專利名稱：一種紅葉石楠體細(xì)胞⁶⁰Co r射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物福射誘變處理技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種紅葉石楠體細(xì)胞6ciCo r射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理的方法。
背景技術(shù)：
紅葉石楠(Photiniafraser)是從光葉石楠(P. glabra)和石楠(P. serrulata)的雜交種中選育的新品種，屬薔薇科石楠屬常綠小喬木，具有生長迅速，耐修剪，株形緊湊，萌芽力強(qiáng)，適用范圍廣等特點(diǎn)，是優(yōu)良的彩葉觀賞樹種。自上世紀(jì)九十年代引入我國以來，就被列為具有較高開發(fā)價(jià)值的園林樹種。在我國南方廣泛種植，然而耐寒品種的缺乏成為制約我國北方地區(qū)園林綠化的栽植。因此，培育耐寒優(yōu)良紅葉石楠品系成為一個(gè)十分突出的生產(chǎn)實(shí)際問題。在林木上傳統(tǒng)雜交育種是個(gè)非常漫長的過程，目前，國內(nèi)對紅葉石楠的研究主要集中在組織培養(yǎng)及工廠化育苗成套技術(shù)、扦插繁殖育苗技術(shù)、引種適應(yīng)性和園林應(yīng)用等方面(楊靜，2008 ;畢麗華，2011 ;方敏彥，2012 ;)。而國外，則主要集中在對不同品種生理特點(diǎn)和栽培繁殖技術(shù)的研究(Haynes，1991 ;Tokatli，2011)。經(jīng)檢索有關(guān)紅葉石楠體細(xì)胞6°Cor射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理技術(shù)的研究未見有成功的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種紅葉石楠體細(xì)胞6tlCo r射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理的方法。本發(fā)明所述紅葉石楠體細(xì)胞6tlCo r射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理的方法，是將紅葉石楠胚性愈傷組織先用6tlCo r射線輻射處理，然后再置于愈傷組織分化培養(yǎng)基上低溫處理，其后暗培養(yǎng)，最后繼代到培養(yǎng)基中繼續(xù)培育至長出紅葉石楠組培苗即可移栽至大田種植；其特征在于所述紅葉石楠胚性愈傷組織是指在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)獲得的紅葉石楠胚性愈傷組織；所述6tlCo r射線輻射處理的方法是用6tlCo r射線輻射處理紅葉石楠胚性愈傷組織1-2小時(shí)，輻照劑量為15 45Gy ；所述低溫處理的方法是將輻射后的紅葉石楠材料轉(zhuǎn)入愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在人工氣候箱下暗培，溫度為5±2°C，處理5-10d，之后再置于溫度為25±2°C條件下暗培養(yǎng) 20-25d ；所述紅葉石楠組培苗的培育方法是將暗培養(yǎng)后的紅葉石楠材料轉(zhuǎn)移到組培室光照條件下培養(yǎng)，溫度為25±2°C，光照為1500LX-1800LX，光照時(shí)間為14_16h/d，15±2d后分化產(chǎn)生綠芽，綠芽先轉(zhuǎn)到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20±2d，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培育，直至得到完整紅葉石楠組培苗；其中上述愈傷組織增殖培養(yǎng)基組成為改良MS+2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0. Img/L+6-節(jié)基氨基嘌呤(BA) 0. 5mg/L+ 萘乙酸(NAA) 20. Omg/L+phytagel 3. Og/L+ 鹿糖 20g/L ；上述愈傷組織分化培養(yǎng)基組成為改良MS+6-芐基氨基嘌呤(BA) 2. Omg/L+phytagel3. 5g/L+ 鹿糖 20g/L ；上述生根培養(yǎng)基組成為1/2MS+吲哚丁酸(IBA) 0. 2mg/L ；上述各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前，調(diào)整pH值至5. 8。上述述的紅葉石楠體細(xì)胞6tlCo r射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理方法中所述6tlCor射線輻射處理的輻照劑量優(yōu)選設(shè)置為30Gy，處理時(shí)間優(yōu)選設(shè)置為90分鐘。上述述的紅葉石楠體細(xì)胞6tlCo r射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理方法中所述低溫處理的溫度優(yōu)選為5°C，處理時(shí)間優(yōu)選為7d。