棉花中的種子特異性啟動子的制作方法
【專利摘要】本申請披露了一種（分離的）核酸序列，該核酸序列包含選自以下的核苷酸序列：(a)SEQ?ID?NO:1或其片段，其中所述片段包含SEQ?IDNO:1的至少400個連續(xù)核苷酸并且具有種子特異性啟動子活性，(b)與SEQ?ID?NO:1具有至少80%序列同一性并具有種子特異性啟動子活性的核苷酸序列；(c)在嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；以及(d)與(a)至(c)中任一項的核苷酸序列互補的核苷酸序列。本文中進一步披露一種嵌合基因，該嵌合基因包含本文所述的與編碼感興趣表達產(chǎn)物的核酸可操作地連接的（分離）核酸，以及任選地轉(zhuǎn)錄終止序列及多聚腺苷化序列。本文中還披露了如權(quán)利要求書中表征的一種載體、一種轉(zhuǎn)基因植物細胞、一種轉(zhuǎn)基因植物和一種種子。本文所披露的方法涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、培育棉花、產(chǎn)生種子、實現(xiàn)產(chǎn)物在棉花中的種子特異性表達以及在棉花植物中改變纖維特性的種子特異性表達，如權(quán)利要求書中所表征。
【專利說明】棉花中的種子特異性啟動子
[0001]本申請披露了一種(分離的)核酸序列，其包含選自以下的核苷酸序列:(a) SEQ IDNO:1或其片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:1的至少400個連續(xù)核苷酸并且具有種子特異性啟動子活性，(b)與(a)的核苷酸序列具有至少80%序列同一性并具有種子特異性啟動子活性的核苷酸序列；(c)在嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；以及(d)與(a)至(C)中任一項的核苷酸序列互補的核苷酸序列。本文中進一步公開一種嵌合基因，其包含本文所述的與編碼感興趣表達產(chǎn)物的核酸可操作地連接的(分離)核酸和任選地轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷化序列。本文中還公開了如權(quán)利要求書中表征的一種載體、轉(zhuǎn)基因植物細胞、轉(zhuǎn)基因植物和種子。本文所公開的方法涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、培育棉花、產(chǎn)生種子、實現(xiàn)產(chǎn)物在棉花中的種子特異性表達和實現(xiàn)在棉花植物中改變纖維特性的種子特異性表達，如權(quán)利要求書中所表征。
[0002]在本說明書中，引用多份文獻，包括專利申請和生產(chǎn)商的手冊。這些文獻的公開內(nèi)容，盡管不認為與本發(fā)明可專利性相關(guān)，通過引用的方式完整結(jié)合在此。更具體地，參考的全部文獻通過引用的方式以相同的程度結(jié)合，如同專門且個別地指出通過引用的方式結(jié)合每份單獨的文獻。
[0003]毛狀體是在大部分陸地植物的地上器官的表面上存在的特化表皮附屬物。存在幾種類型的毛狀體:單細胞或多細胞的、分支或不分支的和腺狀或非腺狀。毛狀體有助于植物適應(yīng)于生物脅迫和非生物脅迫的多個方面，如擋開草食昆蟲、調(diào)節(jié)表面溫度、減少水經(jīng)蒸騰丟失，增加冰凍耐受性、輔助種子散布和保護植物組織免遭UV影響(Eisner等人，1998 ；Werker, 2000 ;Wagner等人，2004)。腺狀分泌性毛狀體(GST)經(jīng)常分泌植物次級代謝物以構(gòu)成基于天然產(chǎn)物的草食動物和病原體抵抗力(Werker, 2000 ;Ranger和Hower, 2001 ；ffagner等人,2004 ；Medeiros 和 Tingey, 2006)。
[0004]不同的植物種可以具有不同類型的毛狀體，并且一種植物可以形成多于一個類型的毛狀體。一年生雜草擬南芥(Arabidopsis thaliana)產(chǎn)生單細胞非腺狀毛狀體,它們可以是分支或不分支的(Szymanski等人，2000)。煙草植物通常含有多細胞毛狀體，包括高的腺狀分泌性毛狀體(GST)和 簡單的非腺狀毛狀體(Wagner等人，2004)。棉纖維是單細胞的和充分伸長的種子毛狀體(Kim和Triplett, 2001)。
[0005]棉纖維是世界范圍內(nèi)唯一最重要的紡織原料。全球每年收獲約八千萬英畝棉花。按英畝土地面積生產(chǎn)量而言，棉花是美國第五大作物，在2006年至2008年平均種植一千零三十萬英畝。全球種植的棉花中大約90%是陸地棉(Gossypium hirsutum),而海島棉(Gossypium barbadense)占大約8%。因此,育種中的主要努力是通過經(jīng)典方法或通過遺傳改變棉花植物的基因組來調(diào)節(jié)棉纖維特征以更好地適應(yīng)工業(yè)及消費者的需要。待實現(xiàn)的目的包括增加的棉絨(lint)纖維長度、強度、可染性、減少的棉短絨產(chǎn)生、纖維成熟度比率、未成熟纖維含量、纖維整齊度和馬克隆尼值。
[0006]棉纖維發(fā)育是一個受眾多基因調(diào)節(jié)的多階段過程，多個所述基因在形成纖維細胞時上調(diào)或高表達(Li, C.H.等人，2002 ；Ruan等人，2003 ；ffang, S.等人，2004 ；Li等人，2005 ；Luo 等人，2007)。[0007]已經(jīng)描述了驅(qū)動棉籽中基因表達的不同啟動子。來自棉花的種子特異性或毛狀體特異性啟動子是熟知的，異源啟動子也用來控制棉花中的種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性表達。
[0008]E6是第一個鑒定的棉纖維基因，并且E6啟動子已經(jīng)用于對棉纖維品質(zhì)進行工程化(John和Keller，1996)。GhRDLl，一種在棉纖維細胞中在伸長階段高度表達的基因，編碼含有的BURP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(Li，C.H.等人，2002)，并且GaRDLl啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中顯示毛狀體特異性活性(Wang，S.等人，2004)。GhTUBl轉(zhuǎn)錄物優(yōu)先地在纖維中以高水平積累，因而pGhTUBl::GUS融合基因在纖維中以高水平表達，但在其他組織中以低得多的水平表達(Li，X.B.等人，2002)。三種棉花脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因LTP3、LTP6和FSltp4的啟動子能夠在轉(zhuǎn)基因煙草植物中指導(dǎo)⑶S基因在葉和莖GST中的表達(Hsu等人，1999 ；Liu等人,2003 ；Delaney等人,2007),然而,它們不展示出表現(xiàn)清晰的組織特異性。例如,在pFSltp4::⑶S轉(zhuǎn)基因煙草植物中，可以在全部類型的毛狀體中檢測到強烈的⑶S活性；此外，⑶S表達也在葉緣、維管組織、胚珠和根尖處可見(Delaney等人，2007)。
[0009]棉花R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子GaMYB2已經(jīng)顯示是擬南芥GLABRA1 (GLl)(擬南芥毛狀體形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物)的功能同源物。GaMYB2在處于發(fā)育早期階段的棉纖維細胞中表達(Wang, S.等人，2004)。它的啟動子還驅(qū)動擬南芥中的毛狀體特異性表達和煙草中的GST頭部特異性表達(Shangguan等人,2008)。
[0010]美國專利7，626，081披露了存在于α球蛋白基因中的棉籽特異性啟動子。啟動子Gh-sp源自種子蛋白基因并且僅在正在成熟的棉籽中有活性(Song等人，2000)。
[0011]來自碧冬茄(Petunia)的FBP7啟動子控制MADS-框轉(zhuǎn)錄因子并且已知具有種子特異性。已經(jīng)顯示，用由FBP.7啟動子驅(qū)動的報道基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的棉花植物在種衣中特異性表達所述報道基因(Pei等人，2008)。
[0012]盡管迄今存在許多已知在棉花植物中驅(qū)動種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性表達的啟動子，但期望的是擁有可用于棉花中種子特異性表達的其他種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性啟動子。
[0013]因此，在一個方面，本申請公開了一種(分離的)核酸序列，其包含選自以下的核苷酸序列:(a)SEQ ID NO:1或其片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:1的至少400個連續(xù)核苷酸并且具有種子特異性啟動子活性，(b)與(a)的核苷酸序列具有至少80%序列同一性(包括與SEQ ID N0:1或其所述片段具有80%序列同一性)并具有種子特異性啟動子活性的核苷酸序列；(c)在嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；以及(d)與(a)至(C)中任一項的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
[0014]這個方面的(分離的)核酸序列在下文也稱作“啟動子序列”。
[0015]除非另外指明，否則下文對本文所公開的啟動子序列描述的實例也適用于本文所公開的其他方面的相應(yīng)實施例。
[0016]如本文所用，術(shù)語“包含”應(yīng)解釋為特指存在如所提到的特征、整數(shù)、步驟或組分，但是不排除存在或附加一種或多種特征、整數(shù)、步驟或組分或它們的群組。因此，例如，包含一種核苷酸序列的核酸可以包含比實際所引述更多的核苷酸，即，被包含于更大的核酸中。如將在下文進一步描述的嵌合基因(該嵌合基因包含以功能方式或結(jié)構(gòu)方式定義的核酸)可以包含另外的DNA區(qū)域等。然而，在本披露的上下文中，術(shù)語“包含”也包括“由……組成”。
