專利名稱：一種鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA—tsa-miRn1927及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA — tsa-miRnl927及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
土壤鹽潰化已成為影響農(nóng)作物生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的一個重要因素，是農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因之一。目前，世界上約有20%的可耕地和至少40%的灌溉田具有不同程度的鹽潰化，隨著人口的劇增及工業(yè)化的高速發(fā)展，可耕地面積急劇下降，不合理灌溉、工業(yè)污染的加劇和化肥使用不當(dāng)，造成了大量良田的次生鹽潰化，預(yù)計到2050年全球?qū)⒂?0%的耕地發(fā)生不同程度的鹽潰化。自然界中，植物對鹽的適應(yīng)有明顯的差異，適應(yīng)范圍非常廣泛，既有鹽敏感的甜土植物，又有耐鹽的鹽生植物。由于大多數(shù)農(nóng)作物為鹽敏感的甜土植物，鹽依然是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因素。目前，對植物耐鹽機(jī)理的研究已有一定的進(jìn)展，例如擬南芥S0S1、S0S2、S0S3途徑的發(fā)現(xiàn)及其耐鹽機(jī)理的闡明(Zhu J.K.Salt and drought stress signal transduction in plants.Annu.Rev.PlantBiol.，2002, 53:247-273.), Blumwald實(shí)驗室過量表達(dá)AtNHXl對于提高植物耐鹽性所產(chǎn)生的影響(Apse Μ.P, Blumwald E, etal.Salt Tolerance conferred by Overexpression ofa Vacuolar Na./H+antiporter in Arabidopsis.Science.1999，285:1256-1258.)等。但目前國際上對植物耐鹽機(jī)理的研究，主要集中于甜土植物，因而對于植物耐鹽性機(jī)理的了解還存在一定的局限性。鹽芥(Thellungiella salsuginea)是與擬南芥近緣的植物耐鹽分子遺傳學(xué)研究的新模式系統(tǒng)，鹽芥的基因組測序已由美國農(nóng)業(yè)部在2011年底完成，其基因組序列網(wǎng)站參見:http://www.phytozome.net/thellungiella.php。鹽芥和擬南芥同為十字花科植物，在cDNA水平上兩者存在90%- 95%的相似性。但相對于甜土植物擬南芥，鹽芥為一種典型的鹽生植物，能天然適應(yīng)于鹽脅迫的環(huán)境，即使短時間暴露于500mM NaCl也可完成其生長史。隨著鹽芥基因組測序的完成，鹽芥功能基因組學(xué)尤其是耐鹽相關(guān)基因的功能已成為其研究工作的重點(diǎn)。miRNA為廣泛存在于真核生物中大約21_24nt的非編碼RNAs，植物miRNAs大多靶向轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控蛋白，從而處于植物基因表達(dá)調(diào)控的中心位置。而逆境脅迫(鹽、硫或磷匱乏和氧化脅迫等)不僅會誘導(dǎo)植物蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，也誘導(dǎo)一些非蛋白質(zhì)編碼基因miRNA的表達(dá)。植物miRNAs是目前國際研究的熱點(diǎn)，但僅有少數(shù)實(shí)驗室關(guān)注耐鹽相關(guān)miRNAs，且主要是以模式植物擬南芥和水稻等為試材，例如在擬南芥、水稻和楊樹等物種中克隆到與鹽、磷缺乏、硫缺乏、氧化和力學(xué)脅迫等相關(guān)的miRNAs ;結(jié)果表明miRNAs作為革巴蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其調(diào)節(jié)功能不僅在于植物發(fā)育、也在對鹽等逆境脅迫的應(yīng)答等過程中擔(dān)任重要的調(diào)控作用。鑒于土壤鹽潰化已成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一，通過研究植物耐鹽脅迫的生理生化和分子生物學(xué)機(jī)制，挖掘耐鹽基因資源，并運(yùn)用基因工程手段培育耐鹽作物，對于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因而，以鹽芥這一耐鹽分子遺傳學(xué)研究的新模式系統(tǒng)為試材，進(jìn)行其miRNAs及其與耐鹽性關(guān)系的研究，具有一定的前瞻性和創(chuàng)新性。另外，在可檢索的現(xiàn)有技術(shù)中，對鹽芥miRNAs的研究還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供來源于鹽芥的miRNA—tsa_miRnl927鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA、其前體序列及其應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下:一種鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。上述鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。編碼上述鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體的DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。上述鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA、鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體在培育耐鹽轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。