專利名稱：一種膠凍樣類芽孢桿菌以及利用其生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物制劑的制備，特別是指一種膠凍樣類芽孢桿菌以及利用其生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法。
背景技術：
長期以來，由于大量使用化學農藥而造成的環(huán)境污染問題日趨嚴重?；瘜W農藥因其不具有選擇性，對有益的生物也會造成威脅，并且化學農藥的不可降解性，極易在動植物體內積累而造成污染物的富集。隨著公眾對“綠色食品”、“無公害食品”的要求越來越高，市場對無污染、可降解的生物農藥需求量也逐漸增多，從農藥研究和生產(chǎn)的發(fā)展趨勢來看，新型的綠色生物源農用制劑有著廣闊的開發(fā)應用前景。近年來國內外許多研究發(fā)現(xiàn)，寡糖類物質具有很重要生物活性，已引起了有關學者的高度重視，一致認為其具有極大的研究和應用價值，特別是聚合度20以下的氨基寡糖，由水產(chǎn)品加工的附產(chǎn)物一一甲殼素而來，是綠色安全的天然生物源物質，在醫(yī)藥、農業(yè)、食品方面的應用都是不容忽視的，特別是作為一種安全無毒的生物源農藥被證實可有效地誘導植物產(chǎn)生防御反應，提高植物抗逆能力，可用來防治植物病害，從而調節(jié)和促進植物生長，不破壞生態(tài)平衡，其具有重要的研究和生產(chǎn)價值。微生物菌劑是近年大力發(fā)展和廣泛應用的新型綠色生物制劑，具有成本低、肥效高、無污染、可節(jié)約能源等優(yōu)點，能提供植物所需的多種營養(yǎng)物質，可促進植物生長，改良土壤結構，修復生態(tài)環(huán)境惡化的土壤，達到改善作物品質、提高產(chǎn)量的功效，目前是化肥有效的替代品。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之 一是提供一種膠凍樣類芽孢桿菌。本發(fā)明的目的之二是提供利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法。本發(fā)明的整體技術構思是:一種膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus),其保藏編號為CGMCCN0.7240。上述微生物已于2013年I月31日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，其保藏編號為CGMCC N0.7240，該保藏單位的地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。上述微生物的理化特性及培養(yǎng)特征是:在無氮培養(yǎng)基上，菌落表面濕潤、光滑，邊緣整齊，質地粘稠并有彈性，無色透明隆起，菌體桿狀，大小為4-7 X 1-1.2 u m，在有氮淀粉培養(yǎng)基上30小時開始形成芽孢，芽孢橢圓形，位于孢囊中部，孢囊不膨大，菌體幼齡時周生鞭毛，在有氮鉀長石培養(yǎng)基上20小時后形成肥厚莢膜，革蘭氏染色陰性。在純培養(yǎng)條件下，從IOOg鉀長石粉中釋放出比對照高219mg有效鉀，增加67.38% ；從IOOg 土壤礦物(硅鋁酸鹽)中分解出比對照高47mg的水溶性鉀，增加35.34%。在以IOOg磷礦粉為底物時，分解出比對照高80.4mg的可利用性磷；發(fā)酵液經(jīng)液相色譜測定證明，該菌株可產(chǎn)生赤霉素、細胞分裂素和某些抗生素類的生理活性物質和營養(yǎng)物質，因此利用該菌株生產(chǎn)的生物制劑具有營養(yǎng)、抗病、改土、促生長的多重效果。利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，包括如下工藝步驟:A、擴大培養(yǎng)將原始菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種；原始菌種選用膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus),其保藏編號為 CGMCC N0.7240 ；B、制備發(fā)酵液B1、發(fā)酵按照體積比為生產(chǎn)菌種:發(fā)酵培養(yǎng)基=10%_15%的比例將生產(chǎn)菌種接種到滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵的條件為:溫度25-32 °C，壓力0.03-0.7MPa，通風量控制條件是:發(fā)酵開始后為200-250M3/hr、發(fā)酵4小時后為320_360M3/hr、發(fā)酵8小時后為420-470M3/hr、發(fā)酵12小時后為520_560M3/hr、發(fā)酵20小時后為600_630M3/hr，發(fā)酵開始4-8小時后開始攪拌，直至發(fā)酵終點；發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質量百分比的組份組成:淀粉0.3-1.5%，豆餅粉 0.03-0.1%，碳酸鈣 0.05-0.2%，蔗糖 0.08-0.5%，硫酸銨0.01-0.08%,磷酸氫二鉀 0.08-0.5%,硫酸鎂 0.08-0.5%,三氯化鐵 0.008-0.05%,酵母膏0.03-0.15%，氫氧化鉀 0.01-0.1%，消泡劑 0.005-0.02%，余量為自來水，pH=7.2-7.4 ；

B2、檢測及終點控制發(fā)酵中根據(jù)菌體生長狀況定時取樣、鏡檢，發(fā)酵至40±5小時后取樣鏡檢，當95%的營養(yǎng)體形成芽孢，芽孢含量達到5億個/毫升以上，終止發(fā)酵并制成發(fā)酵液；C、復合微生物菌劑的配制按照步驟B中制備的發(fā)酵液為69.7-91.2kg、氨基寡糖為8_30kg、復合微量元素添加劑為0.3-0.8kg的比例，將上述組分混配制成復合微生物菌劑；其中復合微量元素添加劑由如下質量的組分組成:硼砂或硼酸10_20kg，硫酸鋅或氯化鋅5_15kg，鑰酸銨3_12kg，硫酸錳2_8kg。本發(fā)明中的氨基寡糖為由甲殼素降解而得到的液體產(chǎn)品，含質量百分含量為0.2%-0.5%的氨基寡糖，聚合度為2-10，分子量400-2000，可市售購得。本發(fā)明的具體技術步驟及工藝參數(shù)是:為縮短發(fā)酵的工藝過程，減少發(fā)酵過程中感染雜菌的機會，較為常見的方法是采用原始菌種擴大培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種(種子液)，將其接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的方式。其中較為優(yōu)選的技術方案是，采用的所述的擴大培養(yǎng)包括:A1、斜面菌種的的制備；A2、克氏瓶斜面囷種的制備；A3、生廣囷種的制備。步驟Al優(yōu)選的技術方案是，所述的Al、斜面菌種的制備是:將原始菌種接入滅菌后試管斜面培養(yǎng)基，在25-32°C條件下恒溫培養(yǎng)2-5天制成斜面菌種；所述的試管斜面培養(yǎng)基由如下組分組成:蔗糖5-15克，磷酸氫二鉀0.2-1克，硫酸鎂0.1-0.5克，氯化鈉0.1-0.5克，碳酸鈣0.5-3克，硫酸鈣0.05-0.3克，酵母膏0.1-1克，水1000毫升，瓊脂15-22克，pH=7.2。
步驟A2優(yōu)選的技術方案是，所述的A2、克氏瓶斜面菌種的制備是:將步驟Al中制備的斜面菌種接入滅菌后的克氏瓶斜面培養(yǎng)基；在25-32°C條件下恒溫培養(yǎng)4-6天制成克氏瓶斜面菌種；克氏瓶斜面培養(yǎng)基由如下組份組成:葡萄糖0.5-2克，蛋白胨0.5-2克，磷酸氫二鉀0.5-2克，硫酸銨0.1-0.5克，酵母膏0.3-1.5克，硫酸鎂0.1-0.5克，水1000ml，瓊脂15-22克，pH=7.2 ;將上述培養(yǎng)基按照每瓶60-80ml的量裝入250ml克氏瓶中，滅菌、擺斜面制成克氏瓶斜面培養(yǎng)基。步驟A3優(yōu)選的技術方案是，A3、生產(chǎn)菌種的制備是:將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種接入滅菌后的種子培養(yǎng)基,經(jīng)通氣培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種；培養(yǎng)條件如下:溫度25-32。。，壓力0.05MPa,通風量0_8小時50_70M3/hr，8小時以后70_90M3/hr，培養(yǎng)周期15-20小時；培養(yǎng)12小時后開始取樣鏡檢觀察生長狀況，當菌體處于對數(shù)期生長期時，含菌量達到工藝要求，無雜菌，即可終止培養(yǎng)，所述的種子培養(yǎng)基由如下質量百分數(shù)的組分組成:淀粉0.2-1%，豆餅粉 0.1-0.7%，碳酸鈣 0.05-0.3%，蔗糖 0.05-0.3%，硫酸銨0.1-1%，消泡劑0.005-0.015%，余量為自來水，滅菌后pH=6.3。