[0017]換句話說，如本文自始至終所用，涉及一種“包含”某核苷酸序列的核酸或一種包含某氨基酸序列的蛋白質(zhì)的術(shù)語指包括或包含至少所述序列的核酸或蛋白質(zhì)，從而可以在5’(或N端)和/或3’(或C末端)處包括其他核苷酸序列或氨基酸序列，例如選擇標記蛋白(的核苷酸序列)、轉(zhuǎn)運肽(的核苷酸序列)和/或5’前導(dǎo)序列或3’尾隨序列。
[0018]核酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。核酸可以化學(xué)地合成或通過體內(nèi)或體外生物表達產(chǎn)生。
[0019]核酸可以使用適當(dāng)保護的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)DNA/RNA合成儀化學(xué)地合成。RNA合成試劑的供應(yīng)商是Proligo公司(漢堡，德國)、Dharmacon Research公司(Lafayette, CO, USA)> Pierce Chemical 公司(Perbio Science 分部，Rockford, IL, USA)、Glen Research 公司(Sterling, VA, USA)、ChemGenes 公司(Ashland, MA, USA)和 Cruachem公司(Glasgow, UK)o
[0020]與本披露的嵌合基因相關(guān)，DNA包括cDNA和基因組DNA。
[0021]如本申請中所用，“分離的核酸”或“分離的核酸序列”指如上文定義的核酸，它不是天然存在的(例如具有與天然存在核酸不同的核苷酸序列的人工或合成核酸或比天然存在核酸更短的核酸)或不再處于最初提供其的天然環(huán)境中的核酸，例如，嵌合基因中與異源調(diào)節(jié)元件相關(guān)連的核酸編碼序列(例如與可植物表達的啟動子可操作地連接的細菌編碼序列)或被轉(zhuǎn)移至另一種宿主細胞如轉(zhuǎn)基因植物細胞中的核酸。
[0022]將如此選擇如本文中披露的SEQ ID NO:1的片段的長度及其在SEQ ID NO:1內(nèi)部的位置，從而它足夠長，例如包含必需和足夠的全部元件，并且被如此布置，從而它能夠誘導(dǎo)種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性表達。
`[0023]評價如上文所述的核酸序列(其在本申請中代表啟動子序列)是否能夠誘導(dǎo)編碼序列或包含該編碼序列的嵌合基因，或尤其是與該編碼序列可操作地連接的核酸序列以種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性方式表達的方法是技術(shù)人員已知的。
[0024]例如可以進行報道基因研究以評價核酸序列的誘導(dǎo)功能。一個實例包括將所述第一核酸序列可操作地連接于報道基因如⑶S，在植物或植物細胞中如在棉花植物中導(dǎo)入所產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，并且評價所述報道基因在所述植物的不同組織中表達的誘導(dǎo)，如還將在下文進一步更詳細地描述。
[0025]在某些實例中本文所述并且具有種子特異性、種衣特異性或毛狀體/纖維特異性啟動子活性的所述核酸序列片段可以因此包含SEQ ID NO:1的至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300或至少1400個連續(xù)核苷酸。在另一個實例中，所述片段包含SEQ IDNO:1的位置I至位置748的核苷酸序列，其中存在位置-1。在另一個實例中，所述片段包含SEQID NO:1的核苷酸序列。在又另一個實例中，所述核酸序列由SEQ ID NO:1組成。
[0026]然而，將顯而易見的是，本發(fā)明核苷酸序列的變體，包括其插入、缺失和置換變體也可以用于相同的效果。總體上，這類變體與SEQ IDNO:1具有至少80%、至少90%、至少95%或甚至至少98%序列同一性并且保留它們的種子特異性、種衣特異性或毛狀體或纖維特異性啟動子活性。
[0027]如本文所用，術(shù)語“啟動子”指下述的任何核酸序列(如DNA序列):這種序列在轉(zhuǎn)錄起始期間被DNA依賴性RNA聚合酶識別并(直接或間接)結(jié)合，導(dǎo)致生成與轉(zhuǎn)錄的DNA互補的RNA分子；這種區(qū)域也可以稱作“5’調(diào)節(jié)區(qū)”。啟動子通常位于在待轉(zhuǎn)錄的編碼序列前方存在的5’非翻譯區(qū)(UTR)的上游并且具有多個區(qū)域，這些區(qū)域充當(dāng)RNA聚合酶II和其他蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點以引發(fā)可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子本身可以含有調(diào)節(jié)可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄的子元件(即啟動子基序)如順式元件或增強子結(jié)構(gòu)域。該啟動子和連接的5’ UTR也稱作“啟動子區(qū)”。
[0028]在本發(fā)明的上下文中“種子特異性”啟動子意指受啟動子控制的核酸序列轉(zhuǎn)錄在種子細胞中比在任何其他植物組織的細胞中高至少5倍、高至少10倍、高至少20倍或高至少50倍。
[0029]在一個實例中，種子特異性意指種衣特異性，即在種子的配子體衍生組織中沒有轉(zhuǎn)錄發(fā)生。在另一個實例中，種子特異性或種衣特異性意指毛狀體特異性，即在種子或種衣的非毛狀體的部分中沒有轉(zhuǎn)錄發(fā)生。毛狀體包括例如棉花植物的纖維。因而，術(shù)語“種衣特異性”或“毛狀體”意指如此實現(xiàn)受啟動子控制的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，從而所述核酸在種子、種衣，毛狀體或纖維中的轉(zhuǎn)·錄分別比在任何其他植物組織、優(yōu)選地在種子發(fā)育期間(如在種子毛狀體發(fā)育期間)存在的植物組織的細胞中高至少5倍、高至少10倍、高至少20倍或高至少50倍。
[0030]對于本發(fā)明，啟動子也可以是種子優(yōu)先的。在本發(fā)明的上下文中，“種子優(yōu)先”表達(或等同的“轉(zhuǎn)錄”)意指一種核酸序列借助轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(如啟動子)以如此方式轉(zhuǎn)錄，從而所述核酸序列在種子中的轉(zhuǎn)錄貢獻了在整株植物中其任意發(fā)育階段期間從所述核酸序列所轉(zhuǎn)錄的全部RNA量的多于50%、優(yōu)選地多于60%、更優(yōu)選地多于70%、甚至更優(yōu)選地多于80%。
[0031]啟動子序列或功能啟動子片段的啟動子活性的證實可以由本領(lǐng)域技術(shù)人確定，例如使用啟動子-報道子構(gòu)建體，其包含與易評定標記可操作地連接的啟動子序列，如本文進一步解釋?？梢酝ㄟ^以下方式方便地測試本文所述的啟動子的經(jīng)鑒定或生成的片段或變體的種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性表達能力:將這類核酸序列與編碼易評定標記(例如，β_葡糖醛酸糖苷酶基因)的核苷酸序列可操作地連接，將這種嵌合基因?qū)胫参?，并且與該標記在植物的其他部分中的表達模式相比，分析該標記在種子、種衣或毛狀體中的表達模式。與上述GUS不同的標記(或報道基因)的候選物是氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(β -GAL)和具有熒光或磷光特性的蛋白質(zhì)，如來自維多利亞管水母州的綠色熒光蛋白(GFP)或熒光素酶。為了定義最小啟動子，通過本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)，將代表該啟動子的核酸序列與標記(報道)基因的編碼序列可操作地連接。該報道基因在啟動子下游可操作地連接，從而在啟動子處起始的轉(zhuǎn)錄物貫穿報道基因進行。可以通過本領(lǐng)域熟知并且在本申請中其他地方描述的轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有處在該啟動子控制下的報道基因的表達盒導(dǎo)入正確細胞類型中。為了分析報道蛋白，制備細胞裂解物并且進行本領(lǐng)域熟知用于該報道蛋白的適宜分析。例如，如果CAT是選擇的報道基因，來自細胞的裂解物與同位素標記的氯霉素和乙酰-輔酶A (乙酰-CoA)混合，其中這些細胞用含有處于研究的啟動子控制下的CAT的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。CAT酶將乙?；鶑囊阴?CoA轉(zhuǎn)移至氯霉素的2-或3-位置。反應(yīng)通過薄層層析法監(jiān)測，該薄層層析法將乙?；让顾嘏c未反應(yīng)的物質(zhì)分開。反應(yīng)產(chǎn)物隨后通過放射自顯影可視化。酶活性水平對應(yīng)于產(chǎn)生的酶的量，該量轉(zhuǎn)而反映啟動子或其片段或變體的表達水平和種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性功能。這種表達水平也可以與其他啟動子比較以確定處于研究的啟動子的相對強度。一旦證實活性和功能，則可以使用另外的突變和/或插入和/或缺失分析以便確定例如為引發(fā)轉(zhuǎn)錄所需要的最小區(qū)域和/或序列。因此，可以在啟動子區(qū)的5’末端和/或在啟動子區(qū)的3’末端或在啟動子序列內(nèi)部缺失序列和/或可以導(dǎo)入核苷酸置換。隨后將這些構(gòu)建體再次導(dǎo)入細胞中并且確定它們的活性和/或功能。
