專利名稱：一種金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)生物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種的制備方法。
背景技術(shù)：
鮭鱒魚是世界目前主要養(yǎng)殖的魚類之一，由于其自身的品質(zhì)和對(duì)生活環(huán)境的特殊要求，決定了它綠色、環(huán)保營養(yǎng)食品的性質(zhì)，因此頗受消費(fèi)者的青睞。鮭鱒魚是我國目前主要的冷水性養(yǎng)殖魚類，隨著我國鮭鱒魚養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，基礎(chǔ)理論研究相對(duì)滯后，鮭鱒魚親魚種質(zhì)退化導(dǎo)致苗種質(zhì)量退化生產(chǎn)效益下降等問題逐漸突出，從而制約了鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。利用現(xiàn)代生物技術(shù)，培育生長迅速、個(gè)體大、肉質(zhì)好、抗病能力強(qiáng)的種苗，將成為我國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展的必由之路。雜交能夠急劇的動(dòng)搖遺傳的保守性，使雜種的遺傳性富于游動(dòng)性，具有更大的可塑性，從而能迅速和顯著地提高雜種的生活力，從而獲得雜種優(yōu)勢(shì)；雜種能豐富遺傳結(jié)構(gòu)，通過雜交將兩個(gè)以上遺傳基礎(chǔ)不同的品種或種以上個(gè)體的基因自由組合，出現(xiàn)新的遺傳類型，繼而人們可以選擇優(yōu)良的個(gè)體，培育成新品種。與普通的二倍體魚類相比，三倍體魚類具有生長速度快、成活率高、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)好、安全健康等優(yōu)點(diǎn):①三倍體魚類生長速度比二倍體快30-40%，有利于生產(chǎn)大型個(gè)體，可有效的提高群體產(chǎn)量；②鮭科三倍體魚類不育，避免了性腺發(fā)育階段和產(chǎn)卵季節(jié)因能量轉(zhuǎn)移和婚姻色出現(xiàn)而導(dǎo)致的魚肉品質(zhì)下降及表觀特征變化，避免了其繁殖期生物學(xué)死亡，延長養(yǎng)殖周期；③三倍體魚類對(duì)環(huán)境沒有潛在的威脅，三倍體可減少魚類的基因混雜，有效控制自然水域中魚類的過度繁殖，避免養(yǎng)殖品種的退化，保護(hù)物種的多樣性；④沒有外來基因，屬于人類可以安全食用的健康食品，比起轉(zhuǎn)基因技術(shù)更為人們所接受三倍體魚肉質(zhì)鮮嫩、可食部分高、體形穩(wěn)定美觀、商品價(jià)值高。由于三倍體魚類具有上述優(yōu)勢(shì)，因此通過三倍體制備技術(shù)獲得生長快速、適應(yīng)性和抗病力強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)苗種具有巨大的潛力。自上世紀(jì)80年代以來，三倍體魚類的人工誘導(dǎo)工作取得了長足進(jìn)展。目前對(duì)三倍體苗種制備的研究主要集中在純種虹鱒魚的三倍體制備，其方法為熱休克法或靜水壓方法?，F(xiàn)有熱休克方法制備純種三倍體虹鱒魚的技術(shù)依賴于精確的溫度，溫度稍未變換，會(huì)導(dǎo)致苗種畸形率高，使培育效果不穩(wěn)定，始終無法形成規(guī)?；a(chǎn)，其原因?yàn)楝F(xiàn)有的純種生產(chǎn)三倍體苗種制備技術(shù)或無法達(dá)到生產(chǎn)要求的三倍體率或無法達(dá)到可用于生產(chǎn)的苗種成活率，一直無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。因此，迫切需要一種技術(shù)成熟、效果穩(wěn)定且能規(guī)?；a(chǎn)的三倍體魚苗制備技術(shù)，提高受精卵的發(fā)眼率和苗種三倍體率。6- 二甲基氨基嘌呤(N6-Dimethyladenine, 6-DMAP)在多種貝類多倍體誘導(dǎo)中取得了良好效果，但由 于鮭鱒魚對(duì)生長環(huán)境水質(zhì)要求較高，特別對(duì)化學(xué)物質(zhì)敏感，至今未有6-二甲基氨基嘌呤應(yīng)用于鮭鱒魚三倍體或雜交三倍體誘導(dǎo)的成功報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明提供的金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種的制備方法，包括以下步驟:I)使金鱒親魚卵子與溪紅點(diǎn)鮭親魚精子雜交受精；2) 6-二甲基氨基嘌呤處理受精卵；3)受精卵在養(yǎng)殖用水中孵化。其中，步驟I)受:精溫度是6-11 °C。步驟I)金鱒親魚培養(yǎng)水溫為10_13°C，流水池水交換量為2h/次，溪紅點(diǎn)鮭親魚培育水溫為8-10°C，流水池水交換量為4h/次。所述步驟I)分別將溪紅點(diǎn)鮭親魚魚卵和精液取出，精液用孵化用水清洗，方法為精液與孵化用水的體積比為1-1.5:2500-3000，攪拌1-1.5min后倒掉水，同樣方法反復(fù)沖洗3-5次；按照雄性親魚與雌性親魚1:2-4的尾數(shù)比例進(jìn)行精子與卵子的受精。本發(fā)明制備方法的步驟2)中，受精卵在受精12_14min后，將受精卵移入170-190mg/L的6- 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)溶液中浸泡處理。優(yōu)選地，受精卵在受精12min后，移入6-二甲基氨基嘌呤溶液中浸泡處理。6_ 二甲基氨基嘌呤溶液的溫度為12-14°C。浸泡時(shí)間為14-16min。將步驟2)浸泡處理的受精卵迅速移入6-11 °C孵化水體中孵化48-55天，得到金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體仔魚。

