專利名稱：基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種條斑紫菜誘變育種方法。
背景技術(shù)：
條斑紫菜屬于大型經(jīng)濟(jì)栽培海藻，其生活史包含單倍體的配子體(葉狀體)階段與二倍體的孢子體(絲狀體)階段，因其葉狀體在海區(qū)栽培，故自然海區(qū)的育種材料的選擇比較困難，因此研究育種工作需要以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)配子體為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)配子體的定向選擇，再取得其二倍體孢子作為種質(zhì)，并通過(guò)海上養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，觀察其性狀表現(xiàn)，以此為基礎(chǔ)，結(jié)合選擇育種、雜交育種等多種育種手段與方法進(jìn)行定向的遺傳改良工作，培育出可以應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)的條斑紫菜優(yōu)良品種。而傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室誘變育種工作主要是集中在突變體的選擇，對(duì)于前期的改造階段，則主要以突變體的生產(chǎn)特性為主要判斷依據(jù)，即在突變體生長(zhǎng)至可明確判斷經(jīng)濟(jì)性狀是否優(yōu)良的階段進(jìn)行關(guān)于品種(系)性狀的判斷與篩選，而無(wú)法根據(jù)藻體的外在突變性狀(如色素體類別)對(duì)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)改良的優(yōu)良品系的藻體進(jìn)行鑒別，必須通過(guò)海上養(yǎng)殖才能確認(rèn)育種工作的成效。而且在養(yǎng)殖海區(qū)直接進(jìn)行大田選育的方法所耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，并且需要數(shù)年時(shí)間完成對(duì)性狀的純化工作，才能培育出新的品種。這種技術(shù)方法造成的育種周期長(zhǎng)，效率低下的問(wèn)題，需要新的育種技術(shù)手段的來(lái)解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效、快速、簡(jiǎn)便、操作性強(qiáng)的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:包括下列步驟:
(I)人工誘變:采用自然海區(qū)養(yǎng)殖的野生或經(jīng)改良的條斑紫菜葉狀體，除去雜藻，洗凈，對(duì)其進(jìn)行人工誘變處理；誘變采用6ciCo-Y射線進(jìn)行輻照，照射劑量為500-1000Gy，經(jīng)過(guò)誘變處理的條斑紫菜葉狀體在黑暗中靜置3天后，在光照強(qiáng)度30 μ mo I m —2*s —1溫度18°C的條件下進(jìn)行充氣培養(yǎng)，15天后進(jìn)行變異細(xì)胞的酶解與分離；
(2)變異細(xì)胞的酶解與分離:用海洋細(xì)菌酶處理經(jīng)誘變后的葉狀體，分離出色素突變細(xì)胞，并將其培養(yǎng)為葉狀體；
(3)依據(jù)良種選拔目標(biāo)選拔出優(yōu)良再生葉狀體，進(jìn)行單株培養(yǎng)；
(4)對(duì)篩選出來(lái)的優(yōu)良色素突變體再生葉狀體的生長(zhǎng)性狀以及主要光合色素和色素蛋白以及活體吸收光譜進(jìn)行定性和定量測(cè)定，以鑒定條斑紫菜色素突變體再生葉狀體的生長(zhǎng)性狀與經(jīng)濟(jì)品質(zhì)的優(yōu)劣與遺傳穩(wěn)定性；
(5)將確定為優(yōu)良品系的色素突變 葉狀體進(jìn)行再次酶解，培養(yǎng)成再生葉狀體，待藻體成熟之前通過(guò)單性生殖技術(shù)取得二倍體純系絲狀體；
(6)純系絲狀體通過(guò)促熟，使其放散殼孢子，培養(yǎng)成Fl代葉狀體，并檢驗(yàn)其品質(zhì)與遺傳穩(wěn)定性；(7)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的良種純系絲狀體粉碎后進(jìn)行貝殼育苗試驗(yàn)，在貝殼絲狀體上采苗于養(yǎng)殖網(wǎng)簾，進(jìn)行葉狀體色素突變體優(yōu)良品系海區(qū)養(yǎng)殖試驗(yàn)；