[0032]作為測量報道酶活性的替代，可以通過測量從與啟動子或其片段可操作地連接的編碼序列產(chǎn)生的RNA的水平確定轉(zhuǎn)錄啟動子活性(和功能)。這種RNA (如mRNA)水平可以在單個時間點或在多個時間點測量，并且因而增加倍數(shù)可以是平均增加倍數(shù)或從實驗測量值推導(dǎo)的外推值。由于它是水平的比較，因此可以使用測量mRNA水平的任何方法。在一個實例中，比較的組織或器官是種子或種子組織連同葉或葉組織。在另一個實例中，比較多種組織或器官。多重比較的一個實例是種子或種子組織與2、3、4或更多種組織或器官比較，這些組織或器官選自下組，該組由以下各項組成:葉組織、葉端、花粉、葉、胚、苗、葉原基、苗端、根、根尖、維管組織和子葉。如本文所用，植物器官的實例是是種子、葉、根等并且組織的實例是葉原基、苗端、維管組織等。一個啟動子的活性或強度可以相對于mRNA或蛋白質(zhì)的總量，就該啟動子特異性引起的mRNA或蛋白質(zhì)積聚的量而言進行測量。啟動子例如以包含該啟動子的細胞的總mRNA的大于約0.1%、約0.2%、大于約0.5%、0.6%、0.7%、0.8%或約0.9%、大于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%或約9%、或大于約10%的水平表達可操作地連接的核酸序列?？商娲?，啟動子的活性或強度可以相對于充分表征的啟動子(先前評定過其轉(zhuǎn)錄活性)進行表述，或特定組織中的強度可以相對于在另一種組織中的強度表述。
[0033]在另一方面，提供種子特異性，種衣特異性或毛狀體特異啟動子，它們包含與如上文定義的SEQ ID NO:1或其片段具有至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性的核苷酸序列?？梢允褂檬熘姆肿由飳W(xué)技術(shù)鑒定本文所披露的啟動子的天然存在變體，例如采用如前文概述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。這類核酸序列也包括以合成方式衍生的核酸序列，如通過使用SEQ ID NO:1或其片段的位點定向誘變法產(chǎn)生的那些。通常，本發(fā)明的核苷酸序列變體將與SEQ IDNO:1的核酸序列具有至少80%、例如81%至84%、至少 85%、例如，86%、87%、88%``、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、至 98% 和 99% 序列同一性。本文所披露的并具有所需序列同一性的核酸序列的衍生物可以包括但不限于序列缺失、單個或多個點突變、特定限制性酶識別位點處的改變、功能性元件的添加，或可以提高或改變啟動子表達的其他分子修飾手段。用于獲得這類衍生物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(見例如，J.F.Sambrook, D.W.Russell 和 N.1rwin (2000)Molecular Cloning: A LaboratoryManual)。例如，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以界定本文所披露的啟動子內(nèi)部的功能性元件并刪除任何非必需元件。功能性元件可以被修改或合并以增加本發(fā)明序列對于任何特定應(yīng)用的實用性或表達。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉以下的標準來源材料:它們描述用于構(gòu)建、操縱及分離大分子(例如，DNA分子、質(zhì)粒等)以及生成重組生物和篩選并分離DNA分子的具體條件和程序。
[0034]可以例如改變SEQ ID NO:1和其功能性片段和變體的啟動子序列以含有例如“增強子DNA”以便輔助增加基因表達。如本領(lǐng)域熟知，某些DNA元件可以用來增強DNA的轉(zhuǎn)錄。這些增強子經(jīng)常在真核細胞內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子中的轉(zhuǎn)錄起點5’存在，但是可以經(jīng)常插入編碼序列的上游(5)或下游(3’)。在一些情況下，這些增強子DNA元件是內(nèi)含子。在用作增強子DNA有用的內(nèi)含子當(dāng)中存在來自稻肌動蛋白I基因(見US5641876 )、稻肌動蛋白2基因、玉米醇脫氫酶基因、玉米熱休克蛋白70基因(見US5593874)、玉米皺縮I基因、馬鈴薯光敏I基因和矮牽牛(Petunia hybrida)熱休克蛋白70基因(見US5659122)的5’內(nèi)含子。因此，如本文中構(gòu)思，啟動子或啟動子區(qū)包括通過插入或缺失調(diào)節(jié)區(qū)、使啟動子經(jīng)歷隨機或位點定向誘變等而衍生的啟動子變型形式。一個啟動子的活性或強度可以相對于此前已經(jīng)評估過其轉(zhuǎn)錄活性的啟動子，就該啟動子產(chǎn)生的RNA的量或細胞或組織中的蛋白質(zhì)積累量而言進行測量。
[0035]如本文所用，術(shù)語“序列同一性百分數(shù)”指在最佳比對的DNA的窗口的兩個片段之間相同核苷酸的百分比。用于比對比較窗口的最佳序列比對是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且可以通過多種工具如Smith和Waterman的局部同源性算法(Waterman, M.S., Chapman和Hall.London, 1995)、Needleman 和 Wunsch 的同源性比對算法(1970)、Pear son 和 Lipman 的相似性搜索方法(1988)并且優(yōu)選地通過這些算法的計算機化執(zhí)行如作為GCG (注冊商標)、Wisconsin Package (來自加利福尼亞州圣迭戈市Accelrys Inc.的注冊商標)的部分可獲得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA來實施。測試序列和參考序列的已比對區(qū)段的“同一性分數(shù)”是由兩個已比對序列所共有的相同組分的數(shù)目除以參考序列區(qū)段(即完整的參考序列或參考序列的更小定義的部分)中組分的總數(shù)目。序列同一性百分數(shù)表述為同一性分數(shù)乘以100。一個或多個DNA序列的比較可以是相對于全長DNA序列或其部分，或相對于較長的DNA序列。
[0036]僅是具有上述程度的序列同一性的具有種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性啟動子活性的核苷酸序列由本發(fā)明涵蓋。
[0037]術(shù)語“雜交”指當(dāng)兩條核酸鏈具有足夠序列同一性時核酸的第一鏈經(jīng)氫鍵堿基配對作用與第二鏈接合的能力。當(dāng)兩個核酸分子在適宜條件下彼此復(fù)性時，雜交發(fā)生。核酸雜交是DNA操作領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)。一對給定核酸的雜交特性是其相似性或同一性的指標。兩個核酸序列大體.上相同的另一個指標是這兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。在核酸雜交實驗如DNA印跡和RNA印跡雜交的背景下，“嚴格雜交條件”和“嚴格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。高嚴格性洗滌條件的實例是在65°C時0.1X SSC、5X Denhardt溶液、0.5%SDS例如約15分鐘。本發(fā)明的適宜洗滌條件的實例是在65°C時2X SSC ；0.1%SDS洗滌例如約15分鐘。經(jīng)常，高嚴格性洗滌之前是低嚴格性洗滌以除去背景探針信號。也可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺實現(xiàn)嚴格性條件。通常，2X (或高于)特定雜交測定法中對不相關(guān)探針所觀察的信噪比表示檢測到特異性雜交。將非常嚴格的條件選擇等于特定探針的Tm。
[0038]在本發(fā)明的過程中，已經(jīng)在陸地棉(Gossypium hirsutum)中鑒定到種子特異性啟動子，連同后續(xù)5’ UTR(—起也稱作“啟動子區(qū)”)。所述啟動子，也稱作PMADS6或GhpMADS6，在其天然背景下，控制棉花中的MADS框基因MADS6。
[0039]陸地棉是因兩個祖先二倍體物種在1-1.2百萬年前融合而產(chǎn)生的異源四倍體并且基因組可以含有每個基因的達至4個等位基因?？紤]到至少100個MADS-框基因存在于擬南芥基因組中(Parenicovd等人,2003),同時在白楊(Leseberg等人,2006)、碧冬爺(Immink等人，2003)和稻(Nam等人，2004)中存在相似數(shù)目，因此棉花中的MADS-框基因家族在可能龐大且復(fù)雜，具有高水平的同源性和/或功能冗余性。
[0040]啟動子pMADS6與碧冬茄FBP7啟動子具有非常低的序列同一性-46%，并且在胚珠、纖維中和在花組織中高度表達。已經(jīng)顯示表達在早期纖維發(fā)育期間特別強烈；達至24DPA檢測到基因產(chǎn)物的表達(Lightfoot等人，2008)。
[0041]預(yù)期本發(fā)明的啟動子適合于棉花中轉(zhuǎn)基因的種子特異性、種衣特異性或毛狀體或纖維特異性表達或至少在形成纖維的早期階段期間的表達。本發(fā)明的啟動子可以用來表達調(diào)節(jié)棉纖維特性的基因或否則參與棉纖維形成的基因，如參與植物生長激素合成的基因。本發(fā)明的啟動子還可以是更易控制的，因為它源自意在再導(dǎo)入該啟動子的植物?？商娲鼗虺酥猓梢酝ㄟ^在棉花中使用本發(fā)明的啟動子避免異源啟動子的潛在未知或不想要的副作用。
[0042]除非另外指明，否則可以將與一個方面聯(lián)系的本申請中所披露的某些實例的具體定義或具體特征引入本文所披露的任何其他方面中。
[0043]在本文所披露的啟動子序列上鑒定到多個推定性反應(yīng)元件。檢索限于毛狀體特異性元件并限于與LI框和MYB結(jié)合基序相對應(yīng)的基序。后兩者已經(jīng)被描述為潛在性地賦予毛狀體特異性表達的基序(Wang和Chen，2004)。檢索揭示出兩個基序潛在性地賦予種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性表達。第一基序是T/G框，其與始于SEQ ID N0:1中位置298 (與位置-451相對應(yīng))存在的毛狀體基序RPSP01178相對應(yīng)。T/G框基序的確切序列是AACGTG。已經(jīng)在棉纖維MYB基因的啟動子中鑒定到所述結(jié)合基序(Shangguan等人，2008)，其中缺失降低該啟動子在擬南芥和煙草中的活性。
[0044]另一個結(jié)合基序?qū)?yīng)于MYB結(jié)合基序并且發(fā)現(xiàn)始于SEQ ID NO:1中的位置846并且具有序列cagtta。有趣地,所述MYB結(jié)合基序也存在于天然受本發(fā)明啟動子調(diào)節(jié)的MADS6基因的編碼序列內(nèi)部。它已經(jīng)由Wang和Chen(2004)鑒定并且至少存在于在擬南芥中賦予毛狀體特異性的RDLl啟動子中以及GLl (控制擬南芥中的myb基因)啟動子和GaMyb2 (控制棉花中的MYB基因)啟動子中。已`經(jīng)較早顯示破壞MYB結(jié)合基序?qū)е旅珷铙w產(chǎn)生減少。