本發(fā)明還提供了 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)在制備金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，采用濃度為170_190mg/L、溫度為12_14°C的6_ 二甲基氨基嘌呤溶液處
理金鱒與溪紅點(diǎn)鮭受精卵。本發(fā)明提供一種金鱒與溪紅點(diǎn)鮭三倍體苗種的制備方法，具體操作為:選取金鱒雌性親魚魚卵和溪紅點(diǎn)鮭雄魚親魚精子進(jìn)行體外受精，7°C條件下魚卵受精12min后,將受精卵迅速移入濃度為180mg/L、溫度為121:的6-0麻？溶液中浸泡溪紅點(diǎn)鮭受精卵15min ；之后迅速移入7°C水體中正常孵化50天，得到金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體魚苗。本發(fā)明制備方法所用的水體均為符合國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的孵化用水。本發(fā)明提供了上述制備方法在溪紅點(diǎn)鮭三倍體苗種育種工作中的應(yīng)用。本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)通過一定濃度、溫度的6- 二甲基氨基嘌呤溶液處理金鱒與溪紅點(diǎn)鮭受精卵，能夠抑制受精卵第二極體的排出，在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化制備金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種，應(yīng)用該方法的受精卵發(fā)眼率達(dá)到78%，苗種孵化率達(dá)到90%以上，苗種三倍體率達(dá)到95%，該發(fā)明方法受精卵發(fā)眼率與正常鮭鱒魚生產(chǎn)相近，三倍體率達(dá)到了生產(chǎn)需求，實(shí)現(xiàn)了雜交三倍體苗種的規(guī)?；a(chǎn)，得到的金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交苗種具有雜交和三倍體優(yōu)勢(shì)，在生長速度和抗病能力方面明顯優(yōu)于現(xiàn)有的二倍體虹鱒魚，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)價(jià)值。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明的金鱒親魚和溪紅點(diǎn)鮭親魚為北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所由北歐瑪生物科技有限公司購買的發(fā)眼卵培育而成。6-DMAP購自美國SIGMA公司。實(shí)施例1金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種制備方法(I)采用水流刺激，控制光照，投喂親魚強(qiáng)化配合飼料等手段，使金鱒親魚與溪紅點(diǎn)鮭親魚同步發(fā)育成熟。金鱒親魚培育水溫為10°c，流水池水交換量為2h/次，溪紅點(diǎn)鮭親魚培育水溫為10°C，流水池水交換量為4h/次。魚卵采用干法受精。先將發(fā)育成熟的金鱒雌魚采用擠壓法將魚卵擠入干凈的瓷盆內(nèi)，每4尾雌魚為I組，再將2尾雄性溪紅點(diǎn)鮭的精液擠入水盆內(nèi)，水溫10°C，立即攪拌均勻，加入精液與孵化用水的體積比為1:2500的孵化用水，輕輕攪拌，Imin后將水倒出，反復(fù)3次，將精液清洗干凈，放置等待處理。魚卵受精12min后，將受精卵迅速移入濃度為180mg/L、溫度為12°C的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡15min后,迅速移入7°C孵化水體中正常孵化。經(jīng)過50天孵化出魚苗，期間雜交三倍體受精卵發(fā)眼率為82%，苗種孵化率為93%，其苗種經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)為三倍體率為95%的金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種。發(fā)眼卵至4月齡階段三倍體成活率為發(fā)眼階段的76%。通過對(duì)金鱒、溪紅點(diǎn)鮭以及本實(shí)施例制得的金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體的微衛(wèi)星分析，結(jié)果說明本實(shí)施例制得的雜交三倍體為金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體。實(shí)施例2金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種制備方法(2)采用水流刺激，控制光照，投喂親魚強(qiáng)化配合飼料等手段，使金鱒與溪紅點(diǎn)鮭親魚同步發(fā)育成熟。