(8)良種的自由絲狀體保持在實(shí)驗(yàn)室。所述生長(zhǎng)性狀為藻體在60日齡內(nèi)的長(zhǎng)度，藻體厚度、藻體濕重及耐高溫性。主要光合色素和色素蛋白為:葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白。所述選拔目標(biāo)為葉片長(zhǎng)度、厚度、蛋白含量、生長(zhǎng)周期或成熟期長(zhǎng)短。步驟(I)中的照射劑量為500Gy。上述所用酶解液的酶為海洋細(xì)菌酶。本發(fā)明將大型栽培藻類條斑紫菜育種由后期海上栽培實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，轉(zhuǎn)變?yōu)樵缙诘膶?shí)驗(yàn)室內(nèi)預(yù)測(cè)和判斷，利用Y-射線輻照處理獲得條斑紫菜色素突變體的穩(wěn)定遺傳，選擇與育種目標(biāo)性狀相關(guān)的突變個(gè)體，以此作為育種對(duì)象進(jìn)行育種。本發(fā)明將大型海藻條斑紫菜的選育工作由局限于生活史后期的海上栽培階段轉(zhuǎn)變?yōu)樵缙趯?shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)色素突變體的檢測(cè)與篩選。本發(fā)明可以結(jié)合多種生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行育種工作，如以高溫為選育條件可以篩選耐高溫品系，以鹽度為選育條件可以篩選耐高鹽與耐低鹽品系。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。圖1是經(jīng)6tlC0- Y射線輻·射后條斑紫菜葉狀體上形成的不同顏色變異細(xì)胞塊示意 其中:1.野生型細(xì)胞；2.深紅色變異細(xì)胞塊；3.紅色變異細(xì)胞塊；4.桔黃色變異細(xì)胞塊；5.紫紅色變異細(xì)胞塊；6.金黃色變異細(xì)胞塊；7.淺灰色變異細(xì)胞塊；8.青橄欖色變異細(xì)胞塊；9.黃綠色變異細(xì)胞塊。1-9均為經(jīng)6tlCo- Y射線輻射(500 Gy)后再培養(yǎng)4周的細(xì)胞，圖中標(biāo)尺均代表50 Mm。圖2是條斑紫菜色素突變體的再生小葉狀體示意 其中:1.野生型葉狀體；2-9.色素突變體,分別為ros (桔紅色)、ro# (深紅色)、co/ (紫紅色)、oro (紅色)、/re (淺桔黃色)、iec (紅褐色)、_Fe7 (青橄欖色)、沿"r (綠色)。1-9中的苗齡均為25 d0圖中標(biāo)尺均代表50 Mm。圖3是經(jīng)6tlCo-Y射線輻射后獲得的條斑紫菜色素突變體示意圖。1.野生型葉狀體；2-9.色素突變體，分別為(桔紅色(深紅色)、co/7(紫紅色)、oro (紅色)、/re (淺桔黃色)、iec (紅褐色)、_Fe7 (青橄欖色)、■§.# (綠色)。I中的苗齡為70 d ;2、8、9中的苗齡為83d ;3、4、5中的苗齡為65 d;6，7中的苗齡為52 d。圖中標(biāo)尺均代表50 Mm。
具體實(shí)施例方式一種基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:包括下列步驟:
(I)人工誘變:采用自然海區(qū)養(yǎng)殖的野生或經(jīng)改良的條斑紫菜葉狀體，除去雜藻，洗凈，
對(duì)其進(jìn)行人工誘變處理；誘變采用6ciCo-Y射線進(jìn)行輻照，照射劑量為500-1000Gy，經(jīng)過(guò)誘變處理的條斑紫菜葉狀體在黑暗中靜置3天后，在光照強(qiáng)度30 μ molm —2*s —1溫度18°C的條件下進(jìn)行充氣培養(yǎng)，15天后進(jìn)行變異細(xì)胞的酶解與分離；(2)變異細(xì)胞的酶解與分離:用海洋細(xì)菌酶處理經(jīng)誘變后的葉狀體，分離出色素突變細(xì)胞，并將其培養(yǎng)為葉狀體；
(3)依據(jù)良種選拔目標(biāo)選拔出優(yōu)良再生葉狀體，進(jìn)行單株培養(yǎng)；
(4)對(duì)篩選出來(lái)的優(yōu)良色素突變體再生葉狀體的生長(zhǎng)性狀以及主要光合色素和色素蛋白以及活體吸收光譜進(jìn)行定性和定量測(cè)定，以鑒定條斑紫菜色素突變體再生葉狀體的生長(zhǎng)性狀與經(jīng)濟(jì)品質(zhì)的優(yōu)劣與遺傳穩(wěn)定性；
(5)將確定為優(yōu)良品系的色素突變?nèi)~狀體進(jìn)行再次酶解，培養(yǎng)成再生葉狀體，待藻體成熟之前通過(guò)單性生殖技術(shù)取得二倍體純系絲狀體；
(6)純系絲狀體通過(guò)促熟，使其放散殼孢子，培養(yǎng)成Fl代葉狀體，并檢驗(yàn)其品質(zhì)與遺傳穩(wěn)定性；
