一種輻照滅菌前對生物材料進行保護的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輻照滅菌前對生物材料進行保護的方法。本發(fā)明提供的輻照滅菌前對生物材料進行保護的方法，為用0.01-0.5g/100ml的輻照保護劑溶液0-25℃浸泡處理所述生物材料1-24小時；所述輻照保護劑溶液為天然黃酮溶液或類黃酮溶液。本發(fā)明中選取類黃酮類試劑作為穩(wěn)定有效的輻照保護劑對產(chǎn)品進行輻照保護，最大化降低了輻照過程對產(chǎn)品固有蛋白結構的破壞，保護作用效果明顯且性質穩(wěn)定，殘留易控制，低毒，不會破壞產(chǎn)品或污染環(huán)境。
【專利說明】一種輻照滅菌前對生物材料進行保護的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種輻照滅菌前對生物材料進行保護的方法。

【背景技術】
[0002]現(xiàn)代外科手術中，常使用天然膠原支架材料對一些缺損的組織和器官進行修補。天然的膠原支架材料其主要成分是膠原蛋白，在使用前需要進行滅菌。常規(guī)的滅菌方式為物理滅菌和化學滅菌。
[0003]物理滅菌分濕熱滅菌和干熱滅菌兩種，均需要對膠原支架材料進行高溫處理，在高溫處理的過程中會引起膠原蛋白的失活。
[0004]化學滅菌通常選擇具有滅菌效果的試劑或者氣體對膠原支架材料進行滅菌。常見的試劑有環(huán)氧乙烷、乳酸等，這類試劑本身具有生物毒性，使用其進行其滅菌很難控制其在膠原支架材料中的殘余量。
[0005]基于物理滅菌和化學滅菌的局限性，人們開始嘗試使用輻照滅菌。輻照滅菌既可以避免化學滅菌中的毒性殘留問題，又避免了高溫對膠原蛋白的傷害，同時還具有操作方便，滅菌效果理想的優(yōu)點。但輻照滅菌任然對膠原蛋白有一定的破壞作用。
[0006]輻照滅菌的優(yōu)勢在于沒有試劑添加，無毒無污染，操作簡便，滅菌效果理想，但是常規(guī)的輻照滅菌方式對蛋白類產(chǎn)品依然有破壞作用，會導致蛋白變性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種輻照滅菌前對生物材料進行保護的方法。
[0008]本發(fā)明提供的輻照滅菌前對生物材料進行保護的方法，為用0.01-0.5g/100ml的輻照保護劑溶液0-25°C浸泡處理所述生物材料1-24小時；所述輻照保護劑溶液為天然黃酮溶液或類黃酮溶液。
[0009]所述輻照保護劑為黃芩素或黃芩苷時，所述浸泡處理的條件為:使用0.005-0.02g/100ml (如 0.005-0.01g/100mU0.01-0.02g/100ml、0.005g/100ml、0.01g/100ml 或 0.02g/100ml)的輻照保護劑溶液 0-12°C(如 0_8°C、4_12°C、2±2°C、6±2°C或10±2°C)浸泡處理4-8小時(如4-6小時、6-8小時、4小時、6小時或8小時)。所述輻照保護劑為黃芩素時，所述輻照保護劑溶液的制備方法為:取0.005-0.02g (如0.005-0.0lg,0.01-0.02g、0.005g、0.0lg 或 0.02g)黃芩素，用水定容至 100ml，然后加入 0.04-0.1gNaOH,攪拌至黃芩素溶解。所述輻照保護劑為黃芩苷時，所述輻照保護劑溶液的制備方法為:取 0.005-0.02g (如 0.005-0.0lg,0.01-0.02g、0.005g、0.0lg 或 0.02g)黃芩苷，用水定容至100ml，然后加入0.04-0.1gNaOH，攪拌至黃芩苷溶解。
[0010]所述輻照保護劑為芹菜素時，所述浸泡處理的條件為:使用0.1-0.5g/100ml (如0.1-0.3g/100ml、0.3-0.5g/100ml、0.lg/100ml、0.3g/100ml 或 0.5g/100ml)的輻照保護劑溶液 8-20°C (如 8-16°C、12-20°C、10±2°C、14±2°C或 18±2°C)浸泡處理 16-24 小時(如16-20小時、20-24小時、16小時、20小時或24小時)。所述輻照保護劑為芹菜素時，所述輻照保護劑溶液的制備方法為:取0.1-0.5g (如0.1-0.3g、0.3-0.5g、0.lg、0.3g或0.5g)芹菜素，用水定容至100ml,然后加入0.004-0.04gNa0H,攪拌至療菜素溶解。
[0011]所述輻照保護劑為山柰酚時，所述浸泡處理的條件為:使用0.05-0.5g/100ml (如0.05-0.3g/100ml、0.3-0.5g/100ml、0.05g/100ml、0.3g/100ml 或 0.5g/100ml)的輻照保護劑溶液 15-25°C (如 15-22°C、18-25°C、17±2°C、20±2°C 或 23±2°C)浸泡處理 1-2 小時(如I小時或2小時)。所述輻照保護劑為山柰酚時，所述輻照保護劑溶液的制備方法為:取0.05-0.5g (如 0.05-0.3g、0.3-0.5g、0.05g、0.3g 或 0.5g)山柰酚，用水定容至 100ml，然后加入0.04-0.1g NaOH，攪拌至山柰酚溶解。
[0012]所述輻照保護劑為楊梅素時，所述浸泡處理的條件為:使用0.01-0.02g/100ml(如0.01g/100ml或0.02g/100ml)的輻照保護劑溶液0_8°C (如2±2°C或6±2°C )浸泡處理16-24小時(如16小時或24小時)。所述輻照保護劑為楊梅素時，所述輻照保護劑溶液的溶劑為水。
