將分離純化后的蜜環(huán)菌菌種接種于試管斜面培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)箱，25°C培養(yǎng)至菌索長滿培養(yǎng)基得到蜜環(huán)菌母種。
[0009](3)固體種子菌的制備:闊葉樹鋸木屑和麥麩通過60目篩后，按配比混合均勻、裝瓶、滅菌、冷卻、接種蜜環(huán)菌母種，放入培養(yǎng)箱，25°C培養(yǎng)至蜜環(huán)菌長滿。固體種子菌培養(yǎng)基配方重量比組分為:闊葉樹鋸木屑50-90%、麥麩5-30%、玉米粉0.1-15%、葡萄糖0.5-5%,KH2PO4 0.05-0.5%、MgSO40.05-0.5%、石膏 1-2%, pH 值為 6.5-7.5。[0010](4)液體發(fā)酵生產:液體發(fā)酵可以采用一級或分級進行擴繁生產。配制液體發(fā)酵培養(yǎng)液裝入發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接種碎化后的固體種子菌，同時加入青霉素0.96-1.92g。液體發(fā)酵培養(yǎng)液的主要成分為:土豆50-200g/L、紅糖5-20g/L、葡萄糖5_40g/L、麥麩10-60g/L、蛋白胨l-4g/L、胡蘿卜0.5-2g/L、酵母膏l(xiāng)_4g/L、磷酸二氫鉀0.5_4g/L、硫酸鎂0.25-3g/L、維生素10mg/L、乙醇5_30g/L、pH值5.5-8。發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度24_27°C，罐壓0.02-0.04Pa，通氣量1:0.3-0.5v/v.m,培養(yǎng)時間72_96h培養(yǎng)液變粘稠。
[0011](5)接種培養(yǎng):發(fā)酵罐中蜜環(huán)菌培養(yǎng)液較粘稠時，在無菌環(huán)境下用接種槍將培養(yǎng)液接種至栽培種培養(yǎng)基上，接種量為10-20mL，25°C培養(yǎng)30-60天后即可使用。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，但實施例并不是對本發(fā)明的限定。
[0013]實施例一
1.蜜環(huán)菌菌種分離:在云南彝良小草壩烏天麻主產區(qū)，采集野生天麻生長周圍的蜜環(huán)菌菌索進行分離純化，菌株編號MHL-001，菌種保藏號=CGMCC N0.6758，分類命名:蜜環(huán)菌Armillaria sp.，保藏時間:2012年11月05日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所。
[0014]2.蜜環(huán)菌母種培養(yǎng):配制試管斜面培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基包含以下成分:馬鈴薯200g、葡萄糖18g、麥麩15g、KH2PO4 2g、MgS04lg、維生素10mg、瓊脂15g、pH值7。將分離純化后的蜜環(huán)菌菌種接種于試管斜面培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱，25°C培養(yǎng)至菌索長滿培養(yǎng)基得到蜜環(huán)菌母種。
[0015]3.固體種子菌的制備:闊葉樹鋸木屑和麥麩通過60目篩后，按配比混合均勻、裝瓶、滅菌、冷卻、接種蜜環(huán)菌母種，放入培養(yǎng)箱，25°C培養(yǎng)至蜜環(huán)菌長滿。固體種子菌培養(yǎng)基配方重量比組分為:闊葉樹鋸木屑75%、麥麩18%、玉米粉4%、葡萄糖1.7%、KH2PO4 0.2%、MgSO40.1%、石膏 1%、pH 值為 6.5-7.5。
[0016]4.液體發(fā)酵生產:配制液體發(fā)酵培養(yǎng)液裝入發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接種碎化后的固體種子菌，同時加入青霉素1.44g。液體發(fā)酵培養(yǎng)液的主要成分為:土豆100g/L、紅糖10g/L、葡萄糖20g/L、麥麩30g/L、蛋白胨2g/L、胡蘿卜lg/L、酵母膏2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂lg/L、維生素10mg/L、乙醇10g/L、pH值6-7。發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度25°C，罐壓
0.02MPa，通氣量1:0.4v/v.m,培養(yǎng)時間96h培養(yǎng)液變粘稠。
[0017]5.接種培養(yǎng):發(fā)酵罐中蜜環(huán)菌培養(yǎng)液較粘稠時，在無菌環(huán)境下用接種槍將培養(yǎng)液接種至栽培種培養(yǎng)基上，接種量為20mL，25°C培養(yǎng)30天后菌索長滿菌種瓶，栽培昭通烏天麻后商品麻平均產量達4斤/穴。
[0018]以上所述僅為本發(fā)明的部分實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.本發(fā)明是一種液體深層發(fā)酵生產天麻伴生蜜環(huán)菌的方法，其特征在于包括以下五個步驟:(I)蜜環(huán)菌菌種分離；(2)蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)；(3)固體種子菌的制備；(4)進行液體發(fā)酵培養(yǎng)；(5)蜜環(huán)菌栽培種接種、培養(yǎng)。
2.根據權利要求1所述的蜜環(huán)菌菌種分離，其特征在于:菌種分離源來自云南彝良小草壩烏天麻主產區(qū)野生天麻生長周圍的蜜環(huán)菌菌索。
3.根據權利要求1所述的蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)，其特征在于:母種培養(yǎng)基包含以下成分，馬鈴薯 100-300g/L、葡萄糖 10-30g/L、麥麩 5_30g/L、KH2PO4 0.1-lOg/L、MgSO40.l_5g/L、維生素 10mg/L、瓊脂 10-30g/L、pH 值 5.5-8。
4.根據權利要求1所述的固體種子菌，其特征在于:固體種子菌培養(yǎng)基配方重量比組分為闊葉樹鋸木屑50-90%、麥麩5-30%、玉米粉0.1-15%、葡萄糖0.5-5%,KH2PO4 0.05-0.5%、MgSO40.05-0.5%、石膏 1-2%、pH 值為 6.5-7.5。
5.根據權利要求1所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于:液體發(fā)酵培養(yǎng)液的主要成分為土豆50-200g/L、紅糖5-20g/L、葡萄糖5_40g/L、麥麩10_60g/L、蛋白胨l_4g/L、胡蘿卜0.5-2g/L、酵母膏l(xiāng)_4g/L、磷酸二氫鉀0.5-4g/L、硫酸鎂0.25_3g/L、維生素10mg/L、乙醇5-30g/L、pH 值 5.5-8。
【文檔編號】A01G1/04GK103798055SQ201310198019
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年5月26日 優(yōu)先權日:2013年5月26日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:程立君