[0045]本文所述的啟動子的變體包括包含已鑒定的元件，但已經(jīng)另外經(jīng)過修改以除去序列內(nèi)部下述核苷酸片段的那些變體，其中所述核苷酸片段不是該啟動子以種子特異性、種衣特異性或甚至毛狀體特異性或纖維特異性方式發(fā)揮必需的。例如，可以至少部分地缺失位于鑒定的兩個基序之間和/或該轉(zhuǎn)錄起點與該第一基序之間的任何核苷酸片段以產(chǎn)生比SEQ ID NO:1中所示的約1.5Kb序列短的核苷酸序列。
[0046]如上文定義的本發(fā)明啟動子及其片段和變體的核苷酸序列預(yù)期產(chǎn)生種子特異性、種衣特異性或甚至毛狀體特異性或纖維特異性啟動子活性。
[0047]在一個實例中，種子特異性啟動子活性是位于棉花中。該啟動子、其片段和變體可以發(fā)揮作用的其他實例包括產(chǎn)生其他毛狀體或纖維的植物如，大麻、黃麻、亞麻和木本植物，包括但不限于松屬某些物種(Pinus spp.)、楊屬某些物種(Populus spp.)、云杉屬某些物種(Picea spp.)、桉屬某些物種(Eucalyptus spp.)等。
[0048]在本文所披露的核酸序列的一個實例中，種子特異性啟動子活性是毛狀體特異性或纖維特異性。
[0049]在另一方面，本申請披露一種嵌合基因，其包含本文所述的與編碼感興趣表達產(chǎn)物的核酸可操作地連接的(分離)核酸和任選地在植物細胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷化序列。
[0050]嵌合基因是通過可操作地連接不相關(guān)基因或其他核酸序列的片段所構(gòu)建的人工基因。換句話說，“嵌合基因”指正常情況下植物種中不存在的基因或指任何基因，其中該基因的啟動子、該啟動子的接合部分或該基因的一個或多個其他調(diào)節(jié)區(qū)在自然界中并不與部分或全部的與之可操作地連接的轉(zhuǎn)錄核酸關(guān)聯(lián)，即相對于該轉(zhuǎn)錄核酸是異源的。更具體地，嵌合基因是一種通過以下方式產(chǎn)生的人工(即非天然存在)的基因:將本發(fā)明核酸序列例如SEQ ID NO:1的核酸、其片段或與之具有80%序列同一性的核酸序列(均能夠指導(dǎo)如上文所述的感興趣表達產(chǎn)物的種子特異性、種衣特異性或毛狀體特異性表達)與編碼所述感興趣表達產(chǎn)物的第二核酸序列可操作地連接，其中該第二核酸序列不天然地與所述核酸序列可操作地連接。天然地與所述核酸序列可操作地連接的這類核酸序列是棉花MADS6基因的編碼序列。
[0051]術(shù)語“異源”指衍生自不同來源的兩個或更多個核酸序列或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，啟動子相對于可操作地連接的核酸序列(如編碼序列)是異源，如果這種組合正常情況下不存在于自然界中。此外，特定序列可以相對于插入該序列的細胞或生物是“異源”的(即不天然存在于這種特定細胞或生物中)。例如，本文所披露的嵌合基因是異源核酸。
[0052]術(shù)語“可操作地連接的”指兩個或更多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性空間排列。例如，啟動子區(qū)可以相對于編碼感興趣表達產(chǎn)物的核酸序列如此安置，從而所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄由該啟動子區(qū)指導(dǎo)。因此，啟動子區(qū)“與該核酸序列可操作地連接”。
[0053]如上文所述的啟動子、其片段或變體可以與相對于該啟動子為異源的編碼感興趣表達產(chǎn)物的核酸序列可操作地連接。核酸序列可以總體上是希望改變其轉(zhuǎn)錄水平如增加水平的任何核酸序列。該核酸序列可以例如編碼能夠在棉花中調(diào)節(jié)纖維特性或參與植物生長激素生物合成的多肽。
[0054]植物生長激素是在協(xié)調(diào)植物生活周期中多種生長和行為過程時發(fā)揮主要作用的一類植物激素。在分子水平，植物生長激素具有芳環(huán)和羧酸基(Taiz和Zeiger，1998)。植物生長激素家族的最重要成員.是吲哚-3-乙酸(IAA)。它在完好植株中產(chǎn)生大部分的植物生長激素作用并且是最強有力的天然植物生長激素。
[0055]用于調(diào)節(jié)棉纖維特性的其他適合異源核酸序列包括而不限于在W002/45485中披露的借以通過調(diào)節(jié)這類植物中蔗糖合酶活性和/或表達而調(diào)節(jié)產(chǎn)纖維植物(如棉花)中纖維品質(zhì)的那些，如W02005/017157中披露的通過調(diào)節(jié)胼胝質(zhì)沉積介導(dǎo)纖維細胞伸長期改變的核酸，尤其編碼β_1，3葡聚糖合酶蛋白的基因，或在W02006/136351中披露的那些。
[0056]“表達產(chǎn)物”指因編碼這類產(chǎn)物的核酸(如DNA或RNA)的轉(zhuǎn)錄和任選地翻譯而產(chǎn)生的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)錄過程期間，在調(diào)節(jié)區(qū)、特別是本文所披露的啟動子序列的控制下的DNA序列轉(zhuǎn)錄成RNA分子。RNA分子可以本身形成表達產(chǎn)物并隨后例如能夠與另一種核酸或蛋白質(zhì)相互作用?？商娲?，當(dāng)RNA分子能夠被翻譯成肽或蛋白質(zhì)時，這種RNA分子可以是中間產(chǎn)物。當(dāng)一種RNA作為基因表達的終產(chǎn)物能夠與另一種核酸或蛋白質(zhì)相互作用時，將基因稱作編碼該RNA分子作為表達產(chǎn)物。RNA表達產(chǎn)物的實例包括抑制性RNA，例如正義RNA、反義RNA、發(fā)夾RNA、核酶、miRNA或siRNA、mRNA、rRNA和tRNA。當(dāng)基因表達的終產(chǎn)物是蛋白質(zhì)或肽時，將該基因稱作編碼蛋白質(zhì)或肽作為表達產(chǎn)物。
[0057]其他示例性目的表達產(chǎn)物包括參與細胞壁合成和纖維形成的蛋白質(zhì)，如W02005/017157中披露，尤其是編碼β -1, 3葡聚糖合酶蛋白的基因，或在W02006/136351、PCT/EP2011/004929或W02011/089021中披露，尤其是可以被靶向高爾基體膜的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，如NODC型N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶或殼多糖合酶。
[0058]處于本披露的范圍內(nèi)，也可以利用與上述嵌合基因組合的其他調(diào)節(jié)序列，這些序列位于包含啟動子的所述核酸序列和包含表達產(chǎn)物的編碼序列的所述核酸序列之間。如果作為啟動子使用的核苷酸序列是來自SEQ ID NO:1的位置I至位置748的對應(yīng)于無5’ UTR的啟動子的一種序列，則情況尤其如此。這類調(diào)節(jié)序列的非限制性實例包括翻譯激活子(“增強子”)，例如專利申請W087/07644中描述的煙草花葉病毒(TMV)翻譯激活子或Carrington 和 Freedl990, J.Virol.64:1590-1597 描述的煙草蝕紋病毒(TEV)翻譯激活子，或內(nèi)含子如擬南芥histon3內(nèi)含子(Chaubet等人，1992)。
[0059]其他適合的調(diào)節(jié)序列包括5’UTR。如本文所用，5’UTR，也稱作前導(dǎo)序列，是信使RNA (mRNA)的一個特定區(qū)域,其位于轉(zhuǎn)錄起始位點和編碼區(qū)的起始密碼子之間。它參與mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率。例如，35S轉(zhuǎn)錄起始位點下游的碧冬茄葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因(cab22L)的5’非翻譯前導(dǎo)序列可以用來增進穩(wěn)態(tài)水平的報道基因表達(Harpster等人，1988，Mol Gen Genet.212(1): 182-90)。TO95/006742描述了衍生自基因編碼熱休克蛋白的5’非翻譯前導(dǎo)序列序列增加轉(zhuǎn)基因表達的用途。
[0060]嵌合基因還可以包含在植物細胞，尤其棉花植物細胞中可操作的轉(zhuǎn)錄終止或多聚腺苷化序列。作為轉(zhuǎn)錄終止或多聚腺苷化序列，可以利用細菌來源的任何對應(yīng)序列，如例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) nos終止子；病毒來源的任何對應(yīng)序列，如例如CaMV35S終止子，或植物來源的任何對應(yīng)序列，如例如在公布的專利申請ΕΡ0，633，317A1中所述的組蛋白終止子。
[0061]在本文所述的嵌合基因的一個實例中，所述感興趣表達產(chǎn)物是蛋白質(zhì)、肽或RNA分子，所述RNA分子能夠調(diào)節(jié)相對所述植物為內(nèi)源的基因表達。在一個實例中，所述蛋白質(zhì)、肽或RNA分子能夠調(diào) 節(jié)纖維特性。在另一個實例中，所述蛋白質(zhì)，肽或RNA分子參與植物生長激素生物合成。
[0062]如本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”描述一組由多于30個氨基酸組成的分子，而術(shù)語“肽”描述由至多到30個氨基酸組成的分子。蛋白質(zhì)和肽還可以進一步形成二聚體，三聚物和高級低聚物，即由不止一個(多)肽分子組成。形成這類二聚體、三聚物等的蛋白質(zhì)或肽分子可以是相同或不相同的。相應(yīng)的更高階結(jié)構(gòu)物因此稱作同型二聚體或異二聚體、同型三聚體或異三聚體等。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“肽”也指天然修改的蛋白質(zhì)或肽，其中例如通過糖基化、乙酰化、磷酸化等實現(xiàn)該修飾。這類修飾是本領(lǐng)域熟知的。