[0013]所述輻照保護劑為槲皮素時，所述浸泡處理的條件為:使用0.01-0.5g/100ml (如0.01-0.3g/100ml、0.3-0.5g/100ml、0.01g/100ml、0.3g/100ml 或 0.5g/100ml)的輻照保護劑溶液 0-25 °C (如 0-14°C、10-25 °C、2 ± 2 °C、12 ± 2 °C 或 23 ± 2 °C )浸泡處理 4-8 小時(如 4-6小時、6-8小時、4小時、6小時或8小時)。所述輻照保護劑為槲皮素時，所述輻照保護劑溶液的制備方法為-M 0.01-0.5g (如 0.01-0.3g、0.3-0.5g、0.01g、0.3g 或 0.5g)槲皮素，用水定容至100ml,然后加入0.04-0.1g NaOH,攪拌至槲皮素溶解。
[0014]所述輻照保護劑為甘草素時，所述浸泡處理的條件為:使用0.1-0.5g/100ml (如0.lg/100ml或0.5g/100ml)的輻照保護劑溶液15-25°C (如17±2°C或23±2°C )浸泡處理1-2小時(如I小時或2小時)。所述輻照保護劑為甘草素時，所述輻照保護劑溶液的制備方法為:取0.1-0.5g (如0.lg、或0.5g)甘草素，用水定容至100ml，然后加入0.04-0.1gNaOH,攪拌至甘草素溶解。
[0015]以上任一所述方法在制備手術用生物材料中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0016]本發(fā)明還保護一種制備手術用生物材料的方法，包括如下步驟:
[0017](I)使用堿溶液浸泡處理富含膠原蛋白的離體生物組織；
[0018](2)使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物；
[0019](3)使用堿溶液浸泡處理步驟(2)的產(chǎn)物；
[0020](4)將步驟(3)的產(chǎn)物按照權利要求1至7中任一所述的方法進行操作；
[0021](5)使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物；
[0022](6)將步驟(5)的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到手術用生物材料。
[0023]所述步驟(I)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH或Κ0Η。所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.5-2M (如0.5-1Μ、1-2Μ、0.5M、IM或2M)。所述步驟(I)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如0_8°C、4_25°C、2±2°C、6±2°C或23±2°C)、1_3小時(如I小時或3小時)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0024]所述步驟(2)中:所述表面活性劑可為非離子型表面活性劑，要求殘留可控、無細胞毒性或低細胞毒性、不會污染環(huán)境。所述步驟(2)中:所述表面活性劑可為TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為0.5_3g/100ml (如0.l-2g/100ml、2g-5g/100ml、0.lg/100ml、2g/100ml 或 5g/100ml)。所述步驟(2)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如 0-18°C、14-25°C、2±2°C、16±2°C或 23±2°C )、8_168 小時(如8-10小時、10-168小時、8小時、10小時或168小時)。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0025]所述步驟(3)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH或Κ0Η。所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.5-3M(如0.5-1Μ、0.5_1M、1_3M、0.5M、1M或2M)。所述步驟(3)中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C (如0_10°C、6_25°C、2 ± 2 °C、15 ± 2 °C 或 23 ± 2 °C )、10-60 分鐘(如 10-15 分鐘、15-60 分鐘、10 分鐘、15 分鐘或 60分鐘)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0026]所述步驟(5)中:所述PBS 緩沖液的 pH 可為 5.8-7.8 (如 5.8_7.2、7.2_7.8、5.8、
7.2或7.8)。所述步驟(5)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如0_10°C、6_25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、4-168 小時(如 4-10 小時、10-168 小時、4 小時、10 小時或 168小時)。