本發(fā)明以紅葉石楠的胚性愈傷組織為材料，以6tlCor射線為輻射源，研究了不同劑量的6tlCo r射線結(jié)合低溫處理對愈傷組織生長、分化和植株再生的影響，運(yùn)用離體培養(yǎng)方法從突變細(xì)胞再生出完整植株，建立紅葉石楠體細(xì)胞6tlCor射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理方法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果I、本發(fā)明選用胚性愈傷組織輻射誘變與低溫定向篩選，得到的抗寒愈傷組織的分化再生是本技術(shù)的最終目標(biāo)，因?yàn)橹挥锌购t葉石楠植株，才可能成為北方寒冷地區(qū)的生產(chǎn)品種，從而拓寬了紅葉石楠種質(zhì)資源，為最終實(shí)現(xiàn)紅葉石楠抗寒育種打下基礎(chǔ)。2、本發(fā)明在充分利用6tlCor射線核輻射對紅葉石楠基因組改變的基礎(chǔ)上，采取復(fù)合誘變低溫處理技術(shù)，大大提高定向變異率，克服輻射育種中有利變異少的缺點(diǎn)。3、本發(fā)明采用了誘變低溫復(fù)合處理技術(shù)，其中采用輻照劑量為30Gy的6tlCo r射線處理90分鐘，5°C低溫處理7d，愈傷組織綠芽分化率高達(dá)65%。


圖I、對照分化綠芽。圖2、30Gy劑量輻射和低溫處理7d分化綠芽。圖3、30Gy劑量輻射和低溫處理7d再生植株移栽苗。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，葉片沿主脈切成左右2半，在葉片上輕劃I刀，葉背朝下緊貼培養(yǎng)基放置，接種在改良MS+2, 4-DO. lmg/L+BAO. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. Og/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，PH值5. 8，暗培養(yǎng)10d，誘導(dǎo)體胚性愈傷組織為輻射材料。用輻射劑量為45Gy的6ciCor射線對上述輻射材料輻射處理60分鐘，將輻射后的材料，轉(zhuǎn)入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基上，pH值5. 8，在溫度為4°C低溫條件下暗培養(yǎng)5d，之后在溫度為25±2°C條件下繼續(xù)暗培養(yǎng)25d，中間繼代一次。將上述培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)移到溫度為25°C，光照為1500LX，光照時(shí)間為16h/d組培室條件下培養(yǎng)，約15d分化產(chǎn)生綠芽，綠芽轉(zhuǎn)入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/Lphytagel+20g/L蔗糖愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d。將上述生長發(fā)育健壯的叢芽長到4cm切成單株轉(zhuǎn)接到1/2MS+IBA 0. 2mg/L生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20d形成具有根、莖、葉的完整再生植株，即可煉苗移栽。通過本發(fā)明方法獲得的愈傷組織綠芽分化率為43%。實(shí)施例2以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，葉片沿主脈切成左右2半，在葉片上輕劃I刀，葉背朝下緊貼培養(yǎng)基放置，接種在改良MS+2, 4-DO. lmg/L+BAO. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. Og/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈傷組織增 殖培養(yǎng)基上，pH值5. 8，暗培養(yǎng)10d，誘導(dǎo)體胚性愈傷組織為輻射材料。用輻射劑量為30Gy的6tlCor射線對輻射材料輻射處理90分鐘，將輻射后的材料，轉(zhuǎn)入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基上，pH值5. 8，在溫度為5°C低溫條件下暗培養(yǎng)7d，之后在溫度為25°C條件下繼續(xù)暗培養(yǎng)25d，中間繼代一次。將上述培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)移到溫度為26°C，光照為1800LX，光照時(shí)間為16h/d組培室條件下培養(yǎng)，約15d分化產(chǎn)生綠芽，綠芽轉(zhuǎn)入改良MS+2. 0mg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d。將上述生長發(fā)育健壯的叢芽長到4cm切成單株轉(zhuǎn)接到1/2MS+IBA 0. 2mg/L生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15d形成具有根、莖、葉的完整再生植株，即可煉苗移栽。通過本發(fā)明方法獲得的愈傷組織綠芽分化率為65%。實(shí)施例3以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，葉片沿主脈切成左右2半，在葉片上輕劃I刀，葉背朝下緊貼培養(yǎng)基放置，接種在改良MS+2, 4-DO. lmg/L+BA0. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. 0g/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，pH值5. 8，暗培養(yǎng)10d，誘導(dǎo)體胚性愈傷組織為輻射材料。