[0063]適合作為表達產(chǎn)物的示例蛋白質(zhì)包括參與調(diào)節(jié)纖維特性的蛋白質(zhì)，如介導(dǎo)纖維長度增加、纖維強度改變或細胞壁特性改變(例如導(dǎo)致所述細胞壁電荷改變)、可染性改變、棉短絨產(chǎn)生減少、纖維成熟度比率改變、不成熟纖維含量降低或纖維整齊度和馬克隆尼值增加的那些。
[0064]所述感興趣表達產(chǎn)物也可以是能夠調(diào)節(jié)相對所述棉花植物為內(nèi)源的基因表達的RNA分子。
[0065]在這種聯(lián)系下適于RNA表達產(chǎn)物的靶基因的實例包括參與調(diào)節(jié)纖維特性的那些，如介導(dǎo)纖維長度增加、纖維強度改變或細胞壁特性改變(例如導(dǎo)致所述細胞壁電荷改變)、可染性改變、棉短絨產(chǎn)生減少、纖維成熟度比率改變、不成熟纖維含量降低或纖維整齊度和馬克隆尼值增加的那些。
[0066]對于RNA分子而言，將顯而易見的是每當(dāng)通過提及相應(yīng)DNA分子的核苷酸序列來定義RNA分子的核苷酸序列時，該核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)應(yīng)當(dāng)由尿嘧啶(U)替換。是否指稱DNA分子或RNA分子將從本申請的上下文顯而易見。
[0067]術(shù)語“能夠調(diào)節(jié)基因的表達”涉及RNA分子(例如，如本文所述的抑制性RNA分子)以不同方式影響靶基因表達水平的作用。這可以例如通過以下方式實現(xiàn):通過直接與驅(qū)動靶基因表達的組分如基因本身或轉(zhuǎn)錄的mRNA相互作用而抑制所述表達，這導(dǎo)致表達的減少，或者通過抑制參與激活靶基因表達從而取消所述激活作用的另一種基因，或者抑制參與抑制靶基因的另一種基因表達，這導(dǎo)致表達的增加。相反，使用抑制性RNA抑制參與抑制靶基因表達的基因可以導(dǎo)致激活所述靶基因的表達。
[0068]抑制性RNA分子降低其靶蛋白的可用于翻譯成所述靶蛋白的mRNA的水平。以這種方式，可以抑制參與不利應(yīng)答于脅迫條件的蛋白質(zhì)的表達。這可以通過已充分建立的技術(shù)實現(xiàn)，這些技術(shù)包括共抑制(正義RNA抑制)、反義RNA、雙鏈RNA (dsRNA)、siRNA或微RNA(miRNA)o
[0069]如本文中披露的作為表達產(chǎn)物的RNA分子包含編碼靶蛋白的核苷酸序列或同源序列的一部分以下調(diào)所述靶蛋白的表達。作為表達產(chǎn)物用于下調(diào)表達的RNA分子的另一個實例是反義RNA分子，其包含與編碼感興趣蛋白的核苷酸序列或同源序列的至少一部分互補的核苷酸序列。這里，可以例如通過導(dǎo)入這種反義RNA或編碼這類RNA分子的嵌合DNA實現(xiàn)下調(diào)。在又另一個實例中，通過導(dǎo)入以下雙鏈RNA分子下調(diào)感興趣蛋白的表達，其中該雙鏈RNA分子包含與編碼所述感興趣蛋白的基因序列的至少部分相對應(yīng)并且分別與之互補的正義RNA區(qū)和反義RNA區(qū)，該正義RNA區(qū)和反義RNA區(qū)能夠彼此形成雙鏈RNA區(qū)。這類雙鏈RNA分子可以由如上文所述的正義和反義分子編碼和由經(jīng)加工以形成siRNA或miRNA的單鏈分子編碼。`
[0070]在一個實例中，可以通過導(dǎo)入嵌合DNA構(gòu)建體下調(diào)靶蛋白的表達，該嵌合DNA構(gòu)建體產(chǎn)生能夠通過共抑制作用下調(diào)表達的正義RNA分子。轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域?qū)⒃谵D(zhuǎn)錄時產(chǎn)生能夠以轉(zhuǎn)錄方式或轉(zhuǎn)錄后方式在靶植物或植物細胞中減少編碼靶蛋白的基因表達的所謂正義RNA分子。轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域(和所產(chǎn)生的RNA分子)包含至少20個連續(xù)核苷酸，這些連續(xù)核苷酸與編碼植物細胞或植物中存在的靶蛋白的核苷酸序列的相應(yīng)部分具有至少95%序列同一'I"生。
[0071]可替代地，用于下調(diào)靶蛋白表達的表達產(chǎn)物是反義RNA分子。下調(diào)或減少感興趣蛋白在靶棉花植物或植物細胞中的表達再次以轉(zhuǎn)錄方式或轉(zhuǎn)錄后方式實現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域(和所產(chǎn)生的RNA分子)包含至少20個連續(xù)核苷酸，這些連續(xù)核苷酸與編碼植物細胞或植物中存在的所述靶蛋白的核酸序列的相應(yīng)部分的互補物具有至少95%序列同一性。
[0072]然而，編碼靶蛋白的核酸序列的約20nt的反義或正義RNA區(qū)域的最短核苷酸序列可以被包含于一個較大RNA分子內(nèi)部，該較大RNA分子在大小上從20nt變動至等于靶基因大小的長度。提到的反義或正義核苷酸區(qū)域可以因此長從約21nt至約5000nt、如長度21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt 或甚至約 5000nt 或更長。而且，出于本發(fā)明的目的，并不要求所用的抑制性RNA分子或轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)的核苷酸序列與編碼靶蛋白的內(nèi)源基因完全相同或互補，其中在植物細胞中以減少所述內(nèi)源基因的表達為目標。序列越長，對整體序列同一性的要求的嚴格性越低。因此，正義或反義區(qū)可以與內(nèi)源基因或其互補物的核苷酸序列具有約40%或50%或60%或70%或80%或90%或100%的整體序列同一性。然而，如所提到的，反義或正義區(qū)應(yīng)當(dāng)包含與編碼靶基因的內(nèi)源基因的核苷酸序列具有約95%至約100%序列同一性的20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。具有約95%至約100%序列同一性的片段可以是約50個、75個或lOOnt。
[0073]可以通過添加DNA元件進一步增強上文所提到的用于反義RNA或正義RNA介導(dǎo)的基因表達水平下調(diào)的嵌合基因，其中這些DNA元件導(dǎo)致異常的未聚腺苷酸化的抑制性RNA分子表達。適合該目的的一種這樣的DNA元件是編碼自剪接核酶的DNA區(qū)域。也可以通過提供生成的具有細胞核定位或停留信號的RNA分子增強這種效率。
[0074]此外，如本文所述的表達產(chǎn)物可以是產(chǎn)生雙鏈RNA分子的核酸序列，該雙鏈RNA分子能夠下調(diào)編碼靶蛋白的基因的表達。一旦轉(zhuǎn)錄該DNA區(qū)域，則RNA能夠借助正義區(qū)和反義區(qū)之間的常規(guī)堿基配對作用形成dsRNA分子，藉此正義區(qū)和反義區(qū)是如前文所述的核苷酸序列。作為根據(jù)本發(fā)明的dsRNA表達產(chǎn)物可以進一步包含內(nèi)含子，例如異源內(nèi)含子，根據(jù)W099/53050的披露內(nèi)容，該內(nèi)含子位于例如正義RNA區(qū)和反義RNA區(qū)之間的間隔序列中。為實現(xiàn)這種轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建，可以利用W002/059294A1中所述的載體。
[0075]在一個實例中，所述RNA分子包含第一和第二 RNA區(qū)域，其中1.所述第一 RNA區(qū)域包含與所述內(nèi)源基因的核苷酸序列具有至少約94%序列同一性的至少19個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；2.所述第二 RNA區(qū)域包含與所述第一 RNA區(qū)域的所述19個連續(xù)核苷酸互補的核苷酸序列；3.·所述第一和第二 RNA區(qū)域能夠堿基配對以便在所述第一區(qū)域和第二區(qū)域的所述至少19個連續(xù)核苷酸之間形成雙鏈RNA分子。在其他實例中，如上文所述，相同的考慮事項適用于正義和反義RNA。
[0076]另一個示例性表達產(chǎn)物是微RNA分子(mirRNA，其可以從前微RNA分子加工而來)，該微RNA分子能夠指導(dǎo)從編碼靶蛋白的DNA轉(zhuǎn)錄而來的待翻譯成所述靶蛋白的mRNA的裂解。可以將miRNA分子借助表達從如本文所述的嵌合基因便利地導(dǎo)入植物細胞中，其中所述嵌合基因包含了編碼這類miRNA、前miRNA或初級miRNA轉(zhuǎn)錄物作為感興趣表達產(chǎn)物的(第二)核酸序列。
[0077]miRNA是在植物中、還在其他真核生物中調(diào)節(jié)基因表達的內(nèi)源性小RNA。如本文所用，“miRNA”是長度約20至30個核苷酸的RNA分子(Siomi和Siomi，2009)，其可以被加載至RISC復(fù)合物中并其指導(dǎo)靶RNA分子的切割，其中該靶RNA分子包含與該miRNA分子的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列。在示例性miRNA中，以下一個或多個錯配可以在基本互補于靶RNA的miRNA中出現(xiàn):
[0078]-所述miRNA5’末端的核苷酸與靶RNA分子中的相應(yīng)核苷酸序列之間的一個錯配；
[0079]-所述miRNA第I位置至第9位置內(nèi)的核苷酸中任一個與祀RNA分子中的相應(yīng)核苷酸序列之間的一個錯配；
[0080]-所述miRNA的第12位置至第21位置內(nèi)的核苷酸中任一個與靶RNA分子中的相應(yīng)核苷酸序列之間的三個錯配，但不超過兩處連續(xù)錯配；
[0081]-在該miRNA第10位置和第11位置處不允許錯配(全部miRNA位置均從該miRNA分子的5’端開始標識)。
[0082]能夠下調(diào)靶蛋白表達的表達產(chǎn)物的又一個實例由產(chǎn)生前miRNARNA分子的核酸序列編碼，其中該前miRNA RNA分子被加工成能夠指導(dǎo)編碼所述靶蛋白的mRNA裂解的miRNA。在植物中，miRNA通過DICERLIKE1 (DCLl)的切割活性而從長的內(nèi)源性前miRNA的莖-環(huán)區(qū)加工而來。植物miRNA與保守的靶mRNA高度互補并且指導(dǎo)其靶的裂解。miRNA似乎是調(diào)節(jié)本身參與發(fā)育的復(fù)雜通道網(wǎng)絡(luò)的基因表達的關(guān)鍵組分。