[0027]所述滅菌為鈷-60輻射滅菌。所述鈷-60輻射滅菌的輻照劑量具體可為10-30KGy(如 10-25KGy、25-30KGy、1KGy、25KGy 或 30KGy)。
[0028]所述富含膠原蛋白的生物組織可為膜膠原、骨膠原、筋膜、防粘連膜等，如食管。
[0029]所述動物具體可為豬或牛。
[0030]本發(fā)明還保護一種制備手術用生物材料的方法，包括如下步驟:
[0031 ] (I)使用堿溶液浸泡處理離體的動物骨組織；
[0032](2)使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物；
[0033](3)使用堿溶液浸泡處理步驟(2)的產(chǎn)物；
[0034](4)將步驟(3)的產(chǎn)物按照權利要求1至7中任一所述的方法進行操作；
[0035](5)使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物；
[0036](6)將步驟(5)的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到手術用生物材料。
[0037]所述步驟(I)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH或Κ0Η。所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.5-2M (如0.5-1Μ、1-2Μ、0.5M、IM或2M)。所述步驟(I)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如0_8°C、4_25°C、2±2°C、6±2°C或23±2°C)、1_3小時(如I小時或3小時)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0038]所述步驟(2)中:所述表面活性劑可為非離子型表面活性劑，要求殘留可控、無細胞毒性或低細胞毒性、不會污染環(huán)境。所述步驟(2)中:所述表面活性劑可為TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為0.5_3g/100ml (如0.l-2g/100ml、2g-5g/100ml、0.lg/100ml、2g/100ml 或 5g/100ml)。所述步驟(2)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如 0-18°C、14-25°C、2±2°C、16±2°C或 23±2°C )、8_168 小時(如8-10小時、10-168小時、8小時、10小時或168小時)。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0039]所述步驟(3)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH或Κ0Η。所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.5-3M(如0.5-1Μ、0.5_1M、1_3M、
0.5M、1M或2M)。所述步驟(3)中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C (如0_10°C、6_25°C、2 ± 2 °C、15 ± 2 °C 或 23 ± 2 °C )、10-60 分鐘(如 10-15 分鐘、15-60 分鐘、10 分鐘、15 分鐘或 60
分鐘)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0040]所述步驟(5)中:所述PBS 緩沖液的 pH 可為 5.8-7.8 (如 5.8_7.2、7.2_7.8、5.8、
7.2或7.8)。所述步驟(5)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如0_10°C、6_25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、4-168 小時(如 4-10 小時、10-168 小時、4 小時、10 小時或 168小時)。
[0041]所述滅菌為鈷-60輻射滅菌。所述鈷-60輻射滅菌的輻照劑量具體可為10-30KGy(如 10-25KGy、25-30KGy、1KGy、25KGy 或 30KGy)。
[0042]所述骨組織可為動物腿骨的骨松質、動物長骨的骨松質、動物肋軟骨、動物關節(jié)軟骨或動物四肢骨的骨干等。
[0043]所述動物具體可為?；蜇i。
[0044]以往生產(chǎn)天然膠原支架材料的工藝，沒有輻照保護的步驟。產(chǎn)品在凍干輻照后，天然的膠原蛋白會被大幅破壞。最終導致產(chǎn)品撕裂力下降和降解速度加快。而選擇輻照保護劑的工藝也存在以下問題:一，保護劑的毒性問題，若選取的輻照保護劑存在毒性，則要控制保護劑的使用量以及其最終在產(chǎn)品上的殘留量；二，保護劑的穩(wěn)定性問題，大多數(shù)輻照保護劑均具有較強的還原性，這種還原性導致試劑本身不穩(wěn)定，從而在輻照過程中也不能對產(chǎn)品進行有效且穩(wěn)定的保護。本發(fā)明中選取類黃酮類試劑(一種天然提取物，低毒性，無刺激性異味，殘留可控，安全有效，其本身不會對產(chǎn)品本身產(chǎn)生破壞)作為穩(wěn)定有效的輻照保護劑對產(chǎn)品進行輻照保護，最大化降低了輻照過程對產(chǎn)品固有蛋白結構的破壞，保護作用效果明顯且性質穩(wěn)定，殘留易控制，低毒，不會破壞產(chǎn)品或污染環(huán)境。

