一株地衣芽孢桿菌及其菌劑的生產(chǎn)方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株防治植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的地衣芽孢桿菌，及其菌劑的低成本生產(chǎn)方法，屬于微生物農(nóng)藥和微生物肥料【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用的菌株是從水草根際土壤中分離篩選出來(lái)的一株高效植物促生菌——地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）B4菌株，該菌株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC?No.6677。本發(fā)明利用甘薯淀粉廢水作為發(fā)酵培養(yǎng)基，大規(guī)模培養(yǎng)地衣芽孢桿菌，制備具有防治植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的菌劑，該工藝生產(chǎn)成本低廉，操作簡(jiǎn)單，還可以使甘薯淀粉廢水得到資源化利用，減少污染排放。本發(fā)明生產(chǎn)的菌劑用于茶葉和蔬菜的生產(chǎn)，不僅可以提高產(chǎn)量，而且可以改善茶園和蔬菜的品質(zhì)，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一株地衣芽孢桿菌及其菌劑的生產(chǎn)方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株拮抗植物病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的地衣芽孢桿菌，及其低成本生產(chǎn)方法，屬于微生物農(nóng)藥和微生物肥料【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]地衣芽孢桿菌{Bacillus 7icAe/?i/br?i5.)在自然界中分布廣泛,是一種重要的生防菌，它通過(guò)產(chǎn)生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物質(zhì)來(lái)抑制植物病原細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲，從而起到生物防治的作用；同時(shí)它也是一類重要的植物根際促生細(xì)菌，表現(xiàn)出對(duì)多種植物促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。例如，中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?200310115535.5)中公開了一株地衣芽孢桿菌B-0A12菌株，保藏編號(hào)為CGMCC N0.1035，用于防治大豆胞囊線蟲病和鐮刀菌引起的根腐病，該菌株發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中使用的培養(yǎng)基為:可溶性淀粉1_2%，豆餅粉1-2%，牛肉膏0.5-1.0%，葡萄糖0.1-0.5%，還有少量無(wú)機(jī)鹽，發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)菌含量為7 X IO8個(gè)/毫升。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?200810026137.9)中公開了一株植物內(nèi)生地衣芽孢桿菌R21菌株，保藏編號(hào)為CCTCC M 207113，具有廣譜拮抗植物病原真菌能力、解磷能力和促進(jìn)植物生長(zhǎng)能力，其發(fā)酵采用了 LB培養(yǎng)基，并公開了其防治西芹黃萎病、香蕉枯萎病，以及促進(jìn)西芹生長(zhǎng)方面的應(yīng)用。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?200810183072.9)中公開了一株地衣芽孢桿菌201菌株，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M207092，該菌株對(duì)香蕉枯萎病、西瓜枯萎病、番茄枯萎病、香蕉炭疽病、小麥赤霉病等多種病原真菌具有拮抗作用，該菌株的培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?200810183075.2)中公開了一株地衣芽孢桿菌202菌株，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M207093，它也具有與201菌株類似的生防功能。
[0003]地衣芽孢桿菌在工業(yè)上的應(yīng)用也比較廣泛。例如，中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?200810227858.6)中公開了一株地衣芽孢桿菌U1-3菌株，保藏編號(hào)為CGMCC N0.2437，該菌株在采油工程領(lǐng)域中可以用來(lái)驅(qū)油，提高石油采收率，其培養(yǎng)基采用了液體石蠟、酵母粉和多種無(wú)機(jī)鹽。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?200810055068.4)中公開了一株地衣芽孢桿菌WX-02菌株，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M208065，用于生產(chǎn)聚Y -谷氨酸，其培養(yǎng)基采用了谷氨酸鈉，碳源(淀粉或淀粉水解液、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖中的一種)，無(wú)機(jī)氮源和其他多種無(wú)機(jī)鹽。