[0083]如本文所用，“前miRNA”分子是具有約100至約200個核苷酸，優(yōu)選地約100至約130個核苷酸的RNA分子，該RNA分子可采用下述二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)包含dsRNA莖和單鏈RNA環(huán)，并且進一步包含在雙鏈RNA莖中的miRNA的核苷酸序列及其miRNA*的互補序列。優(yōu)選地，該miRNA及其互補物位于距離該miRNA dsRNA莖的游離末端約10個至約20個核苷酸處。單鏈環(huán)區(qū)域的序列和長度并非關(guān)鍵并且可以大幅度變動，例如，長度在30至50nt之間。優(yōu)選地，未配對和配對的RNA結(jié)構(gòu)之間的自由能差異在-20與-60kcal/摩爾之間，例如在_40kcal/摩爾左右。該miRNA與miRNA*之間的互補性不必是完美的并且可以容忍約I個至3個凸起的未配對核苷酸。RNA分子所采用的二級結(jié)構(gòu)可以由本領(lǐng)域常規(guī)的計算機算法如mFold、UNAFold和RNAFold來預(yù)測。來自前miRNA中的dsRNA莖的特定鏈由5’端處的互補性程度決定，其中該特定鏈由DCL活性被釋放并加載到RISC復(fù)合體上，因而在其5’端處最少參與已切割的dsRNA莖的不同鏈的核苷酸之間成氫鍵作用的鏈被加載到RISC復(fù)合體上并且將確定靶RNA分子降解的序列特異性。但是，如果經(jīng)驗上來自特定合成性前miRNA分子的miRNA分子因為“錯誤”鏈被加載到RISC復(fù)合物上而不是有功能性，則會立刻顯而易見的是，可以通過交換miRNA分子及其互補物在前miRNA分子的dsRNA莖的相應(yīng)鏈上的位置解決這個問題。如本領(lǐng)域已知，涉及兩個氫鍵的A和U之間的結(jié)合作用或涉及兩個氫鍵的G和U之間的結(jié)合作用不如涉及三個氫鍵的G和C之間的結(jié)合作用強。
[0084]miRNA分子可以被包含于其天然存在的前-miRNA分子中，但是也可以通過將正常情況下從這種現(xiàn)存的前miRNA分子加工而來的miRNA分子的核苷酸序列交換成另一個感興趣miRNA的核苷酸序列，將它.們引入現(xiàn)存的前-miRNA分子支架中。前miRNA的支架也可以是完全合成的。類似地，合成的miRNA分子可以被包含于現(xiàn)存的前-miRNA分子支架或合成性前miRNA支架中或從其加工而來。
[0085]示例性表達產(chǎn)物也可以是催化自身裂解或其他RNA裂解的核酶。
[0086]在本文所披露的嵌合基因的一個實例中，調(diào)節(jié)表達是增加表達，并且所述編碼感興趣表達產(chǎn)物的核酸序列編碼一種RNA，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時，1.所述RNA產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠增加對所述棉花植物為內(nèi)源的基因表達。這類基因可以與纖維長度，纖維強度或細胞壁特性的所希望改變正相關(guān)，這些改變導(dǎo)致例如所述細胞壁的電荷改變、可染性改變、棉短絨產(chǎn)生減少、纖維成熟度比率改變、不成熟纖維含量降低或纖維整齊度和馬克隆尼值增加，或2.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠減少對所述棉花植物為內(nèi)源的基因表達，其中所述基因可以與纖維長度、纖維強度或細胞壁特性的所希望改變負相關(guān)，這些改變導(dǎo)致例如所述細胞壁的電荷改變、可染性改變、棉短絨產(chǎn)生減少、纖維成熟度比率改變、不成熟纖維含量降低或纖維整齊度和馬克隆尼值增加。
[0087]基于RNA的示例表達產(chǎn)物包括抑制性RNA如miRNA、siRNA、反義RNA、正義RNA、發(fā)夾RNA或靶以下對象的核酶:葡聚糖酶、編碼肌動蛋白解聚因子的ADF、編碼羊蠟酸的CPC、或編碼triptychon的TRY,連同其它。
[0088]在本文所述的嵌合基因的另一個實例中，所述表達產(chǎn)物是如本申請中其他地方描述的報道基因或纖維特異性基因。
[0089]在本文所述的嵌合基因的一個實例中，所述RNA分子包含第一和第二 RNA區(qū)域，其中1.所述第一 RNA區(qū)域包含與所述內(nèi)源基因的核苷酸序列具有至少約94%序列同一性的至少19個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；2.所述第二 RNA區(qū)域包含與所述第一 RNA區(qū)域的所述19個連續(xù)核苷酸互補的核苷酸序列；以及3.所述第一和第二 RNA區(qū)域能夠堿基配對以便在所述第一區(qū)域和第二區(qū)域的所述至少19個連續(xù)核苷酸之間形成雙鏈RNA分子。
[0090]本申請還披露一種包含本文所述的嵌合基因的載體。
[0091]“載體”指它能夠攜帶并轉(zhuǎn)移遺傳信息的任何基于核酸的介質(zhì)，如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制型序列、噬菌體或線性單鏈、環(huán)狀單鏈、線性雙鏈或環(huán)狀雙鏈DNA或RNA核苷酸序列。重組載體可以衍生自任何來源并且能夠進行基因組整合或自主復(fù)制。因此，上文描述的嵌合基因可以在重組載體中提供。重組載體典型地以5’至3’方向包含:指導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子和待轉(zhuǎn)錄的核酸序列。這些元件對應(yīng)于本文所披露的待導(dǎo)入的嵌合基因。根據(jù)希望的，重組載體還可以進一步包含3’轉(zhuǎn)錄終止子、3’多聚腺苷化信號、其他非翻譯核酸序列、轉(zhuǎn)運和靶向核酸序列、選擇標記、增強子和操縱基因。詞“5’UTR”指基因編碼區(qū)的上游或5’的非翻譯DNA區(qū)，并且“3’UTR”指基因編碼區(qū)的下游或3’的非翻譯DNA區(qū)。用于制備重組載體的手段是本領(lǐng)域熟知的。用于制備特別適合于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法在US4971908、US4940835、US4769061和US4757011中描述。本文所述的載體可以是表達載體。有用于高等植物中表達核酸的典型載體是本領(lǐng)域熟知的并且包括衍生自根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體。
[0092]在另一方面，本申請披露了一種轉(zhuǎn)基因植物細胞，其包含本文所披露的嵌合基因或本文所披露的載體。
[0093]本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物細胞和轉(zhuǎn)基因植物，它們包含與編碼感興趣表達產(chǎn)物的異源核酸序列可操作地連接的如上文所述的核酸序列，即本文所披露的啟動子序列。可替代地，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物包含本文所披露的嵌合基因。上文描述了優(yōu)選的啟動子序列和感興趣表達產(chǎn)物及其他調(diào)節(jié)元件。
[0094]可以通過將如上文所述的核酸序列導(dǎo)入植物或植物細胞中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。與本申請相關(guān)的“導(dǎo)入”涉及通過人工手段將遺傳信息安置在植物細胞或植物中。這可以通過本領(lǐng)域已知的將RNA或DNA導(dǎo)入植物細胞、原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、桿、葉、籽苗、胚、花粉和小孢子、其他植物組織或完整植株中的任何方法來實現(xiàn)。更具體地，“導(dǎo)入”意指穩(wěn)定整合至植物基因組中。
[0095]含有轉(zhuǎn)化的核酸序列的植物稱作“轉(zhuǎn)基因植物”。轉(zhuǎn)基因和重組指已經(jīng)向其中導(dǎo)入異源核酸分子(例如，如本文所述的核酸序列、嵌合基因或載體)的宿主生物如植物。該核酸可以穩(wěn)定整合至植物的基因組中。與本文所披露的方法相結(jié)合地描述了用于導(dǎo)入的具體方法。
[0096]植物細胞可以衍生自產(chǎn)生毛狀體的任何植物，如棉屬(Gossypium)(棉花)、煙草屬(Nicotiana)、擬南芥屬以及上文描述的產(chǎn)纖維植物。在一個實例中，植物細胞衍生自棉屬植物。[0097]如本文所用的“棉花”或“棉花植物”可以是有用于培育棉花的任何品種。最常使用的棉花品種是海島棉(Gossypium barbadense)、陸地棉(G.hirsutum)、樹棉(G.arboreum)和草棉(G.herbaceum)。其他品種包括非洲棉(G.africanum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)。還包括的是來自前述任一者種與其他物種雜交或這類物種之間雜交的子代。
[0098]棉花植物細胞可以是基本上包含對定義棉花植物為必要的遺傳學(xué)信息的任何細胞，其中除本文所披露的嵌合基因之外，該細胞可以由一個或多個其他轉(zhuǎn)基因補充。細胞可以衍生自形成棉花植物的不同器官和/或組織，包括但不限于果實、種子、胚、繁殖組織、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、花、維管組織、配子體、孢子體、花粉和小孢子。
[0099]本申請還披露一種轉(zhuǎn)基因植物，其由本文所述的轉(zhuǎn)基因棉花植物細胞組成或包括本文所述的穩(wěn)定整合于植物基因組內(nèi)的嵌合基因或載體。這可以通過本申請中其他地方描述的轉(zhuǎn)化方案實現(xiàn)。
[0100]在另一個實施例中，本發(fā)明涉及從本文所述的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子包含本文所述的嵌合基因。
[0101]種子由隨儲存養(yǎng)分一起被種衣封閉的胚植物體形成。它是裸子植物和被子植物(棉花屬于被子植物)的成熟胚珠的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在受精后發(fā)生并且在母體植物內(nèi)部生長至某種程度。