培養(yǎng)基滅菌是本領域的常規(guī)技術，較為常見的技術手段是采用蒸汽滅菌，其中滅菌的條件是:溫度為121°C，時間為20-45分鐘。步驟A3中優(yōu)選采用的技術方案是，步驟A3是將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種制成菌懸液接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，步驟A3中采用的種子發(fā)酵罐的容量為2噸，種子培養(yǎng)基在種子發(fā)酵罐中的裝量體積比為60%-80%。步驟BI中優(yōu)選采用的技術方案是，步驟BI中的攪拌轉速為730轉/分鐘，采用發(fā)酵罐的容量為15噸，發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝量體積比為60%-80%。
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本發(fā)明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于:本發(fā)明選用申請人篩選并提交保藏的具有高效解磷、解鉀功能的一種膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus),利用生物工程發(fā)酵的方法制備微生物活菌制劑與氨基寡糖復配，并相應添加不同的微量元素，所生產(chǎn)的具有農藥和肥料雙重功能的無公害綠色生物制劑，在使用過程中，可減少用肥次數(shù)和使用成本，產(chǎn)生藥肥互相促進、互相提高的增效作用，具有顯者的環(huán)保價值和社會效益。本發(fā)明中所描述的微生物已于2013年I月31日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，其保藏編號為CGMCCN0.7240。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明做進一步描述，但不應理解為對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護范圍以權利要求記載的內容為準，任何依據(jù)說明書所作出的等效技術手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護范圍。實施例1一種膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus),其保藏編號為CGMCCN0.7240。利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，包括如下工藝步驟:A、擴大培養(yǎng)
將原始菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種；原始菌種選用膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus),其保藏編號為 CGMCC N0.7240 ；B、制備發(fā)酵液B1、發(fā)酵按照體積比為生產(chǎn)菌種:發(fā)酵培養(yǎng)基=10%的比例將生產(chǎn)菌種接種到滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵的條件為:溫度25°C，壓力0.03MPa，通風量控制條件是:發(fā)酵開始后為200M3/hr、發(fā)酵4小時后為320M3/hr、發(fā)酵8小時后為420M3/hr、發(fā)酵12小時后為520M3/hr、發(fā)酵20小時后為600M3/hr，發(fā)酵開始4_8小時后開始攪拌，直至發(fā)酵終點；