【具體實施方式】
[0045]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0046]黃芩素:國藥集團化學試劑有限公司，產(chǎn)品編號為XW080047，CAS編號為491-67-8。
[0047]黃芩苷:國藥集團化學試劑有限公司，產(chǎn)品編號為XW080046，CAS編號為21967-41-9。
[0048]芹菜素:國藥集團化學試劑有限公司，產(chǎn)品編號為XW080007，CAS編號為520-36-5。
[0049]山柰酚:(上海純優(yōu)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號P0013，CAS編號520_18_3)。
[0050]楊梅素:(上海純優(yōu)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號P0287，CAS編號529_44_2)。
[0051]槲皮素:國藥集團化學試劑有限公司，產(chǎn)品編號為69022033，CAS編號為117-39-5。
[0052]甘草素:(上海純優(yōu)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號P0296，CAS編號578_86_9)。
[0053]黃岑素的結構式如下:
[0054]

【權利要求】
1.一種輻照滅菌前對生物材料進行保護的方法，為用0.01-0.5g/100ml的輻照保護劑溶液0-25°C浸泡處理所述生物材料1-24小時；所述輻照保護劑溶液為天然黃酮溶液或類黃酮溶液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述輻照保護劑為黃芩素或黃芩苷；所述浸泡處理的條件為:使用0.005-0.02g/100ml的輻照保護劑溶液0_12°C浸泡處理4_8小時。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述輻照保護劑為芹菜素；所述浸泡處理的條件為:使用0.1-0.5g/100ml的輻照保護劑溶液8_20°C浸泡處理16-24小時。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述輻照保護劑為山柰酚；所述浸泡處理的條件為:使用0.05-0.5g/100ml的輻照保護劑溶液15_25°C浸泡處理1_2小時。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述輻照保護劑為楊梅素；所述浸泡處理的條件為:使用0.01-0.02g/100ml的輻照保護劑溶液0_8°C浸泡處理16-24小時。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述輻照保護劑為槲皮素；所述浸泡處理的條件為:使用0.01-0.5g/100ml的輻照保護劑溶液0_25°C浸泡處理4_8小時。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述輻照保護劑為甘草素；所述浸泡處理的條件為:使用0.1-0.5g/100ml的輻照保護劑溶液15_25°C浸泡處理1_2小時。
8.權利要求1至7中任一所述方法在制備手術用生物材料中的應用。
9.一種制備手術用生物材料的方法，包括如下步驟: (O使用堿溶液浸泡處理富含膠原蛋白的離體生物組織； (2)使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物； (3)使用堿溶液浸泡處理步驟(2)的產(chǎn)物； (4)將步驟(3)的產(chǎn)物按照權利要求1至7中任一所述的方法進行操作； (5)使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物； (6)將步驟(5)的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到手術用生物材料。
10.一種制備手術用生物材料的方法，包括如下步驟: (O使用堿溶液浸泡處理離體的動物骨組織； (2)使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物； (3)使用堿溶液浸泡處理步驟(2)的產(chǎn)物； (4)將步驟(3)的產(chǎn)物按照權利要求1至7中任一所述的方法進行操作； (5)使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物； (6)將步驟(5)的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到手術用生物材料。
【文檔編號】A01N1/02GK104170815SQ201310192548
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權日:2013年5月22日
【發(fā)明者】郭松, 董佳桓, 孫先昌, 辛春鳳, 于學珍 申請人:煙臺正海生物技術有限公司