[0102]本文還披露了從本文所公開的植物可獲得或獲得的棉纖維和棉籽油?？梢酝ㄟ^采用TO2010/015423中披露的檢測方法以及檢查纖維中(a)的核酸或(b)的嵌合基因的存在，將本文所公開的棉纖維與其他纖維區(qū)分。因而，(a)的核酸也可以用于追蹤本發(fā)明的細胞壁、尤其棉纖維。
[0103]另外本文還披露了由本文所披露的纖維制成的紗線和紡織物以及包含本文所披露的棉籽油或由其制成的食品和飼料。`還披露了獲得棉籽油的方法，該方法包括從本文所披露的棉花植物收獲棉籽并從所述種子提取所述油。另外，還披露了產(chǎn)生棉纖維的方法，該方法包括培育所披露的棉花植物并且從所述棉花植物收獲棉花。
[0104]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括(a)提供本文所述的嵌合基因或本文所述的載體；以及(b)將所述嵌合基因或載體導(dǎo)入植物中。
[0105]多種方法可用于將DNA通過轉(zhuǎn)化或基因摻入引入植物細胞或植物中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化已經(jīng)例如在美國專利5，004, 863或美國專利6，483，013和W02000/71733中描述。
[0106]植物也可以通過粒子轟擊法轉(zhuǎn)化:將金或鎢粒子用DNA包衣并且隨后射向幼齡植物細胞或植物胚。這種方法也允許轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。例如在W092/15675中報道了通過粒子轟擊法轉(zhuǎn)化棉花。
[0107]根椐病毒基因組的性質(zhì)，病毒轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo))法可以用于基因的瞬時或穩(wěn)定表達。將所希望的遺傳物質(zhì)包裝成適合的植物病毒并且允許修飾的病毒感染植物。感染植物的子代不含病毒并且也不含插入的基因。用于病毒轉(zhuǎn)化的合適方法例如在W090/12107、W003/052108或W02005/098004中描述或進一步詳述。
[0108]“基因滲入”意指通過天然手段，即通過將包含本文所述的嵌合基因的植物與不包含所述嵌合基因的植物雜交，將基因整合于植物基因組內(nèi)。可以選擇包含嵌合基因的后代。[0109]其他轉(zhuǎn)化和基因滲入操作方案還可以在美國專利7，172，881中找到。
[0110]在又一個方面，本申請披露了一種培育棉花的方法，該方法包括(al)提供本文所述或通過本文所述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物；或(a2)將本文所述的嵌合基因或本文所述的載體導(dǎo)入植物中；(b)培育(al)或(a2)的植物；以及(C)收獲由所述植物產(chǎn)生的棉花。
[0111]“培育”涉及為植物創(chuàng)造生長、繁殖和/或成熟的環(huán)境。特定植物的合適培育條件是本領(lǐng)域熟知的。
[0112]在另一方面,本申請披露了一種產(chǎn)生包含本文所披露的嵌合基因的種子的方法，該方法包括(a)培育包含本文所述的嵌合基因或本文所述的載體的轉(zhuǎn)基因植物、本文所述的轉(zhuǎn)基因植物或者通過本文所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生所述種子并且所述嵌合基因包含于所述種子中，并且(b)從所述轉(zhuǎn)基因植物中分離所述種子。
[0113]在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法或產(chǎn)生種子的方法的一個實例中，該植物是如本申請中其他地方所描述的棉花植物。
[0114]在另一方面，本申請披露一種在棉花中實現(xiàn)產(chǎn)物的種子特異性表達的方法，該方法包括將本文所披露的嵌合基因或本文所披露的載體導(dǎo)入棉花植物的基因組；或提供本文所披露的轉(zhuǎn)基因植物。在一個實例中，種子特異性表達可以是種衣特異性表達、毛狀體特異性表達或纖維特異性表達。
[0115]在又一方面，本申請披露一種改變棉花植物中纖維特性的方法，該方法包括將本文所披露的嵌合基因或本文所披露的載體導(dǎo)入棉花植物的基因組；或提供本文所披露的轉(zhuǎn)基因植物。
[0116]在一個實例中，該方法進一步包括培育所述植物直至種子生成。
.[0117]在另一個實例中，基于上述其他步驟，該方法用于增加來自棉花植物的棉花產(chǎn)量并且進一步包括收獲由所述棉花植物產(chǎn)生的棉花。換句話講，本申請披露一種增加來自棉花植物的棉花產(chǎn)量的方法，該方法包括將本文所披露的嵌合基因或本文所披露的載體導(dǎo)入棉花植物的基因組；或提供本文所披露的轉(zhuǎn)基因植物；并且收獲由所述棉花植物產(chǎn)生的棉花。
[0118]與本申請相聯(lián)系的術(shù)語“增加產(chǎn)量”涉及棉纖維產(chǎn)出的增加，這可以例如通過增加棉籽上產(chǎn)生的纖維的數(shù)目、纖維長度或纖維強度來實現(xiàn)。上文已經(jīng)描述了參與賦予這些特性的基因及其表達產(chǎn)物。
[0119]在另一方面，本申請披露了本文所披露的嵌合基因、本文所披露的載體或本文所披露的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞的用途，用于一種產(chǎn)物在棉中的種子特異性表達、用于改變棉花中的纖維特性或用于增加棉花產(chǎn)量。上文就本文所披露的其他方面所描述的定義和其他實例等同等地適用于這個方面。
[0120]除了上文描述的嵌合基因之外，本文所披露的或通過本文所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的棉花植物細胞和棉花植物可以含有至少一個包含編碼感興趣表達產(chǎn)物的核酸的其他嵌合基因。這類表達產(chǎn)物的實例包括RNA分子或蛋白質(zhì)，如例如針對除草劑抗性的酶。
[0121 ] 其他感興趣表達產(chǎn)物向棉花植物賦予昆蟲抵抗力，即針對某些靶昆蟲侵襲的抵抗力，或非生物脅迫耐受性。
[0122]本文所述的轉(zhuǎn)化植物細胞和植物，如通過本文所述方法獲得的那些，還可以用于本領(lǐng)域熟知的育種程序中，如雜交、自交和回交。育種程序可以涉及雜交以產(chǎn)生Fl代(第一子代)，隨后是幾個自交世代(產(chǎn)生F2、F3等)。該育種程序也可以涉及回交(BC)步驟，因而該后代與親本系之一(稱作回歸親本)回交。
[0123]因此，本文還披露了一種用于產(chǎn)生包含本文所披露的嵌合基因的植物的方法，該方法包括以下步驟:將本文所披露的棉花植物與另一個植物或與本身雜交并選擇包含所述嵌合基因的后代。
[0124]通過本文所披露的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物細胞和植物也可以進一步用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化程序中，例如用來引入其他嵌合基因。
[0125]這些圖顯示:
[0126]圖1:瓊脂糖凝膠顯示擴增4種MADS基因的DNA序列的PCR反應(yīng)的結(jié)果。
[0127]圖2:反向PCR方法的方案。
[0128]圖3:收回MADS6啟動子(PMADS6)的克隆步驟，如實例I中所述。3a/3b基因組序列收回和反向PCR方案的概述；3c.從反向PCR收回的片段；3d至f:產(chǎn)生包含完整MADS6啟動子的載體?？s寫:bla:氨芐青霉素抗性基因；0RI ColEl:來自pMBl的質(zhì)粒復(fù)制起點；IacZ:編碼來自大腸桿菌(Escherichia coli)的β _半乳糖苷酶α肽的編碼序列；MCS:多克隆位點；5’ UTR:5’非翻譯區(qū)；Plac:大腸桿菌Iac操縱子的啟動子；Pmads6:MADS6啟動子；Phis:包含擬南芥組蛋白H4基因的啟動子區(qū)和擬南芥組蛋白H3.1II變體的基因II的第一內(nèi)含子的序列；2m·epsps:編碼玉蜀黍(玉米)雙突變5-烯醇式-丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的序列(Lebrun等人，1997);TPotp C:優(yōu)化的轉(zhuǎn)運肽的編碼序列,其含有玉蜀黍(玉米)和向日葵(向日_的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(RuBisCO)小亞基基因的序列；aadA:鏈霉素和壯觀霉素抗性；大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn7的氨基糖甙腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列(aadA) (Fling 等人，1985);bar:吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)勝絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列(=bialaphos抗性基因)(Thompson等人，1987);3’ nos:來自ΡΤ?Τ37的T-DNA的胭脂堿合酶基因3’非翻譯末端并且包含植物多聚腺苷化信號的片段；ori pVSl:來自pVSl的用于農(nóng)桿菌中維持穩(wěn)定的質(zhì)粒復(fù)制起點；P35S3:來自花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄物的啟動子區(qū)的片段；GUS:大腸桿菌β -葡糖醛酸糖苷酶基因的編碼序列，包含馬鈴薯(馬鈴薯)ST-LSl基因的第二內(nèi)含子。
[0129]圖4:制備包含推定性MADS6啟動子、⑶S編碼序列和bar選擇標記的棉花轉(zhuǎn)化載體PTTS108。
[0130]圖5:6dap時用PMADS6控制的⑶S報道基因(圖5a)和PFBP7控制的⑶S報道基因(圖5b)轉(zhuǎn)化的胚珠。圓圈指示胚珠上存在的對應(yīng)于⑶S表達的藍點。
[0131]這些實例說明本發(fā)明。
[0132]材料