發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質量百分比的組份組成:淀粉0.3%，豆餅粉0.03%,碳酸鈣0.05%,蔗糖0.08%,硫酸銨0.01%,磷酸氫二鉀0.08%，硫酸鎂0.08%,三氯化鐵0.008%,酵母膏0.03%,氫氧化鉀0.01%,消泡劑0.005%,余量為自來水，pH=7.2 ;B2、檢測及終點控制發(fā)酵中根據(jù)菌體生長狀況定時取樣、鏡檢，發(fā)酵至40±5小時后取樣鏡檢，當95%的營養(yǎng)體形成芽孢，芽孢含量達到5億個/毫升以上，終止發(fā)酵并制成發(fā)酵液；C、復合微生物菌劑的配制按照步驟B中制備的發(fā)酵液為69.7kg、氨基寡糖為8kg、復合微量元素添加劑為0.3kg的比例，將上述組分混配制成復合微生物菌劑；其中復合微量元素添加劑由如下質量的組分組成:硼砂或硼酸IOkg,硫酸鋅或氯化鋅5kg,鑰酸銨3kg,硫酸猛2_8kg。所述的擴大培養(yǎng)包括:A1、斜面菌種的的制備；A2、克氏瓶斜面菌種的制備；A3、生產(chǎn)菌種的制備。所述的Al、斜面菌種的制備是:將原始菌種接入滅菌后試管斜面培養(yǎng)基，在25°C條件下恒溫培養(yǎng)5天制成斜面菌種；所述的試管斜面培養(yǎng)基由如下組分組成:蔗糖5克，磷酸氫二鉀0.2克，硫酸鎂0.1克，氯化鈉0.1克，碳酸鈣0.5克，硫酸鈣0.05克，酵母膏0.1克，水1000毫升，瓊脂15克，pH=7.2。所述的A2、克氏瓶斜面菌種的制備是:將步驟Al中制備的斜面菌種接入滅菌后的克氏瓶斜面培養(yǎng)基；在25 °C條件下恒溫培養(yǎng)4天制成克氏瓶斜面菌種；克氏瓶斜面培養(yǎng)基由如下組份組成:葡萄糖0.5克，蛋白胨0.5克，磷酸氫二鉀0.5克，硫酸銨0.1克，酵母膏0.3克，硫酸鎂0.1克，水1000ml，瓊脂15克，pH=7.2 ;將上述培養(yǎng)基按照每瓶60ml的量裝入250ml克氏瓶中，滅菌、擺斜面制成克氏瓶斜面培養(yǎng)基。A3、生產(chǎn)菌種的制備是:將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，經(jīng)通氣培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種；培養(yǎng)條件如下:溫度25°C，壓力0.05MPa，通風量0_8小時50M3/hr,8小時以后70M3/hr，培養(yǎng)周期15小時；培養(yǎng)12小時后開始取樣鏡檢觀察生長狀況，當菌體處于對數(shù)期生長期時，含菌量達到工藝要求，無雜菌，即可終止培養(yǎng)，所述的種子培養(yǎng)基由如下質量百分數(shù)的組分組成:淀粉0.2%，豆餅粉0.1%，碳酸鈣0.05%,蔗糖0.05%,硫酸銨0.1%，消泡劑0.005%,余量為自來水，滅菌后pH=6.3。培養(yǎng)基的滅菌條件是:溫度為121 °C，時間為20-45分鐘。將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種制成菌懸液接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，步驟A3中采用的種子發(fā)酵罐的容量為2噸，種子培養(yǎng)基在種子發(fā)酵罐中的裝量體積比為60%。步驟BI中的攪拌轉速為730轉/分鐘，采用發(fā)酵罐的容量為15噸，發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝量體積比為60%。實施例2利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，包括如下工藝步驟:A、擴大培養(yǎng)將原始囷種經(jīng)擴大培養(yǎng)制成生廣囷種；原始菌種選用膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus),其保藏編號為 CGMCC N0.7240 ；B、制備發(fā)酵液B1、發(fā)酵按照體積比為生產(chǎn)菌種:發(fā)酵培養(yǎng)基=15%的比例將生產(chǎn)菌種接種到滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵的條件為:溫度32°C，壓力0.7MPa，通風量控制條件是:發(fā)酵開始后為250M3/hr、發(fā)酵4小時后為360M3/hr、發(fā)酵8小時后為70M3/hr、發(fā)酵12小時后為560M3/hr、發(fā)酵20小時后為630M3/hr，發(fā)酵開始8小時后開始攪拌，直至發(fā)酵終點；