作為上述應(yīng)用的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟如下:在作物中過表達(dá)SEQ ID N0.1所示的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA 或者SEQ ID N0.2所示的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體，或抑制SEQ ID N0.1所示的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體，培育出具有高耐鹽性的轉(zhuǎn)基因作物。上述作物為小麥、水稻、玉米或棉花。本發(fā)明的實(shí)驗Solexa測序結(jié)果證明，tsa-miRnl927受鹽脅迫的調(diào)節(jié),說明其在鹽芥的高鹽耐性機(jī)制中起重要作用。鑒于此，可利用該基因進(jìn)行耐鹽轉(zhuǎn)基因作物的培育，進(jìn)而對于提高作物的產(chǎn)量具有潛在的應(yīng)用價值。有 益效果本發(fā)明采用Solexa高通量測序技術(shù)及隨后的生物信息學(xué)分析和實(shí)時定量PCR的技術(shù)，首次從鹽芥中鑒定了 tsa-miRnl927, tsa_miRnl927在鹽處理后下調(diào)，鹽處理小RNAs庫中其計數(shù)0，而對照中為2363，tsa-miRnl927在鹽處理后表達(dá)受到嚴(yán)重抑制；經(jīng)驗證，tsa-miRnl927在植物耐逆性尤其是耐鹽性中起重要作用，并在耐鹽作物培育中具潛在的應(yīng)用價值。


圖ltsa_miRnl927前體序列的二級結(jié)構(gòu)圖；其中:陰影部分為成熟miRNA所在位置；圖2Solexa測序中tsa_miRnl927在對照和鹽處理下的表達(dá)豐度的柱狀示意圖；其中:CL為正常生長鹽芥tsa-miRnl927的表達(dá)水平，TL為200mM NaCl處理下鹽芥tsa_miRnl927的表達(dá)水平；圖3tsa-miRnl927 對靶基因 Ninja-family 蛋白 AFP4、轉(zhuǎn)錄因子 PH0X2/ARIX 和絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶基因的mRNA降解示意圖；圖4為轉(zhuǎn)基因鹽芥與野生鹽芥在不同濃度鹽脅迫條件下鮮干重的柱狀示意圖；其中:A圖為鮮重的柱狀示意圖，M3-14為轉(zhuǎn)基因鹽芥M3-14、M5-3為轉(zhuǎn)基因鹽芥M5-3、WT為野生型鹽芥；B圖為干重的柱狀示意圖，M3-14為轉(zhuǎn)基因鹽芥M3-14、M5_3為轉(zhuǎn)基因鹽芥M5-3、WT為野生型鹽芥。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。下述實(shí)施例中的實(shí)驗方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。實(shí)施例1:鹽芥種子采集和種植在山東省東營市黃河三角洲鹽堿地收集野生型鹽芥(Thellungiellasalsuginea)的種子，曬干,經(jīng)過表面消毒:體積百分比為70%的酒精,處理lmin, lwt%NaC10溶液，渦旋15min，無菌雙蒸水沖洗后播種于MS培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定:白天25°C，16h，晚間22°C，8h。待長出2片真葉后轉(zhuǎn)移到Hogland液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5周后，進(jìn)行分組。NaCl處理組為Hogland營養(yǎng)液中加入NaCl使其終濃度為200mM，培養(yǎng)24小時；對照組為不含NaCl的Hogland營養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時。MS培養(yǎng)基組分如下:大量元素50ml/L,韓鹽溶液50ml/L,微量元素溶液5ml/L,鐵鹽溶液10ml/L，維生素溶液10ml/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉7.5g/L。其中，大量元素為20 倍母液，組分為:KN0338g/L，NH4N0333g/L, MgSO4.7H207.4g/L, KH2P043.4g/L ；鈣鹽溶液為20倍母液，組分為=CaCl2.2H208.8g/L ；微量元素溶液為200 倍母液，組分為:K10.166g/L，H3BO3L 24g/L，MnSO4.4H204.46g/L, ZnSO4.7H201.72g/L, Na2MoO4.2H200.05g/L, CuSO4.5H200.005g/L, CoCl2
6H200.005g/L ；鐵鹽溶液為100倍母液組分為:FeS04—EDTA3.67g/L ；維生素溶液為100倍母液，組分為:煙酸0.05g/L,維生素B60.05g/L,維生素BI0.0lg/L,甘氨酸 0.2g/L，肌醇 10g/L。Hogland 營養(yǎng)液每升組分如下:Ca (NO3) 2945mg, KN03607mg, (NH3) 3P03 磷酸銨115mg，MgS04493mg,鐵鹽溶液IOml，微量元素溶液5ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0。其中鐵鹽溶液為100倍母液，組分為:FeS04—EDTA3.67g/L ；微量元素溶液為200 倍母液，組分為:K10.166g/L，H3BO3L 24g/L，MnSO4.4H204.46g/L, ZnSO4.7H201.72g/L, Na2MoO4.2H200.05g/L, CuSO4.5H200.005g/L, CoCl2.6H200.005g/Lo實(shí)施例2:鹽芥miRNA文庫的構(gòu)建和Solexa測序