金鱒親魚培育水溫為`13°C，流水池水交換量為2h/次，溪紅點(diǎn)鮭親魚培育水溫為8 °C，流水池水交換量為4h/次。魚卵采用干法受精。先將發(fā)育成熟的金鱒雌魚采用擠壓法將魚卵擠入干凈的瓷盆內(nèi)，每4尾雌魚為I組，再將2尾雄性溪紅點(diǎn)鮭的精液擠入水盆內(nèi)，水溫8°C，立即攪拌均勻，加入精液與孵化用水的體積比為1:3000的孵化用水,輕輕攪拌，1.5min后將水倒出，反復(fù)3次，將精液清洗干凈，放置等待處理。魚卵受精13min后，將受精卵迅速移入濃度為170mg/L、溫度為13°C的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡16min后,迅速移入10°C孵化水體中正常孵化。經(jīng)過52天孵化出魚苗，期間雜交三倍體受精卵發(fā)眼率為78%，苗種孵化率為89%，其苗種經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)三倍體率為93%的金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種。發(fā)眼卵至4月齡階段三倍體成活率為發(fā)眼階段的81%。采用現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道的微衛(wèi)星分析方法，結(jié)果顯示本實(shí)施例制得的雜交三倍體為金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體。實(shí)施例3金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種制備方法(3)采用水流刺激，控制光照，投喂親魚強(qiáng)化配合飼料等手段，使金鱒與溪紅點(diǎn)鮭親魚同步發(fā)育成熟。金鱒親魚培育水溫為ll°c，流水池水交換量為2h/次，溪紅點(diǎn)鮭親魚培育水溫為9 °C，流水池水交換量為4h/次。魚卵采用干法受精。先將發(fā)育成熟的金鱒雌魚采用擠壓法將魚卵擠入干凈的瓷盆內(nèi)，每4尾雌魚為I組，再將2尾雄性溪紅點(diǎn)鮭的精液擠入水盆內(nèi)，水溫11°C，立即攪拌均勻，加入精液與孵化用水的體積比為1.5:3000的孵化用水,輕輕攪拌，Imin后將水倒出，反
復(fù)3次，將精液清洗干凈，放置等待處理。魚卵受精14min后，將受精卵迅速移入濃度為190mg/L、溫度為12°C的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡15min后,迅速移入8 °C孵化水體中正常孵化。經(jīng)過48天孵化出魚苗，期間雜交三倍體受精卵發(fā)眼率為79%，苗種孵化率為90%，其苗種經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)三倍體率為94%的金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種。發(fā)眼卵至4月齡階段三倍體成活率為發(fā)眼階段的77%。采用現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道的微衛(wèi)星分析方法，結(jié)果顯示本實(shí)施例制得的雜交三倍體為金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體。實(shí)施例4金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種制備方法(4)采用水流刺激，控制光照，投喂親魚強(qiáng)化配合飼料等手段，使金鱒與溪紅點(diǎn)鮭親魚同步發(fā)育成熟。金鱒親魚培育水溫為12°C，流水池水交換量為2h/次，溪紅點(diǎn)鮭親魚培育水溫為8 °C，流水池水交換量為4h/次。魚卵采用干法受精。先將發(fā)育成熟的金鱒雌魚采用擠壓法將魚卵擠入干凈的瓷盆內(nèi)，每4尾雌魚為I組，再將2尾雄性溪紅點(diǎn)鮭的精液擠入水盆內(nèi)，水溫7.5°C，立即攪拌均勻，加入精液與孵化用水的體積比為1.5:2500的孵化用水,輕輕攪拌，Imin后將水倒出，反復(fù)5次，將精液清洗干凈，放置等待處理。魚卵受精12.5min后，將受精卵迅速移入濃度為180mg/L、溫度為14°C的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡14min后，迅速移入7.5°C孵化水體中正常孵化。經(jīng)過55天孵化出魚苗，期間雜交三倍體受精卵發(fā)眼率為96%，苗種孵化率為92%，其苗種經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)三倍體率為94%的金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種。發(fā)眼卵至4月齡階段三倍體成活率為·發(fā)眼階段的77%。采用現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道的微衛(wèi)星分析方法，結(jié)果顯示本實(shí)施例制得的雜交三倍體為金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體。實(shí)施例5不同濃度6-DMAP溶液對(duì)雜交三倍體苗種孵化率和雜交三倍體率的影響配制好濃度為90、120、150、180、210mg/l溫度為12°C的6-DMAP溶液待用。金鱒早X溪紅點(diǎn) 受精后受精卵放置在溫度為9.8°C的水體中14min，14min后立即分別放入上述配好的6-DMAP溶液中浸泡，時(shí)間為15min，期間不時(shí)的攪動(dòng)受精卵，以使受精卵得以均勻浸泡，15min后移入7 °C孵化水體中正常孵化52天。表I不同濃度6-DMAP溶液處理受精卵對(duì)三倍體苗種的影響