發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質量百分比的組份組成:淀粉1.5%，豆餅粉0.1%，碳酸鈣0.2%，蔗糖0.5%，硫酸銨0.08%,磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.5%，三氯化鐵0.05%,酵母膏0.15%，氫氧化鉀0.1%，消泡劑0.02%,余量為自來水，pH=7.2-7.4 ；B2、檢測及終點控制發(fā)酵中根據(jù)菌體生長狀況定時取樣、鏡檢，發(fā)酵至40±5小時后取樣鏡檢，當95%的營養(yǎng)體形成芽孢，芽孢含量達到5億個/毫升以上，終止發(fā)酵并制成發(fā)酵液；C、復合微生物菌劑的配制按照步驟B中制備的發(fā)酵液為91.2kg、氨基寡糖為30kg、復合微量元素添加劑為0.8kg的比例，將上述組分混配制成復合微生物菌劑；其中復合微量元素添加劑由如下質量的組分組成:硼砂或硼酸20kg,硫酸鋅或氯化鋅15kg,鑰酸銨12kg,硫酸猛8kg。所述的擴大培養(yǎng)包括:A1、斜面菌種的的制備；A2、克氏瓶斜面菌種的制備；A3、生產(chǎn)菌種的制備。所述的Al、斜面菌種的制備是:將原始菌種接入滅菌后試管斜面培養(yǎng)基，在32°C條件下恒溫培養(yǎng)2天制成斜面菌種；所述的試管斜面培養(yǎng)基由如下質量的組分組成:蔗糖15克，磷酸氫二鉀I克，硫酸鎂0.5克，氯化鈉0.5克，碳酸鈣3克，硫酸鈣0.3克，酵母膏I克，水1000毫升，瓊脂22克，pH=7.2。所述的A2、克氏瓶斜面菌種的制備是:將步驟Al中制備的斜面菌種接入滅菌后的克氏瓶斜面培養(yǎng)基；在32 °C條件下恒溫培養(yǎng)4天制成克氏瓶斜面菌種；克氏瓶斜面培養(yǎng)基由如下質量的組份組成:
葡萄糖2克，蛋白胨2克，磷酸氫二鉀2克，硫酸銨0.5，酵母膏1.5克，硫酸鎂0.5克，水1000ml，瓊脂22克，pH=7.2 ;將上述培養(yǎng)基按照每瓶80ml的量裝入250ml克氏瓶中，滅菌、擺斜面制成克氏瓶斜面培養(yǎng)基。A3、生產(chǎn)菌種的制備是:將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，經(jīng)通氣培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種；培養(yǎng)條件如下:溫度32°C，壓力0.05MPa，通風量0_8小時70M3/hr，8小時以后90M3/hr，培養(yǎng)周期20小時；培養(yǎng)12小時后開始取樣鏡檢觀察生長狀況，當菌體處于對數(shù)期生長期時，含菌量達到工藝要求，無雜菌，即可終止培養(yǎng)；培養(yǎng)基的滅菌條件是:溫度為121 °C，時間為20-45分鐘。將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種制成菌懸液接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，步驟A3中采用的種子發(fā)酵罐的容量為2噸，種子培養(yǎng)基在種子發(fā)酵罐中的裝量體積比為80%。步驟BI中的攪拌轉速為730轉/分鐘，采用發(fā)酵罐的容量為15噸，發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝量體積比為80%。其余內容同實施例1。實施例3利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，包括如下工藝步驟:A、擴大培養(yǎng)將原始囷種經(jīng)擴大培養(yǎng)制成生廣囷種；

原始菌種選用膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus),其保藏編號為 CGMCC N0.7240 ；B、制備發(fā)酵液B1、發(fā)酵按照體積比為生產(chǎn)菌種:發(fā)酵培養(yǎng)基=12%的比例將生產(chǎn)菌種接種到滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵的條件為:溫度30°C，壓力0.2MPa，通風量控制條件是:發(fā)酵開始后為230M3/hr、發(fā)酵4小時后為350M3/hr、發(fā)酵8小時后為450M3/hr、發(fā)酵12小時后為550M3/hr、發(fā)酵20小時后為620M3/hr，發(fā)酵開始6小時后開始攪拌，直至發(fā)酵終點；發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質量百分比的組份組成:淀粉0.7%，豆餅粉0.07%,碳酸鈣0.1%，蔗糖0.2%，硫酸銨0.055%,磷酸氫二鉀