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?200810026812.8)中公開了一株地衣芽孢桿菌HM_3菌株，保藏編號(hào)為CGMCC N0.1970，用于生產(chǎn)堿性蛋白酶，培養(yǎng)基采用了酵母膏、蛋白胨和城市污泥。中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?200610053548.8)中公開了一株地衣芽孢桿菌B-05571菌株，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M206082，用于將甘油轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮，培養(yǎng)基以甘油為主要碳源，還有酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、多種無(wú)機(jī)鹽。
[0004]綜上所述，具有拮抗植物病害的地衣芽孢桿菌的菌株較多，其培養(yǎng)方法也各不相同，但是，未見用于茶葉生產(chǎn)的菌株，也未見采用甘薯淀粉廢水培養(yǎng)地衣芽孢桿菌的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一株高效拮抗植物病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的地衣芽孢桿菌，并提供一種能夠資源化利用甘薯淀粉廢水生產(chǎn)地衣芽孢桿菌微生物菌劑的方法，以及菌劑在茶葉和蔬菜生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明所使用的菌株是由發(fā)明人從水草根際土壤中分離篩選出來(lái)的一株高效促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗植物病原菌的地衣芽孢桿菌(MaciIIus licheniformis) B4菌株,該菌株于2012年10月15日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.6677，保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵
編:100101ο
[0007]本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌微生物菌劑的生產(chǎn)方法如下:
1、甘薯淀粉廢水預(yù)處理:用氫氧化鈉水溶液或石灰水調(diào)節(jié)廢水的PH到6.5~7.8，于110~126°C滅菌10~35分鐘。
[0008]2、液體種子制備:向裝有預(yù)處理好的甘薯淀粉廢水的三角瓶中接種斜面保藏的地衣芽孢桿菌，于25~37°C，120~200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24~36小時(shí)，得到液體種子。
[0009]3、液態(tài)發(fā)酵:向裝有預(yù)處理好的甘薯淀粉廢水發(fā)酵罐中接種體積比為2%~15%的液體種子，于25~37°C，通無(wú)菌空氣培養(yǎng)15~36小時(shí)；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計(jì)數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到1.5X109 CFU/毫升以上，所得發(fā)酵液可以作為液體菌劑直接使用。
[0010]4、固體菌劑制備:以過(guò)30目篩的生物碳(生物質(zhì)熱解后剩余的固體物質(zhì)，主要成分是碳)為載體，按照發(fā)酵液:生物碳為1:1~1: 5的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得 到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處，備用。
[0011]本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌微生物菌劑的使用方法如下:
1、將發(fā)酵液或固體菌劑用灌溉用水稀釋到活菌數(shù)為2XIO6 CFU/毫升~5X IO7 CFU/毫升，混合均勻，按照每畝I~3立方米稀釋液的用量溝施入作物根部附近的土壤中；
2、將發(fā)酵液或固體菌劑加入有機(jī)肥中，混合均勻，使有機(jī)肥中的地衣芽孢桿菌活菌數(shù)為2X106 CFU/克~IXlO8 CFU/克，按照每畝I~3噸的用量作為基肥施入土壤中。
[0012]【具體實(shí)施方式】:
由本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌能夠促進(jìn)作物對(duì)養(yǎng)分的吸收和利用，并且能有效防治多種真菌類植物病害，本發(fā)明提供的技術(shù)方案生產(chǎn)的微生物菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可以減少化肥和農(nóng)藥的使用量，從而改善農(nóng)田環(huán)境質(zhì)量；而且生產(chǎn)成本很低，使高濃度廢水得到資源化利用，減少污染物排放?！揪唧w實(shí)施方式】如下:
實(shí)施例1:甘薯淀粉廢水生產(chǎn)地衣芽孢桿菌微生物菌劑
甘薯淀粉廢水預(yù)處理:用石灰水調(diào)節(jié)廢水PH到7.5，于110°C滅菌15分鐘。
[0013]液體種子制備:向裝有預(yù)處理好的甘薯淀粉廢水的三角瓶中接種斜面保藏的地衣芽孢桿菌，于32°C，150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)26小時(shí)，得到液體種子。