用輻射劑量為15Gy的6ciCor射線對輻射材料輻射處理120分鐘，將輻射后的材料，轉(zhuǎn)入改良MS+2. 0mg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基上，pH值5. 8，在溫度為6°C低溫條件下暗培養(yǎng)5d，之后在溫度為25°C條件下繼續(xù)暗培養(yǎng)25d，中間繼代一次。將上述培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)移到溫度為27°C，光照為2000LX，光照時(shí)間為14h/d組培室條件下培養(yǎng)，約15d分化產(chǎn)生綠芽，綠芽轉(zhuǎn)入改良MS+2. 0mg/L BA+3. 5g/Lphytagel+20g/L蔗糖愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d。將上述生長發(fā)育健壯的叢芽長到4cm切成單株轉(zhuǎn)接到1/2MS+IBA 0. 2mg/L生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20d形成具有根、莖、葉的完整再生植株，即可煉苗移栽。通過本發(fā)明方法獲得的愈傷組織綠芽分化率為57%。本發(fā)明所述改良MS培養(yǎng)基成分為
權(quán)利要求
1.一種紅葉石楠體細(xì)胞6ciCo !■射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理的方法，是將紅葉石楠胚性愈傷組織先用6tlC0 !■射線輻射處理，然后再置于愈傷組織分化培養(yǎng)基上低溫處理，其后暗培養(yǎng)，最后繼代到培養(yǎng)基中繼續(xù)培育至長出紅葉石楠組培苗即可移栽至大田種植；其特征在于所述紅葉石楠胚性愈傷組織是指在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)獲得的紅葉石楠胚性愈傷組織；所述6tlCo r射線輻射處理的方法是用6tlCo !■射線輻射處理紅葉石楠胚性愈傷組織1-2 小時(shí)，輻照劑量為15 45Gy ;所述低溫處理的方法是將輻射后的紅葉石楠材料轉(zhuǎn)入愈傷組織分化培養(yǎng)基上，在人工氣候箱下暗培，溫度為5±2°C，處理5-10d，之后再置于溫度為25±2°C條件下暗培養(yǎng) 20-25d ；所述紅葉石楠組培苗的培育方法是將暗培養(yǎng)后的紅葉石楠材料轉(zhuǎn)移到組培室光照條件下培養(yǎng)，溫度為25±2°C，光照為1500LX-1800LX，光照時(shí)間為14_16h/d，15±2d后分化產(chǎn)生綠芽，綠芽先轉(zhuǎn)到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20±2d，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培育，直至得到完整紅葉石楠組培苗；其中上述愈傷組織增殖培養(yǎng)基組成為改良MS+2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) O. lmg/L+6-芐基氨基嘌呤(BA) O. 5mg/L+ 萘乙酸(NAA) 20. Omg/L+phytagel 3. Og/L+ 鹿糖 20g/L ；上述愈傷組織分化培養(yǎng)基組成為改良MS+6-芐基氨基嘌呤(BA) 2. Omg/ L+phytagel3. 5g/L+ 鹿糖 20g/L ；上述生根培養(yǎng)基組成為1/2MS+吲哚丁酸(IBA) O. 2mg/L ；上述各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前，調(diào)整PH值至5. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅葉石楠體細(xì)胞6tlCo!■射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理方法， 其特征在于所述6tlCo r射線輻射處理的輻照劑量設(shè)置為30Gy，處理時(shí)間設(shè)置為90分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅葉石楠體細(xì)胞6tlCo!■射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理方法， 其特征在于所述低溫處理的溫度為5°C，處理時(shí)間為7d。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅葉石楠體細(xì)胞60Co r射線輻射誘變和低溫復(fù)合處理方法，是將紅葉石楠胚性愈傷組織先用60Co r射線輻射處理，然后再置于愈傷組織分化培養(yǎng)基上低溫處理，其后暗培養(yǎng)，最后繼代到培養(yǎng)基中繼續(xù)培育至長出紅葉石楠組培苗即可移栽至大田種植。本發(fā)明建立的方法分化率高達(dá)65%，為紅葉石楠新品種開發(fā)、優(yōu)質(zhì)品種的選育奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A01H1/06GK102972287SQ20121049886
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者梁慧敏, 夏陽, 燕麗萍, 劉翠蘭, 方敏彥 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 山東省林業(yè)科學(xué)研究院