(7)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的良種純系絲狀體粉碎后進(jìn)行貝殼育苗試驗(yàn)，在貝殼絲狀體上采苗于養(yǎng)殖網(wǎng)簾，進(jìn)行葉狀體色素突變體優(yōu)良品系海區(qū)養(yǎng)殖試驗(yàn)；
(8)良種的自由絲狀體保持在實(shí)驗(yàn)室。所述生長(zhǎng)性狀為藻體在60日齡內(nèi)的長(zhǎng)度，藻體厚度、藻體濕重及耐高溫性。主要光合色素和色素蛋白為:葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白。所述選拔目標(biāo)為葉片長(zhǎng)度、厚度、蛋白含量、生長(zhǎng)周期或成熟期長(zhǎng)短。步驟(I)中的照射劑量為500Gy ;在輻照劑量為O 500 Gy范圍內(nèi)，葉狀體上色素變異細(xì)胞塊的出現(xiàn)頻率隨著輻照劑量的增加而增加；但輻照劑量增至700 Gy時(shí)，色素變異細(xì)胞塊出現(xiàn)的頻率反而下降 ，說(shuō)明500 Gy是合適的輻照劑量。色素變異細(xì)胞塊出現(xiàn)的頻率在同一葉狀體的不同部位是不同的，從基部到梢部，隨著部位的上移而逐漸增加。在O 500 Gy范圍內(nèi)，在葉片的基部、中部到稍部等三個(gè)部位，色素變異細(xì)胞塊出現(xiàn)的頻率均隨著輻照劑量的增加而增加，尤其在細(xì)胞分裂旺盛的稍部其增加更加明顯，但超過(guò)500 Gy后，各部位的色素變異細(xì)胞塊數(shù)量均隨著誘變劑量的增加反而減少。上述所用酶解液的酶為海洋細(xì)菌酶。用酶解法把含色素變異細(xì)胞的葉狀體細(xì)胞單個(gè)分離出來(lái)并進(jìn)行離體培養(yǎng)，在它們的再生體中，出現(xiàn)了多種單色的色素突變體，分離到row (深紅色)、co/7 (紫紅色)、oro (紅色)、/re (淺桔黃色)、iec (紅褐色(桔紅色)、yel (青橄欖色)、μτ (綠色)等多種不同顏色的純色突變體。8種突變體葉狀體的活體吸收光譜與野生型葉狀體一樣，在波長(zhǎng)350 750 nm之間，均有5個(gè)明顯的吸收高峰，但各吸收峰的形狀和各峰頂所處的波長(zhǎng)與打相比存在一定的差異。與野生型(#)相比，多種色素突變體的主要色素和色素蛋白含量均發(fā)生了明顯的變化，其中，PE的變化最明顯；色素突變體的三種主要色素之間的比例也存在著明顯的差
巳用酶解法將經(jīng)6tlCo-Y射線處理后的條斑紫菜葉狀體細(xì)胞單個(gè)分離出來(lái)并進(jìn)行離體培養(yǎng)，從它們的再生體中，還篩選到Y(jié)Z-1、YZ-2、YZ-3, YZ-4和YZ-5等5個(gè)優(yōu)良純系。它們與傳統(tǒng)養(yǎng)殖的野生品系(^)相比，在藻體的體型、顏色、主要光合色素和色素蛋白含量、生長(zhǎng)和成熟等方面均具有明顯的優(yōu)良特性。在波長(zhǎng)350 750 nm之間，5個(gè)優(yōu)良品系的葉狀體活體吸收光譜曲線與wt 一樣，均有5個(gè)明顯的吸收高峰，各峰的形狀和峰頂所處的波長(zhǎng)與wt相比存在一定的差異，尤其是各峰值的差別很大，尤其是5個(gè)優(yōu)良品系的P3和P4兩個(gè)峰值均比wt高。5個(gè)優(yōu)良品系ΥΖ-1、ΥΖ-2、ΥΖ-3、ΥΖ-4和7U的藻膽蛋白含量(PE和PC含量之和)分別比Wt高出96%、75%、35%、60%和58%，其中PE含量的增加尤為顯著，分別比wt增加了 74%、59%、25%、58%和41%。與wt相比，5個(gè)優(yōu)良品系的主要色素之間的比例也存在明顯的差異。各優(yōu)良品系的優(yōu)良特征在F1葉狀體里均充分地表現(xiàn)出來(lái)，每個(gè)品系內(nèi)的F1葉狀體其顏色和形態(tài)很一致，說(shuō)明這5個(gè)優(yōu)良品系是純系，其優(yōu)良性狀能穩(wěn)定地遺傳下去。在進(jìn)行耐高溫實(shí)驗(yàn)中，和7K兩個(gè)優(yōu)良品系表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐高溫性。野生型(#)的葉狀體圓盤(pán)體在23 °C培養(yǎng)時(shí)，第10天就開(kāi)始腐爛，而FZ-J和YZ-4的圓盤(pán)體分別在第20天和30天才開(kāi)始腐爛。5個(gè)優(yōu)良品系的F1葉狀體生長(zhǎng)曲線顯示，它們的成熟期均比Wt晚，快速生長(zhǎng)期至少比wt延長(zhǎng)了一倍以上。與wt相比，5個(gè)優(yōu)良品系的F1葉狀體的特定生長(zhǎng)率在培養(yǎng)的第31 70天內(nèi)，差異不明顯；但在第71 90天之間，差異非常顯著，是打的13 20倍。另夕卜，這5個(gè)優(yōu)良品系 的成熟期均比wt品系推遲許多。