濃度mg/1 孵化水溫(O) 發(fā)眼率(％) 孵化率(％)三倍體率(％)
909.67791451209.88091801509.7829'8、
1809.8758995
2109 8789294
實(shí)施例66-DMAP溶液(180mg/L、12°C )處理受精卵不同時(shí)間對(duì)雜交三倍體苗種孵化率和雜交三倍體率的影響參照實(shí)施例1的方法培養(yǎng)金鱒與溪紅點(diǎn)鮭魚雜交三倍體苗種，濃度為180mg/L、溫度為12°C的6-DMAP溶液處理金鱒與溪紅點(diǎn)鮭魚受精卵的處理時(shí)間不同，見表2，其他培育條件同實(shí)施例1。孵化50天，觀察并記錄6-DMAP溶液處理受精卵不同時(shí)間，對(duì)金鱒與溪紅點(diǎn)鮭魚雜交三倍體苗種的影響，結(jié)果見表2。結(jié)果說明，6-DMAP溶液在處理5-20min時(shí)間范圍內(nèi)，受精卵的發(fā)眼率沒有明顯變化，但苗種三倍體率在5-15min內(nèi)卻隨著處理時(shí)間的增長而顯著增加，當(dāng)處理時(shí)間為20min時(shí)，受精卵孵化率有所降低，盡管幅度不大，而且從苗種三倍體率上看并沒有較大增加，因此認(rèn)為處理時(shí)間15min是合適的。表2 6-DMAP溶液不同處理時(shí)間對(duì)三倍體苗種的影響
權(quán)利要求
1.一種金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)使金鱒親魚卵子與溪紅點(diǎn)鮭親魚精子雜交受精； 2)6-二甲基氨基嘌呤處理受精卵； 3)受精卵在養(yǎng)殖用水中孵化。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I)的體外受精溫度是6-11°C。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I)金鱒親魚培養(yǎng)水溫為10-13°C，流水池水交換量為2h/次；溪紅點(diǎn)鮭親魚培育水溫為8-10°C，流水池水交換量為4h/次。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟I)分別將金鱒雌性親魚魚卵和溪紅點(diǎn)鮭雄性親魚的精液取出，精液用孵化用水清洗，方法為精液與孵化用水的體積比為1-1.5:2500-3000，攪拌1-1.5min后倒掉水，同樣方法反復(fù)沖洗3_5次；按照雄性親魚與雌性親魚1:2-4的尾數(shù)比例進(jìn)行精子與卵子的受精。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中，受精卵在受精12-14min后，將受精卵移入170-190mg/L的6- 二甲基氨基嘌呤溶液中浸泡處理。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，6-二甲基氨基嘌呤溶液的溫度為12-14℃。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，浸泡時(shí)間為14-16min。
8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將步驟2)浸泡處理的受精卵迅速移入6-ll°C孵化水體中孵化48-55天。
9.6- 二甲基氨基嘌呤在制備金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，用濃度為170-190mg/L、溫度為12_14°C的6- 二甲基氨基嘌呤溶液浸泡處理金鱒與溪紅點(diǎn)鮭受精卵。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種的制備方法。利用金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交得到受精卵，再通過6-DMAP溶液浸泡處理受精卵，再孵化培育，產(chǎn)生雜交三倍體苗種。本發(fā)明方法孵化期間受精卵發(fā)眼率為78%以上，苗種孵化率達(dá)到90%以上，得到的仔魚經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，三倍體率達(dá)到95%。該方法可規(guī)?；a(chǎn)金鱒與溪紅點(diǎn)鮭雜交三倍體苗種，從而提高鮭鱒魚的生長速度及抗病能力，為養(yǎng)殖戶提高經(jīng)濟(jì)效益，具有較好的市場(chǎng)價(jià)值。
文檔編號(hào)A01K61/00GK103238547SQ201310195318
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月23日
發(fā)明者徐紹剛, 李文通, 田照輝, 楊曉飛, 楊貴強(qiáng) 申請(qǐng)人:北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所