0.2%，硫酸鎂0.2%，三氯化鐵0.03%,酵母膏0.08%,氫氧化鉀0.04%,消泡劑0.015%，余量為自來水，pH=7.2-7.4 ；B2、檢測及終點控制發(fā)酵中根據(jù)菌體生長狀況定時取樣、鏡檢，發(fā)酵至40±5小時后取樣鏡檢，當95%的營養(yǎng)體形成芽孢，芽孢含量達到5億個/毫升以上，終止發(fā)酵并制成發(fā)酵液；C、復合微生物菌劑的配制按照步驟B中制備的發(fā)酵液為80kg、氨基寡糖為25kg、復合微量元素添加劑為
0.5kg的比例，將上述組分混配制成復合微生物菌劑；其中復合微量元素添加劑由如下單位質量的組分組成:硼砂或硼酸15kg,硫酸鋅或氯化鋅IOkg,鑰酸銨8kg,硫酸猛5kg。所述的擴大培養(yǎng)包括:A1、斜面菌種的的制備；A2、克氏瓶斜面菌種的制備；A3、生產(chǎn)菌種的制備。
所述的Al、斜面菌種的制備是:將原始菌種接入滅菌后試管斜面培養(yǎng)基，在25-32°C條件下恒溫培養(yǎng)2-5天制成斜面菌種；所述的試管斜面培養(yǎng)基由如下質量的組分組成:蔗糖10克，磷酸氫二鉀0.6克，硫酸鎂0.3克，氯化鈉0.3克，碳酸鈣I克，硫酸鈣
0.2克，酵母膏0.5克，水1000毫升，瓊脂18克，pH=7.2。所述的A2、克氏瓶斜面菌種的制備是:將步驟Al中制備的斜面菌種接入滅菌后的克氏瓶斜面培養(yǎng)基；在30°C條件下恒溫培養(yǎng)4-6天制成克氏瓶斜面菌種；克氏瓶斜面培養(yǎng)基由如下質量的組份組成:葡萄糖1.2克，蛋白胨1.2克，磷酸氫二鉀1.2克，硫酸銨0.3克，酵母膏I克，硫酸鎂0.3克，水1000ml，瓊脂20克，pH=7.2 ;將上述培養(yǎng)基按照每瓶80ml的量裝入250ml克氏瓶中，滅菌、擺斜面制成克氏瓶斜面培養(yǎng)基。A3、生產(chǎn)菌種的制備是:將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，經(jīng)通氣培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種；培養(yǎng)條件如下:溫度28°C，壓力0.05MPa，通風量0_8小時60M3/hr,8小時以后80M3/hr，培養(yǎng)周期18小時；培養(yǎng)12小時后開始取樣鏡檢觀察生長狀況，當菌體處于對數(shù)期生長期時，含菌量達到工藝要求，無雜菌，即可終止培養(yǎng)；培養(yǎng)基的滅菌條件是:溫度為121 °C，時間為20-45分鐘。將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種制成菌懸液接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，步驟A3中采用的種子發(fā)酵罐的容量為2噸，種子培養(yǎng)基在種子發(fā)酵罐中的裝量體積比為70%。步驟BI中的攪拌轉速為730轉/分鐘，采用發(fā)酵罐的容量為15噸，發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝量體積比 為70%。采用實施例1-3中所制備的復合微生物菌劑進行了對花生增產(chǎn)效果和花生青枯病防治效果試驗，結果如下:1、試驗地點:保定市清苑縣大莊鄉(xiāng)2、花生品種:魯花10號。3、試驗設計:設施用膠凍樣類芽孢桿菌微生物活菌制劑(以下簡稱HM8841菌劑)、氨基寡糖和復合微生物菌劑(以下簡稱復合菌劑)3個試驗組，以不施用上述制劑為對照組，每試驗組設三次重復。田間管理和其它用肥均按常規(guī)方法進行。4、施肥方法:播種前將全部制劑用量的2/3與底肥混合后施用，其余1/3分別在盛花期、幼果初期、果實膨大期稀釋100倍均勻噴施。5、施肥用量:按畝(666.7m2)用量計，每畝施用氨基寡糖lkg，HM8841菌劑10kg，復合菌劑15kg，對照不施用上述三種制劑。