權(quán)利要求
1.一種基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:包括下列步驟: (I)人工誘變:采用自然海區(qū)養(yǎng)殖的野生或經(jīng)改良的條斑紫菜葉狀體，除去雜藻，洗凈，對(duì)其進(jìn)行人工誘變處理；誘變采用6ciCo-Y射線進(jìn)行輻照，照射劑量為500-1000Gy，經(jīng)過(guò)誘變處理的條斑紫菜葉狀體在黑暗中靜置3天后，在光照強(qiáng)度30 μ mo I m —2*s —1溫度18°C的條件下進(jìn)行充氣培養(yǎng)，15天后進(jìn)行變異細(xì)胞的酶解與分離； (2)變異細(xì)胞的酶解與分離:用海洋細(xì)菌酶處理經(jīng)誘變后的葉狀體，分離出色素突變細(xì)胞，并將其培養(yǎng)為葉狀體； (3)依據(jù)良種選拔目標(biāo)選拔出優(yōu)良再生葉狀體，進(jìn)行單株培養(yǎng)； (4)對(duì)篩選出來(lái)的優(yōu)良色素突變體再生葉狀體的生長(zhǎng)性狀以及主要光合色素和色素蛋白以及活體吸收光譜進(jìn)行定性和定量測(cè)定，以鑒定條斑紫菜色素突變體再生葉狀體的生長(zhǎng)性狀與經(jīng)濟(jì)品質(zhì)的優(yōu)劣與遺傳穩(wěn)定性； (5)將確定為優(yōu)良品系的色素突變?nèi)~狀體進(jìn)行再次酶解，培養(yǎng)成再生葉狀體，待藻體成熟之前通過(guò)單性生殖技術(shù)取得二倍體純系絲狀體； (6)純系絲狀體通過(guò)促熟，使其放散殼孢子，培養(yǎng)成Fl代葉狀體，并檢驗(yàn)其品質(zhì)與遺傳穩(wěn)定性； (7)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的良種純系絲狀體粉碎后進(jìn)行貝殼育苗試驗(yàn)，在貝殼絲狀體上采苗于養(yǎng)殖網(wǎng)簾，進(jìn)行葉狀體色素突變體優(yōu)良品系海區(qū)養(yǎng)殖試驗(yàn)； (8)良種的自由絲狀體保持在實(shí)驗(yàn)室。
2.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:所述生長(zhǎng)性狀為藻體在60日齡內(nèi)的長(zhǎng)度，藻體厚度、藻體濕重及耐高溫性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:主要光合色素和色素蛋白為:葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:所述選拔目標(biāo)為葉片長(zhǎng)度、厚度、蛋白含量、生長(zhǎng)周期或成熟期長(zhǎng)短。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:步驟(I)中的照射劑量為500Gy。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，包括人工誘變、變異細(xì)胞的酶解與分離、依據(jù)良種選拔目標(biāo)選拔出優(yōu)良再生葉狀體單株培養(yǎng)、對(duì)篩選出來(lái)的優(yōu)良色素突變體再生葉狀體進(jìn)行定性和定量測(cè)定；再次酶解，培養(yǎng)成再生葉狀體，通過(guò)單性生殖技術(shù)取得二倍體純系絲狀體，再培養(yǎng)成F1代葉狀體；良種純系絲狀體粉碎后進(jìn)行貝殼育苗試驗(yàn)，在貝殼絲狀體上采苗于養(yǎng)殖網(wǎng)簾，進(jìn)行葉狀體色素突變體優(yōu)良品系海區(qū)養(yǎng)殖試驗(yàn)。本發(fā)明將大型栽培藻類條斑紫菜育種由后期海上栽培實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，轉(zhuǎn)變?yōu)樵缙诘膶?shí)驗(yàn)室內(nèi)預(yù)測(cè)和判斷，利用射線輻照處理獲得條斑紫菜色素突變體的穩(wěn)定遺傳，選擇與育種目標(biāo)性狀相關(guān)的突變個(gè)體，作為育種對(duì)象進(jìn)行育種。
文檔編號(hào)A01H1/04GK103109741SQ20131007637
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月12日
發(fā)明者呂峰, 嚴(yán)興洪, 李峰, 王小紅, 周榮彬 申請(qǐng)人:呂峰