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將實(shí)施例1得到的正常生長條件下-對照組(CL)和200mM NaCl處理下-處理組(TL)的鹽芥樣品送往深圳華大基因研究所構(gòu)建miRNA文庫，進(jìn)行Solexa測序。測序后去除3’接頭、污染序列、小于18nt序列和polyA序列后，在CLmiRNA文庫中總共獲得高質(zhì)量小RNA片段(sRNA) 12010658條，在TL miRNA文庫中總共獲得高質(zhì)量小RNA片段(sRNA)12330771條。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示tsa-miRnl927成熟體序列為:CAAGGCAGAAGAAGGCUGUUU (SEQ ID N0.1)。
tsa_miRnl927 前體序列為:GCAAAGUGAUCAAGGCAGAAGAAGGCUGUUUUGGCAAUAGGAUUAGCGCUGAUCCUAUUGCCAAAACAGCCUCUUCUUCCUUGUUUACUUUGA (SEQ ID N0.2),其在基因組中位置為:scaffold_19:2418388:2418480:+。根據(jù)tsa_miRnl927的前體和成熟體序列，用RNAstructure軟件得到tsa_miRnl927前體的二級結(jié)構(gòu)，如圖1所示，陰影部分為成熟miRNA所在位置，其前體序列折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能量值為-63.1。屬于miRNA前體典型的二級結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。測序結(jié)果顯示tsa_miRnl927在正常條件下的測序豐度為2363，鹽處理后的測序豐度為0，表明tsa-miRnl927的表達(dá)在受到鹽脅迫后被抑制(圖2)。預(yù)示著tsa_miRnl927在鹽芥適應(yīng)高鹽脅迫機(jī)制中起重要作用。在農(nóng)作物(例如玉米、小麥、水稻、油菜、大豆等)中過量或者抑制tsa-miRnl927的表達(dá)，將影響作物對鹽脅迫的適應(yīng)能力。實(shí)施例3:tsa-miRnl927祀基因的驗證和功能分析利用miRNA和靶基因的互補(bǔ)性，通過生物信息學(xué)的方法在鹽芥全基因組水平預(yù)測tsa_miRnl927 的祀基因。按照 Schwab 等的方法(Schwab R et al.,Specific effects ofmicroRNAs on plant transscriptome.Dev.Cell, 2005)使用以下規(guī)則:sRNA與祀基因間的錯配不得超過4個(G-U配對認(rèn)為0.5個錯配)；在miRNA/靶基因復(fù)合體中不得有超過2處發(fā)生相鄰位點(diǎn)的錯配；在miRNA/靶基因復(fù)合體中，從miRNA的5’端起第2_12個位點(diǎn)不得有相鄰位點(diǎn)都發(fā)生錯配；miRNA/靶基因復(fù)合體的第10-11個位點(diǎn)不得發(fā)生錯配^miRNA/靶基因復(fù)合體中，從miRNA的5’端起第1-12個位點(diǎn)不得有超過2.5個錯配;miRNA/靶基因復(fù)合體的最低自由能(MFE)應(yīng)不小于該miRNA與其最佳互補(bǔ)體結(jié)合時MFE的75%。用Mireap軟件在鹽芥全基因組水平預(yù)測靶基因。表ltsa_miRnl927 靶基因預(yù)測
權(quán)利要求
1.一種鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體，核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
3.編碼權(quán)利要求2所述鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體的DNA片段，核苷酸序列如SEQIDN0.3 所示。
4.權(quán)利要求1所述鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA、權(quán)利要求2所述鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體在培育耐鹽轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下:在作物中過表達(dá)SEQID N0.1所示的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體,或抑制SEQ ID N0.1所示的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體，培育出具有高耐鹽性的轉(zhuǎn)基因作物。
6.如權(quán)利要求5所 述的應(yīng)用，其特征在于，所述作物為小麥、水稻、玉米或棉花。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA—tsa-miRn1927及其應(yīng)用。鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本發(fā)明還涉及鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體、鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA的前體的DNA片段及其在培育耐鹽轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的鹽芥耐鹽性調(diào)控miRNA—tsa-miRn1927在植物耐逆性尤其是耐鹽性中起重要作用，并在耐鹽作物培育中具潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號A01H5/00GK103146701SQ201310039148
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者王興軍, 趙傳志, 張荃, 趙術(shù)珍, 侯蕾, 夏晗, 李長生, 李愛芹 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心