6、試驗結果:由表1、表2的試驗結果表明:施用復合菌劑效果最好,增產(chǎn)效果顯著，比對照分別增產(chǎn)41.92%,39.23,45.38%，比單一使用氨基寡糖和HM8841菌劑分別增產(chǎn)31.54%和25%、28.85%和22.31%、35.00%和28.46%,增產(chǎn)效果主要表現(xiàn)在花生雙成果和單成果數(shù)量增加，雙秕果和單秕果數(shù)量減少，表現(xiàn)為果實色白、鮮亮、均一，果仁飽滿，商品性好；對花生青枯病控制效果也十分顯著，比對照病株率降低100%，死亡率降低96.43%、95.00%和97.86%，比單一使用氨基寡糖和微生物菌劑病株率和死亡率都有明顯的降低，花生植株的抗逆性增加，葉片光合作用的功能期延長，根系發(fā)達，增強了抵抗力。表I復合菌劑對花生試驗的調查結果
權利要求
1.一種膠凍樣類芽孢桿菌，其特征在于其保藏編號為CGMCC N0.7240。
2.利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于包括如下工藝步驟: A、擴大培養(yǎng) 將原始菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種； 原始菌種選用膠凍樣類芽孢桿菌Paenibacillus mucilaginosus,其保藏編號為CGMCCN0.7240 ； B、制備發(fā)酵液 B1、發(fā)酵 按照體積比為生產(chǎn)菌種:發(fā)酵培養(yǎng)基=10%-15%的比例將生產(chǎn)菌種接種到滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵的條件為:溫度25-32°C，壓力0.03-0.7MPa，通風量控制條件是:發(fā)酵開始后為200-250M3/hr、發(fā)酵4小時后為320_360M3/hr、發(fā)酵8小時后為420_470M3/hr、發(fā)酵12小時后為520-560M3/hr、發(fā)酵20小時后為600-630M3/hr，發(fā)酵開始4_8小時后開始攪拌，直至發(fā)酵終點； 發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質量百 分比的組份組成: 淀粉0.3-1.5%，豆餅粉0.03-0.1%，碳酸鈣0.05-0.2%，蔗糖0.08-0.5%，硫酸銨0.01-0.08%,磷酸氫二鉀 0.08-0.5%,硫酸鎂 0.08-0.5%,三氯化鐵 0.008-0.05%,酵母膏0.03-0.15%，氫氧化鉀 0.01-0.1%，消泡劑 0.005-0.02%，余量為自來水，pH=7.2-7.4 ； B2、檢測及終點控制 發(fā)酵中根據(jù)菌體生長狀況定時取樣、鏡檢，發(fā)酵至40±5小時后取樣鏡檢，當95%的營養(yǎng)體形成芽孢，芽孢含量達到5億個/毫升以上，終止發(fā)酵并制成發(fā)酵液； C、復合微生物菌劑的配制 按照步驟B中制備的發(fā)酵液為69.7-91.2kg、氨基寡糖為8-30kg、復合微量元素添加劑為0.3-0.8kg的比例，將上述組分混配制成復合微生物菌劑；其中復合微量元素添加劑由如下質量的組分組成: 硼砂或硼酸10_20kg，硫酸鋅或氯化鋅5-15kg，鑰酸銨3-12kg，硫酸錳2-8kg。
3.根據(jù)權利要求2所述的利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)包括:A1、斜面菌種的的制備；A2、克氏瓶斜面菌種的制備；A3、生產(chǎn)菌種的制備。
4.根據(jù)權利要求3所述的利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于所述的Al、斜面菌種的制備是:將原始菌種接入滅菌后試管斜面培養(yǎng)基，在25-32°C條件下恒溫培養(yǎng)2-5天制成斜面菌種；所述的試管斜面培養(yǎng)基由如下組分組成: 蔗糖5-15克，磷酸氫二鉀0.2-1克，硫酸鎂0.1-0.5克，氯化鈉0.1-0.5克，碳酸鈣0.5-3克，硫酸鈣0.05-0.3克，酵母膏0.1-1克，水1000毫升，瓊脂15-22克，pH=7.2。