[0133]除非另外說明，實例中的化學(xué)品和試劑從西格瑪化學(xué)公司(Sigma ChemicalCompany)獲得，限制性核酸內(nèi)切酶來自Fermentas公司或Roche-Boehringer公司，關(guān)于生物化學(xué)和分子生物測定法的其他修飾酶或試劑盒來自凱杰公司(Qiagen)、英杰公司(Invitrogen)和Q-BIOgene公司。細菌菌株來自英杰公司。所實施的克隆步驟例如限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、純化DNA片段、連接DNA片段、轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞、培育細菌、增殖噬菌體和重組DNA的序列分析，如Sambrook (1989)所述實施。使用ABI激光熒光DNA序列儀，按照Sanger方法實施重組DNA分子的測序。[0134]實例1:棉花中MADS6啟動子的追蹤
[0135]已知碧冬茄FBP7啟動子毛狀體特異性表達。在本發(fā)明的過程中，在棉花中鑒定到具有相似特性的啟動子。
[0136]在TrEMBL數(shù)據(jù)庫中采用受FBP7啟動子控制的FBP7蛋白的序列實施BLAST檢索以鑒定棉花中的潛在同源物。
[0137]該檢索找到陸地棉中的兩個命中，二者均是MADS-框蛋白，稱作GhMADS6和GhMADS70
[0138]在植物中，MADS-框基因編碼具有至少100個成員的一個龐大轉(zhuǎn)錄因子家族(綜述見 DeBodt 等人，2003 ；Kofuji 等人，2003 ；Parenicova 等人，2003 ；Nam 等人，2004)。
[0139]除另外兩者GhMADS4 和 GhMADS5 之外，GhMADS6 和 GhMADS7 已經(jīng)由 Lightfoot 等人，(2007)發(fā)現(xiàn)是FBP7的同源物。這個研究組證明MADS5和MADS6在胚珠、花和纖維組織中高度表達。此外，兩種蛋白質(zhì)均在早期纖維發(fā)育(O至6DPA)時表達。在葉和莖中未檢測到表達。MADS5顯示在根中低表達。
[0140]為了找到對纖維特異的啟動子，選擇編碼MADS6的基因用于進一步研究。
[0141]blastn檢索用來鑒定編碼MADS6蛋白的DNA。檢索到的信息揭示出一個具有1040堿基對的cDNA片段。然而，在基因組數(shù)據(jù)庫中對這段序列的檢索沒有產(chǎn)生任何信息。因而，不能確定MADS6編碼序列5’的核苷酸序列。
[0142]在這種情況下，鑒定的MADS基因表現(xiàn)出非常高的序列同一性水平。這使得追蹤特定MADS基因(在這種情況下是MADS6基因)成為一項困難任務(wù)。對于基于反向PCR的方案，需要找到對選擇的MADS基因特異的引物，考慮到該家族成員間的高度序列同一性，這是相
當(dāng)費事的。
[0143]使用以下引物，通過PCR追蹤基因序列。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸序列，包含選自以下的核苷酸序列 (a)SEQ ID NO:1或其片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:1的至少400個連續(xù)核苷酸并且具有種子特異性啟動子活性； (b)與(a)的核酸序列具有至少80%序列同一性并具有種子特異性啟動子活性的核苷酸序列； (C)在嚴格條件下與(a)或(b)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；以及 (d)與(a)至(C)中任一項的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述種子特異性啟動子活性是在棉花中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸，其中所述種子特異性啟動子活性是毛狀體特異性的。
4.一種嵌合基因，包含根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的與編碼感興趣表達產(chǎn)物的核酸序列可操作地連接的核酸以及任選地轉(zhuǎn)錄終止序列及多聚腺苷化序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合基因，其中所述感興趣表達產(chǎn)物是能夠調(diào)節(jié)相對所述植物為內(nèi)源的基因的表達的蛋白質(zhì)或RNA分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的嵌合基因,其中所述表達產(chǎn)物是一種報道基因或一種纖維特異性基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的嵌合基因，其中所述RNA分子包含第一和第二RNA區(qū)域，其中 1.所述第一RNA區(qū)域包含與所述內(nèi)源基因的核苷酸序列具有至少約94%序列同一性的至少19個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列； 2.所述第二RNA區(qū)域包含與所述第一 RNA區(qū)域的所述19個連續(xù)核苷酸互補的核苷酸序列；并且 3.所述第一和第二RNA區(qū)域能夠堿基配對以便在所述第一區(qū)域和第二區(qū)域的所述至少19個連續(xù)核苷酸之間形成雙鏈RNA分子。
8.一種載體，包含根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因。
9.一種轉(zhuǎn)基因植物細胞，包含根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其是棉花植物細胞。
11.一種轉(zhuǎn)基因植物，包含穩(wěn)定整合在其基因組中的根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體或者由根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的轉(zhuǎn)基因棉花植物細胞組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)基因植物，其是棉花植物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其是陸地棉、海島棉、樹棉或草棉。
14.一種從根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中該種子包含根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因。
15.棉纖維，從根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的轉(zhuǎn)基因植物可獲得。
16.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括 (a)提供根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體；并且(b)在植物中導(dǎo)入所述嵌合基因或載體。
17.一種培育棉花的方法，該方法包括 (al)提供根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項所述或通過根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物；或 (a2)在植物中導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體； (b)培育(al)或(a2)的植物；并且 (C)收獲由所述植物產(chǎn)生的棉花。
18.—種產(chǎn)生包含根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因的種子的方法，該方法包括 (a)培育包含根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體的轉(zhuǎn)基因植物、根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物或由權(quán)利要求16所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生所述種子并且所述嵌合基因包含于所述種子中，并且 (b)從所述轉(zhuǎn)基因植物分離所述種子。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或18所述的方法，其中所述植物是棉花植物。
20.一種在棉花中實現(xiàn)產(chǎn)物的種子特異性表達的方法，該方法包括 將根據(jù)權(quán)利要求4至7中 任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體導(dǎo)入棉花植物的基因組中；或 提供根據(jù)權(quán)利要求11至13所述的轉(zhuǎn)基因植物。
21.一種改變棉花植物中纖維特性的方法，該方法包括 將根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體導(dǎo)入棉花植物的基因組中；或 提供根據(jù)權(quán)利要求11至13所述的轉(zhuǎn)基因植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，進一步包括培育所述植物直至種子生成。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，該方法用于增加來自棉花植物的棉花產(chǎn)量并且進一步包括收獲由所述棉花植物產(chǎn)生的棉花。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項所述的方法，其中所述纖維特性是纖維長度、纖維強度、纖維細胞壁的電荷、可染性、棉短絨含量、纖維成熟度比率、不成熟纖維含量、纖維整齊度和馬克隆尼值。
25.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的嵌合基因、根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求11或13所述的轉(zhuǎn)基因植物的用途，用于一種產(chǎn)物在棉花中的種子特異性表達、用于改變棉花中的纖維特性或用于增加棉花產(chǎn)量。
【文檔編號】A01H5/00GK103443280SQ201280014422
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月7日
【發(fā)明者】M-T·謝里尼克, F·莫伊勒韋特, J·雅各布斯 申請人:拜爾作物科學(xué)公司