[0014]液態(tài)發(fā)酵:向裝有預(yù)處理好的甘薯淀粉廢水發(fā)酵罐中接種5% (體積比)的液體種子，于32°C，通無(wú)菌空氣培養(yǎng)20小時(shí)；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計(jì)數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到3.5 X IO9 CFU/ 毫升。
[0015]菌劑制備:以過(guò)30目篩的生物碳為載體，按照發(fā)酵液:生物碳為1: 2的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量25%以下，包裝，存放在陰涼干燥處。[0016]實(shí)施例2:地衣芽孢桿菌微生物菌劑應(yīng)用于有機(jī)茶生產(chǎn)
在有機(jī)茶園選擇茶樹長(zhǎng)勢(shì)均勻的試驗(yàn)地2畝左右，實(shí)驗(yàn)茶樹與基地其他茶樹管理保持一直，只是施肥有所不同。試驗(yàn)地劃分為5塊，分別對(duì)應(yīng)5個(gè)處理，每個(gè)處理之間都設(shè)有2米左右的隔離行，將菌劑用自來(lái)水稀釋或直接將發(fā)酵液稀釋使用，5個(gè)處理分別為清水對(duì)照(CK)、淀粉廢水對(duì)照(FCK)、高濃度(2.0XlO7 CFU/毫升)溝施(H)、中濃度(1.5X IO7 CFU/毫升)溝施(M)、低濃度(1.0X IO7 CFU/毫升)溝施(L)，按照每平方米3升的菌劑稀釋液的量使用。各處理以相同的方式在冬季施用兩次菌劑，春季采收茶葉，結(jié)果表明:施用廢水稀釋液的對(duì)照春茶產(chǎn)量與清水對(duì)照無(wú)顯著差異，而使用菌劑的春茶產(chǎn)量顯著增加，其中，施用中濃度和高濃度菌劑的春茶產(chǎn)量相當(dāng)，都比清水對(duì)照增產(chǎn)60%以上，施用低濃度菌劑的春茶產(chǎn)量也比清水對(duì)照增產(chǎn)30%左右。而且施用菌劑的茶葉中氨基酸含量顯著高于清水對(duì)照。
[0017]實(shí)施例3:地衣芽孢桿菌微生物菌劑用于防止黃瓜猝倒病
黃瓜猝倒病是由真菌侵染引起的病害。采集多年種植黃瓜的溫室大棚中的土壤，混合均勻，裝入花盆中，設(shè)置2組花盆，每組10盆，至于15°C~20°C的溫室中，保持較高濕度和較低的光照強(qiáng)度。第I組花盆直接播種黃瓜種子，每盆15粒，作為對(duì)照。第2組播種黃瓜種子前向土壤中拌入重量比為0.3%的地衣芽孢桿菌微生物菌劑，然后每盆播種15粒種子。幼苗出土后統(tǒng)計(jì)總數(shù)，幼苗長(zhǎng)出I片真葉后，2片真葉前統(tǒng)計(jì)倒伏苗總數(shù)。結(jié)果表明，對(duì)照幼苗倒伏率超過(guò)50%， 而添加菌劑的實(shí)驗(yàn)組，幼苗倒伏率低于10%。
【權(quán)利要求】
1.一株具有防治植物病害和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的地衣芽孢桿MiBacillusHcheniformis),其特征在于:該地衣芽孢桿菌保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào):CGMCC N0.6677。
2.權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌生產(chǎn)微生物菌劑的方法，包括如下步驟: (1)甘薯淀粉廢水預(yù)處理:用氫氧化鈉水溶液或石灰水調(diào)節(jié)廢水的PH到6.5~7.7，于110~126°C滅菌10~35分鐘； (2)液體種子制備:向裝有預(yù)處理好的甘薯淀粉廢水的三角瓶中接種斜面保藏的地衣芽孢桿菌，于25~37°C，120~200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24~36小時(shí)，得到液體種子； (3)液態(tài)發(fā)酵:向裝有預(yù)處理好的甘薯淀粉廢水發(fā)酵罐中接種體積比為2%~15%的液體種子，于25~37°C，通無(wú)菌空氣培養(yǎng)15~36小時(shí)；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計(jì)數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到1.0X109 CFU/毫升以上，所得發(fā)酵液可以作為液體菌劑直接使用； (4)固體菌劑制備:以過(guò)30目篩的生物碳(生物質(zhì)熱解后剩余的固體物質(zhì)，主要成分是碳)為載體，按照發(fā)酵液:生物碳為1:1~1: 5的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處。
3.權(quán)利要求2所述的地衣芽孢桿菌微生物菌劑的使用方法，包括: (1)將發(fā)酵液或固體菌劑用灌溉用水稀釋到活菌數(shù)為2XIO6 CFU/毫升~5X IO7 CFU/毫升，混合均勻，按照每畝I~3立方米稀釋液的用量溝施入作物根部附近的土壤中； (2)將發(fā)酵液或固體菌劑加入有機(jī)肥中，混合均勻，使有機(jī)肥中的地衣芽孢桿菌活菌數(shù)為2 X IO6 CFU/克~I X IO8 CFU/`克，按照每畝I~3噸的用量作為基肥施入土壤中。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK103820349SQ201210463000
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月16日
【發(fā)明者】白志輝, 張茉莉, 陳月月, 趙志瑞, 莊緒亮, 楊建州 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心