5.根據(jù)權利要求4所述的利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于所述的A2、克氏瓶斜面菌種的制備是:將步驟Al中制備的斜面菌種接入滅菌后的克氏瓶斜面培養(yǎng)基；在25-321:條件下恒溫培養(yǎng)4-6天制成克氏瓶斜面菌種；克氏瓶斜面培養(yǎng)基由如下組份組成: 葡萄糖0.5-2克，蛋白胨0.5-2克，磷酸氫二鉀0.5-2克，硫酸銨0.1_0.5，酵母膏.0.3-1.5克，硫酸鎂0.1-0.5克，水1000ml，瓊脂15-22克，pH=7.2 ;將上述培養(yǎng)基按照每瓶60-80ml的量裝入250ml克氏瓶中，滅菌、擺斜面制成克氏瓶斜面培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權利要求3所述的利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于所述的A3、生產(chǎn)菌種的制備是:將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，經(jīng)通氣培養(yǎng)制成生產(chǎn)菌種；培養(yǎng)條件如下:溫度25-32°C，壓力0.05MPa，通風量0-8小時50-70M3/hr，8小時以后70_90M3/hr，培養(yǎng)周期15-20小時；培養(yǎng)12小時后開始取樣鏡檢觀察生長狀況，當菌體處于對數(shù)期生長期時，含菌量達到工藝要求，無雜菌，即可終止培養(yǎng)；所述的種子培養(yǎng)基由如下質量百分數(shù)的組分組成:淀粉 0.2-1%，豆餅粉 0.1-0.7%，碳酸鈣 0.05-0.3%，蔗糖 0.05-0.3%，硫酸銨 0.1-1%,消泡劑0.005-0.015%，余量為自來水，滅菌后pH=6.3。
7.根據(jù)權利要求2或4-6中任一項所述的利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于所述的滅菌的條件是:溫度為121°C，時間為20-45分鐘。
8.根據(jù)權利要求6中所述的利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于步驟A3是將步驟A2中制備的克氏瓶斜面菌種制成菌懸液接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，步驟A3中采用的種子發(fā)酵罐的容量為2噸，種子培養(yǎng)基在種子發(fā)酵罐中的裝量體積比為 60%-80%。
9.根據(jù)權利要求2所述的利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于所述的步驟BI中的攪拌轉速為730轉/分鐘，采用的發(fā)酵罐的容量為15噸，發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝量體積比為60%-80%。
10.根據(jù)權利要求2所述的利用膠凍樣類芽孢桿菌生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法，其特征在于所述的步驟C中氨基寡糖為為由甲殼素降解而得到的液體產(chǎn)品，含質量百分含量為0.2%-0.5%的氨基寡糖，聚合度為2-10，分子量400-2000。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物制劑的制備，特別是指一種膠凍樣類芽孢桿菌以及利用其生產(chǎn)復合微生物菌劑的方法。選用膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)CGMCC No.7240進行發(fā)酵后，將其發(fā)酵液復配氨基寡糖和相應的微量元素制成復合微生物菌劑。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術存在的綠色生物農用制劑尚無成熟產(chǎn)品、潛在市場缺口較大的問題，具有生產(chǎn)的無公害綠色生物制劑具有農藥和肥料雙重功能，在使用中，可減少用肥次數(shù)和使用成本，產(chǎn)生藥肥互相促進、互相提高的增效作用，具有顯者的環(huán)保價值和社會效益。
文檔編號A01N63/02GK103194410SQ20131011623
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月4日 優(yōu)先權日2013年4月4日
發(fā)明者李軍, 秦艷梅, 趙從波, 王云鵬, 馬清河, 章淑艷, 陳文杰, 古述江, 韓韜, 王鵬 申請人:河北省微生物研究所